陳　娜，徐細明

(武漢大學人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢　430060)

氯化釓對胃癌MGC-803細胞增殖及凋亡的影響

陳娜，徐細明

(武漢大學人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢430060)

摘要：目的觀察氯化釓(Gdcl3)對胃癌細胞株MGC-803增殖及凋亡的影響。方法實驗設對照組、10 μmol·L-1Gdcl3處理組及100 μmol·L-1Gdcl3處理組。不同濃度的Gdcl3對MGC-803處理24 h后，用MTT比色法觀察Gdcl3對細胞活性的影響；用流式細胞術檢測細胞凋亡率；用Caspase活性檢測試劑盒來檢測細胞Caspase3，8，9活性檢測。結果與空白對照組相比，Gdcl3抑制MGC-803增殖，具有統(tǒng)計學意義差異(P<0.05)；Gdcl3促進MGC-803凋亡(P<0.05)；Gdcl3可增強MGC-803細胞Caspase-3，9的活性(P<0.05)，對Caspase-8影響不明顯。結論Gdcl3抑制MGC-803增殖，促進癌細胞凋亡，可能主要通過線粒體途徑來促凋亡。

關鍵詞:胃癌；氯化釓；增殖；凋亡；Caspase-3；Caspase-9

胃癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素進行性發(fā)展的過程。在正常情況下，胃黏膜上皮細胞的增殖和凋亡之間保持動態(tài)平衡。當胃上皮細胞過度增殖又不能啟動凋亡信號時就可能逐漸進展為胃癌。Caspase是一組存在于細胞質中具有類似結構的蛋白酶，與真核細胞凋亡密切相關，并參與細胞的生長、分化與凋亡調節(jié)。

釓是一種稀土金屬元素，在醫(yī)療應用方面可作為核磁共振的顯影劑來提高對一些癌癥轉移成像診斷的檢測水平[1-3]。除此，釓離子可提高臍靜脈內(nèi)皮細胞體外血管形成能力[4]，對糖尿病模型小鼠有降血糖作用[5]，對肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用[6-7]，對肺損傷細胞有保護作用[8]，還可提高成纖維細胞NIH3T3的存活率[9]。釓離子絡合物還可抑制惡性膠質瘤細胞及肝癌細胞的生長[10-11]。尤其是釓離子納米顆粒具有一定的抗腫瘤活性[12-13]。

然后，有關釓離子對胃癌細胞MGC803增殖、凋亡的影響及其機制，還未見報道。我們將采用MTT、流式細胞術及Caspase活性檢測來檢測Gdcl3對胃癌細胞株MGC-803增殖、凋亡的影響及可能機制，探討Gdcl3在MGC-803凋亡中的作用機制。該研究有助于了解Gdcl3的生物學作用，并可能為胃癌的治療提供新思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞人胃癌細胞MGC-803由湖北醫(yī)藥學院實驗中心提供。

1.1.2主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基購自sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；胰蛋白酶購自GibcoBRL;MTT購自武漢華瑞康科技有限公司；Annexin V-FICT/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢華瑞康科技有限公司；Caspase-3,8,9活性檢測試劑盒購自武漢華瑞康科技有限公司；Gdcl3購自sigma公司。

1.1.3主要儀器CO2細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，流式細胞儀(Becton Dickinson,美國)，酶標儀(美國 Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人胃癌細胞MGC803培養(yǎng)在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)條件37℃、5%CO2飽和濕度下，培養(yǎng)液中加有100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素。用0.25%胰酶進行消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2MTT比色法檢測Gdcl3對MGC-803細胞活性的影響細胞分對照組和2個濃度的Gdcl3組，即10 μmol·L-1Gdcl3組和100 μmol·L-1Gdcl3組，培養(yǎng)至24 h時，細胞以5×106·L-1密度接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL細胞培養(yǎng)液，每組6個復孔，每孔加5 g·L-1的MTT溶液15 μL[14]，然后繼續(xù)孵育4 h，吸棄掉培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，輕輕振蕩混勻，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定光吸收值，測定波長為570 nm，并以空白孔調零。

1.2.3流式細胞儀檢測Gdcl3對MGC-803細胞凋亡的影響取對數(shù)生長期的MGC-803細胞，消化成細胞懸液以1×106細胞數(shù)接種于培養(yǎng)瓶中，細胞貼壁后實驗分組：空白對照組、10 μmol·L-1Gdcl3組、100 μmol·L-1Gdcl3組；分別處理24 h后，收集細胞，用PBS清洗2遍，棄上清；用400 uL 1×binding buffer懸浮細胞；加入5 μL的20 μg·L-1Annexin V-FITC，4°C避光孵育15 min；加入10 μL的 25 mg·L-1PI ，4°C避光孵育5 min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4Caspase-3，8，9活性檢測細胞培養(yǎng)同“1.2.1”，不同濃度Gdcl3作用MGC803到24 h后，參照Caspase-3，8，9活性檢測試劑盒步驟操作，最后用酶標儀測定波長為400 nm的吸光值，以此來表示Caspase-3，8，9活性大小。

2結果

2.1細胞活性力變化不同濃度的Gdcl3對MGC-803處理24 h后，10 μmol·L-1Gdcl3對癌細胞的增殖抑制作用不明顯(P=0.909>0.05)，Gdcl3濃度升高至100 μmol·L-1，MGC-803增殖率會明顯被抑制(P=0.000<0.05)(表1，F(xiàn)=28.009，P=0.000)。

表1　人胃癌細胞MGC-803在不同濃度Gdcl3處理24 h

注：與對照組相比,*P<0.05。

2.2細胞凋亡率變化流式細胞結果如圖1(F=171.338，P=0.000)，不同濃度Gdcl3處理組對MGC-803作用24 h后，各組間凋亡率兩兩比較，與正常對照組(6.54±1.04)相比，10 μmol·L-1濃度組(8.07±1.49)沒有顯著差異(P=0.368>0.05)， Gdcl3濃度升高到100 μmol·L-1時，MGC-803凋亡率會顯著增高(P=0.000<0.05)，癌細胞的凋亡率達(33.65±4.59)。

2.3細胞Caspase-3，8，9活性的變化結果如表2所示，兩個濃度Gdcl3組Caspase-3活性均比對照組高，且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而且三個濃度組間兩兩比較，Caspase-3活性也有差異(P<0.05)，提示Gdcl3對細胞Caspase-3活性具有濃度依賴性的增強作用。而關于Caspase-8活性的變化，只有在Gdcl3濃度達100 μmol·L-1時與對照組相比才有差異(P<0.05)。Caspase-9活性的變化與Caspase-3活性變化趨勢相似?？梢姡珿dcl3主要是通過影響Caspase-3和Caspase-9的活性變化來影響MGC-803凋亡。

3討論

細胞凋亡是由于內(nèi)外環(huán)境的變化或死亡信號的觸發(fā)，在相關基因的調控下所發(fā)生的一系列細胞主動死亡的過程。近年來有關釓離子具有一定的抗腫瘤時有報道[10-13]，但釓離子對胃癌細胞凋亡及增殖的影響，尚未見報道。本實驗通過MTT法測得Gdcl3能明顯抑制胃癌細胞MGC803的增殖，通過流式細胞術測得Gdcl3能誘導MGC803的凋亡。

按細胞凋亡信號傳導通路來分，目前認為，細胞凋亡信號傳導通路包括內(nèi)源性途徑(也稱線粒體凋亡途徑),外源性途徑(也稱死亡受體凋亡途徑)及內(nèi)質網(wǎng)途徑。死亡受體途徑主要是由于死亡受體與其相應配體結合后，細胞內(nèi)發(fā)生一系列的反應，最后激活下游的Caspase-3、6和7,導致細胞凋亡[14]。內(nèi)質網(wǎng)途徑主要是由于內(nèi)質網(wǎng)應激時，激活內(nèi)質網(wǎng)膜上的caspase-12,同時也導致胞質Caspase-7轉移到內(nèi)質網(wǎng)表面激活Caspase-12,繼而激活Caspase-9,進入Caspase級聯(lián)反應，最終引起細胞凋亡[14-15]。線粒體途徑是由于線粒體膜通透性轉換孔開放，并啟動Caspase級聯(lián)反應，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成相應底物的剪切，引起內(nèi)皮細胞死亡和凋亡[15]。

表2　不同濃度Gdcl 3對MGC-803作用24 h后細胞Caspase-3,8,9活性變化的影響

有關Gdcl3誘導MGC803凋亡機制尚未見報道。我們通過檢測Caspase-3、8、9的活性變化，不同濃度Gdcl3對MGC803作用24h后，與對照組相比，Caspase-3和9的活性明顯增高，此結果提示Gdcl3誘導MGC803凋亡可能主要是先通過激活Caspase-9，然后導致下游的Caspase-3的激活，最后由Caspase-3來實現(xiàn)細胞凋亡，即Gdcl3主要通過激活線粒體途徑來促使MGC803凋亡的發(fā)生。

參考文獻：

[1]Koh DM,Collins DJ,Wallace T,et al.Combining diffusion-weighted MRI with Gd-EOB-DTPA-enhanced MRI improves the detection of colorectal liver metastases[J].British Journal of Radiology,2012,85(1015):980-989.

[2]Wu XM,Burden-Gulley SM,Yu GP,et al.Synthesis and Evaluation of a Peptide Targeted Small Molecular Gd-DOTA Monoamide Conjugate For MR Molecular Imaging of Prostate Cancer[J].Bioconjugate Chemistry,2012,23(8):1548-1556.

[3]Miyake Y,Kimura Y,Ishikawa S,et al.Synthesis and functional evaluation of chiral dendrimer-triamine-coordinated Gd complexes as highly sensitive MRI contrast agents[J].Tetrahedron Letters,2012,53(34):4580-4583.

[4]Wan X,Gou BD,Wang K.Gadolinium-promoted angiogenesis involves the activation of PKC and MAPKs in human umbilical vein endothelial cells[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2013,22(1):71-76.

[5]Wang Q,Wang N,Dong M,et al.Gdcl3 reduces hyperglycaemia through Akt/FoxO1-induced suppression of hepatic gluconeogenesis in Type 2 diabetic mice[J].Clinical Science,2014,127(2):91-100.

[6]初晨，王勤勇，李建一，等.氯化釓在肝臟缺血再灌注損傷中的保護作用[J].中國現(xiàn)代普通外科進展，2012,15(6):426-430.

[7]權虎，何志軍，左朝輝，等.三氯化釓對移植肝缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國組織工程研究，2012,16(53):9898-9902.

[8]劉立民，馬瑞卿，閆文貌，等.氯化釓預處理對ANP肺損傷大鼠肺泡巨噬細胞中CYLD及NF-KB的影響[J].中國普通外科雜志，2012,21(3)：267-269.

[9]Feng M,Li JX,Ma XJ,et al.The involvement of signaling activation of protein kinase C in gadolinium chloride-induced cell survival and cell cycle progression in NIH3T3 cells[J].J Chin Pharm Sci,2014,23(11):772-777.

[10] Soares DCF,de Barros ALB,dos Santos RG,et al.apoptosis mediated by caspase-3 and p53-dependent anticancer effects of Gd-159-DTPA-BMA complex[J].Journal of Radioanalytical and nuclear chemistry,2013,295(1):63-66.

[11] Ye LH,Shi Z,Liu HX,et al.Gdcl3 induced Hep G2 cell death through Mitochondrial and external death pathways without significant elevation of ROS generation[J].Biol Trace Elem Res,2013,151(1):148-155.

[12] Kang SG,Zhou GQ,Yang P,et al.Molecular mechanism of pancreatic t μmol·L-1or metastasis inhibition by Gd@C82(OH)(22)and its implication for de novo design of nanomedicine [J].Proceedings of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America,2012,109(38):15431-15436.

[13] Meng J,Liang X,Chen X,et al.Biological characterizations of [Gd@C82(OH)22]n nanoparticles as fullerene derivatives for cancer therapy[J].Integrative Biology,2013,5(1):43-47.

[14] 岳原亦，張揚，張一奇，等.Caspase家族與細胞凋亡[J].中國醫(yī)療前沿,2011,6(6):25-26.

[15] 吳芳，安永康，朱艷琴，等.內(nèi)質網(wǎng)應激與腫瘤細胞凋亡研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2014,22(9):2228-2231.

(收稿日期：2015-03-09，修回日期：2015-04-30)

通信作者：徐細明，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：消化系統(tǒng)惡性腫瘤的基礎與臨床，E-mail：doctorxu120@yahoo.com.cn

作者簡介：陳娜，女，碩士研究生

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.09.056