張國友，邱 靜，陳 剛，陳愛亮，趙 燕，徐貞貞，楊曙明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

柑橘類水果是世界上產(chǎn)量最大的水果。中國是柑橘的主要原產(chǎn)國之一，有文字記載的栽培歷史達(dá)4 000 多年［1］。中國柑橘的生產(chǎn)面積于2004 年達(dá)到163 萬hm2，居世界第一位。近年來我國柑橘產(chǎn)量持續(xù)增長，產(chǎn)量于2011 年達(dá)2 750 萬t，居世界第一位。

辛弗林作為柑橘重要的天然產(chǎn)物之一，被廣泛使用于醫(yī)藥、食品、飲料、飼料和化妝品等行業(yè)中［2］。美國FDA 于2004 年禁止在膳食補(bǔ)充劑中添加麻黃堿之后，辛弗林作為替代品得到了更為廣泛的應(yīng)用。然而，有報(bào)道稱辛弗林在心血管方面具有副作用甚至毒性［3-5］。加拿大衛(wèi)生總署于2010 年建議辛弗林日服用劑量要小于30mg［4］。Kaats GR 等［6］為了確認(rèn)辛弗林是否具有副作用需要進(jìn)行長期臨床研究。為了避免在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)過程中辛弗林的誤用以致引發(fā)食物安全事件，本文針對辛弗林的結(jié)構(gòu)、來源、分布及檢測技術(shù)的國內(nèi)外研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 辛弗林的結(jié)構(gòu)、來源及分布

1.1 辛弗林的結(jié)構(gòu)

1.1.1 異構(gòu)體 辛弗林(Synephrine，C9H13NO2)是一種天然生物堿。目前發(fā)現(xiàn)的辛弗林異構(gòu)體有3 種:para-synephrine (p-辛弗林)、meta-synephrine (m-辛弗林)和ortho-synephrine (o-辛弗林)。p-辛弗林是枳實(shí)等柑橘產(chǎn)品提取物的主要藥用成分之一。o-辛弗林是通過人工合成產(chǎn)生的。關(guān)于m-辛弗林，有的學(xué)者認(rèn)為，柑橘產(chǎn)品中含有m-辛弗林，而有的學(xué)者認(rèn)為柑橘產(chǎn)品中沒有m-辛弗林［3，7，8］。m-辛弗林和p-辛弗林具有不同的生物活性和藥理特征，m-辛弗林的存在與否會直接影響辛弗林類產(chǎn)品的功效和食物的安全性。

1.1.2 對映體 辛弗林具有手性特征，含有兩個(gè)對映體。不同的對映體在手性環(huán)境中的生物活性、毒理學(xué)、環(huán)境化學(xué)過程等存在較大的差異［9］。左旋—辛弗林與右旋—辛弗林，即(－)－辛弗林與(+)－辛弗林在藥理活性上存在顯著差異［7］。柑橘中辛弗林主要以(－)－辛弗林為主［10］，提取過程中，(－)－辛弗林受到溫度、pH 值以及有機(jī)溶劑的影響會發(fā)生外消旋化［11］。重視辛弗林異構(gòu)體和手性特征可以降低食物安全隱患。

1.2 辛弗林的來源與分布

辛弗林在蕓香科植物酸橙及其栽培變種、甜橙的果皮、果實(shí)、果汁、果籽中均有分布，在蕓香科植物吳茱萸中也有報(bào)道［3］。辛弗林的含量受到品種、產(chǎn)地以及生長期等因素的影響。不同品種柑橘落果中辛弗林的含量相差近20 倍［12］，同一植株柑橘皮中辛弗林的含量隨著果實(shí)成熟度的增加而降低［14］。辛弗林可以通過對柑橘類產(chǎn)品的提取和純化獲得，也可以通過化學(xué)合成獲得?；瘜W(xué)合成的辛弗林是外消旋混合物，其藥效遠(yuǎn)小于天然提取的辛弗林［15，16］。

1.3 辛弗林的功效

辛弗林作為枳實(shí)提取物的主要藥用成分，被我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)用于理氣寬中、行滯消脹、食積不化等［17］。美國等西方國家將辛弗林用于制作減肥產(chǎn)品。辛弗林可刺激α-和β3腎上腺素受體，能提升能耗、血壓、代謝、產(chǎn)熱和減輕體重［3，7］。辛弗林與咖啡因、甲基黃嘌呤、麻黃堿、牛磺酸等合用時(shí)，對心血管和中樞神經(jīng)的刺激作用加劇，會引發(fā)頭痛、癲癇、中風(fēng)甚至心力衰竭。辛弗林常以植物提取物的形式與其他有效成分混合而成，所以在其副作用方面還存在爭議［3，5-7］。

2 辛弗林的檢測技術(shù)

在柑橘中是否含有m-辛弗林以及在辛弗林的副作用方面存在爭議，檢測技術(shù)和方法的發(fā)展是正確認(rèn)識辛弗林、深入理解其藥理作用和進(jìn)行質(zhì)量控制的保障。

2.1 樣品前處理

2.1.1 提取 溶劑提取法是常用的方法，乙醇或甲醇是最常用的溶劑，按操作可分冷浸法、滲流法和回流法，回流法提取效率較高［18］。連續(xù)回流法，即索氏提取法(SE)的提取效率高，操作方便，但是因提取液加熱時(shí)間長而不適用于受熱易分解的成分。Karsten Putzbach 等［19］比較了SE 法與聲波提取法對酸橙類食品補(bǔ)充劑中的辛弗林等4 種生物堿的提取效率，發(fā)現(xiàn)聲波提取法的提取效果比SE 法好。賀冬秀等［20］比較了超聲波輔助提取法(UAE)與微波輔助提取法(MAE)對陳皮中辛弗林的提取效率，發(fā)現(xiàn)MAE 法更好。超臨界流體提取法(SFE)節(jié)省溶劑而且可以在相對低溫條件下完成提取，周鳴謙等［21，22］使用SFE-CO2萃取柑橘落果中的辛弗林，提取率達(dá)35.8%，萃取物中辛弗林含量為44.7%，遠(yuǎn)高于溶劑法萃取物(4.6%)，但是萃取壓力高、耗時(shí)長導(dǎo)致操作成本相對較高，而采用超聲強(qiáng)化SFE 法則可以進(jìn)一步的提高提取效率。另外，Sun Yujing 等［23］比較了曬干、烘干和凍干對未熟柑橘落果中生物活性成分提取的影響，發(fā)現(xiàn)凍干方式有利于辛弗林的提取。

2.1.2 凈化 常用的凈化方法有有機(jī)溶劑萃取法、固相萃取法(SPE)［10］、樹脂色譜法(離子交換樹脂，大孔吸附樹脂)和分子印跡固相萃取法 (MISPE)等［20，21，24］。分子印跡固相萃取法具有親和性高和專一性強(qiáng)的特點(diǎn)，比較適用于富集復(fù)雜基質(zhì)中的目標(biāo)物。

2.2 檢測方法

2.2.1 薄層色譜掃描法(TLC) TLC 法是辛弗林定性及定量分析中常用的重要方法之一，在《中國藥典》2005 版中被采用為鑒別辛弗林的標(biāo)準(zhǔn)方法，然而近來研究發(fā)現(xiàn)TLC 法不能鑒別青皮辛弗林和枳實(shí)辛弗林［25］。高效薄層掃描法(HPTLC)是在TLC 基礎(chǔ)之上的改良方法，其靈敏度和分離度都有很大的提高，可以準(zhǔn)確地檢出極微量的物質(zhì)。Shawky，E［26］利用HPTLC 法實(shí)現(xiàn)了酸橙皮中辛弗林及其代謝物章魚胺的同時(shí)測定，Rf值分別為0.292±0.008 3 和0.413 ±0.008 9，此方法特別適合分析植物提取物等復(fù)雜基質(zhì)，可以自動同時(shí)分析多份樣品，而不需要過多的清洗操作，只需要簡單的樣品前處理和少量的溶劑。

2.2.2 毛細(xì)管電泳法(CE) CE 法具有快速、高效、可重復(fù)性好、溶劑消耗量少、測定所需樣品量小、移動方便等特點(diǎn)［27，28］。CE 法抗污染能力強(qiáng)，適用于天然產(chǎn)物等復(fù)雜基質(zhì)的分析，然而CE 法同時(shí)測定的樣品數(shù)量有限。

2.2.3 HPLC 法 HPLC 法是現(xiàn)在最常用的方法［29］，采用極性固定相和相對非極性的流動相將辛弗林分離(附表)。辛弗林分析方面多采用反相色譜柱，通過添加離子對試劑來提高峰對稱性和分辨率，降低基質(zhì)干擾，但是離子對試劑存在離子抑制效應(yīng)、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。紫外檢測器是目前HPLC 法中最常見的檢測器，而熒光檢測器的靈敏度更高［36］?？傊琀PLC 法具有分離度高，操作簡便、快速、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，但是樣品前處理較為復(fù)雜，固定相更換頻率高，溶劑消耗量大，檢測成本高。

附表 HPLC 法對不同樣品中辛弗林的檢測條件及線性范圍

2.2.4 氣相色譜法(GC) GC 法是天然產(chǎn)物分析與中藥質(zhì)量控制方面常用的分析方法。Andrade AS 等［38］使用該方法進(jìn)行了酸橙中p-辛弗林的分析，線性范圍為125～500 mg%，日內(nèi)及日間精密度為3.6%和3.59%，平均回收率為78.1% ±3.64%。在缺乏液相和色譜聯(lián)用設(shè)備條件時(shí)，GC 法可以作為辛弗林分析的替代方法。

2.2.5 聯(lián)用技術(shù) 聯(lián)用技術(shù)在辛弗林檢測方面的應(yīng)用有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)和氣相色譜-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法(GC/ITMS)等。Marchei E 等［39］使用GC-MS 法對減肥類食品添加劑中辛弗林的含量進(jìn)行了測定，線性范圍為0.1～50μg/mg (固態(tài))和0.1～50μg/mL (液態(tài))，平均回收率在89.3%和90.5%之間，定量限為0.1μg/mg (固態(tài))和0.1μg/mL (液態(tài))，不同基質(zhì)中的辛弗林含量在3.1μg/mg (固態(tài))～480.2μg/mL (液態(tài))之間。由于辛弗林具有高極性和低揮發(fā)性，所以在使用GC-MS 法分析時(shí)要消耗額外的時(shí)間來提高揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性。液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)極大地提高了靈敏度。Beyer J 等［40］使用LC-MS/MS 方法分析了人體血漿中辛弗林等的含量，定量限達(dá)10ng/mL。Santana J 等［41］使用LC/UV 和LC/MS/MS 方法分析了酸橙類食品補(bǔ)充劑中的m-辛弗林和p-辛弗林的含量，其中LC/MS/MS 法對辛弗林的定量限達(dá)0.02ng (on-column)。Nelson BC 等［42］使用LC/MS/MS 方法分析了酸橙中辛弗林等物質(zhì)的含量，其定量限達(dá)1pg (on-column)。Rossato LG 等［43］使用GC/IT-MS 對Caco-2 (人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞)中的辛弗林進(jìn)行了測定，得到了比LC-MS/MS 更好的回收率:p-辛弗林(79.1%～95.1%)，m-辛弗林(81.1%～96.8%)，而且分析時(shí)間不超過9min。

3 結(jié)論

辛弗林的各種檢測方法中，TLC 法操作相對復(fù)雜，不適合快速分析，且靈敏度和分離度都相對較低。CE法具有快速、溶劑和樣品量消耗少而且移動方便等特點(diǎn)，但是同時(shí)測定的樣品數(shù)量有限。HPLC 法分離度高，操作簡便、快速，同時(shí)測定的樣品數(shù)量高，但是樣品前處理較為復(fù)雜，溶劑消耗量大，色譜柱更換頻率高。色譜聯(lián)用技術(shù)具有快速、高靈敏度和分離度、能同時(shí)測定多份樣品等特點(diǎn)，能夠滿足檢測技術(shù)在未來多目標(biāo)、快速、綠色環(huán)保等方面發(fā)展趨勢的需求。未來聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展及其在飼料、飲料、食品添加劑等不同產(chǎn)品中辛弗林含量分析方面的應(yīng)用;m-辛弗林和p-辛弗林的同時(shí)檢測;辛弗林及其他生物胺的同時(shí)檢測;不同品種、產(chǎn)地及生長期的柑橘產(chǎn)品中辛弗林的含量分析;辛弗林異構(gòu)體和對映體在不同基質(zhì)中的代謝、積累、藥理藥效以及對人體的副作用，特別是長期臨床試驗(yàn)等方面都需要進(jìn)一步的研究。

［1］王川.中國柑橘生產(chǎn)與消費(fèi)現(xiàn)狀分析［J］.農(nóng)業(yè)展望，2006，1:8-12.

［2］單楊.我國柑橘工業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢［J］.農(nóng)業(yè)工程技術(shù)(農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè))，2014，4:13-17.

［3］Rossato LG，Costa VM，Limberger RP，et al.Synephrine:From trace concentration to massive consumption in weightloss ［J］.Food and Chemical Toxicology，2011，49:8-16.

［4］Health Canada.Guidelines for the use of synephrine in natural health products.2010:(http://hc-sc.gc.ca).

［5］Stohs SJ.Synephrine:From trace concentration to massive consumption in weight-loss ［J］.Food and Chemical Toxicology，2011，49:1472-1473.

［6］Kaats GR，et al.A 60 day double-blind，placebo-controlled safety study involving Citrus aurantium(bitter orange)extract［J］.Food and Chemical Toxicology，2013，55:358-362.

［7］張文娟，等.柑橘屬中生物堿辛弗林生理活性的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2013，34(22):331-334.

［8］Allison DB，et al.Exactly which synephrine alkaloids does Citrus aurantium (bitter orange)contain?［J］.International Journal of Obesity，2005，29:443-446.

［9］邱靜.手性農(nóng)藥及其對映體分離［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2013:10.

［10］Pellati F，et al，Melegari M，et al.Enantioselective LC analysis of synephrine in natural products on a protein-based chiral stationary phase ［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical analysis，2005，37:839-849.

［11］Pellati F，et al.Study on the racemization of synephrine by off-column chiral high-performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217:3503-3510.

［12］毛華榮，等.不同柑橘品種生理落果中橙皮苷和辛弗林含量測定［J］.食品科學(xué)，2009，30(14):223-226.

［13］肖鳴，吳永忠，朱良輝，等.不同產(chǎn)地枳殼中柚皮甙及辛弗林的含量測定［J］.中藥材，2000，23(5):268-270.

［14］韋正，陳鴻平，楊麗，等.同一植株不同生長期橘皮中辛弗林含量動態(tài)變化規(guī)律研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(10):80-84.

［15］Satohs SJ，et al.Stereochemical and pharmacological differences between naturally occurring p-synephrine and synthetic p-synephrine ［J］.Journal of Functional Foods，2012，4:2-5.

［16］張明光.辛弗林及其類似物的合成研究［D］.南京:南京林業(yè)大學(xué)，2008.

［17］趙奎君，鄭玉忠，董婷霞，等.不同產(chǎn)地枳殼藥材HPLC 指紋圖譜及其柚皮苷、新橙皮苷和辛弗林含量分析［J］.中國藥學(xué)雜志，2011，46(12):955-959.

［18］吳崇珍，王莉莉，萬焱，等.枳實(shí)的提取工藝研究及質(zhì)量分析［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39(5):765-757.

［19］Karsten Putzbach，et al.Determination of Bitter Orange alkaloids in dietary supplements standard reference materials by liquid chromatography with ultraviolet absorbance and fluorescence detection ［J］.Journal of Chromatography A，2007，1156:304-311.

［20］賀冬秀，何小珍，劉璐.陳皮中黃酮和辛弗林的不同提取方法優(yōu)化比較［J］.食品科技，2011，36(8):206-210.

［21］周鳴謙，王仁才.超臨界CO2萃取柑橘落果中的辛弗林［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2013，13(3):78-83.

［22］周鳴謙，等.超聲強(qiáng)化超臨界CO2萃取柑橘落果中辛弗林［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，31(9):963-972.

［23］Sun Yujing，et al.Effects of drying methods on phytochemical compounds and antioxidant activity of physiologically dropped un-matured citrus fruits ［J］.LWT -Food Science and Technology，2015，60(2):1269-1275.

［24］Fan Jieping，Zhang Lu，Zhang Xuehong，et al.Molecularly imprinted polymers for selective extraction of synephrine from Aurantii Fructus Immaturus ［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2012，402(3):1337-1346.

［25］王振江，呂潔，丁芳，等.《中國藥典》2005 年版枳實(shí)辛弗林含量及薄層鑒別的探討［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，11(2):148-149.

［26］Eman Shawky.Determination of Synephrine and Octopamine in Bitter Orange Peel by HPTLC with Densitometry ［J］.Journal of Chromatographic Science，2014，52 (8):899-904.

［27］Gang Chen，et al.Determination of hesperidin and synephrine in Pericarpium Citri Reticulatae by capillary electrophoresis with electrochemical detection ［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2002，373:169-173.

［28］彭友元，葉建農(nóng).毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測法測定中藥枳實(shí)和枳殼中的辛弗林和3 種黃酮［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2007，26(5):694-697.

［29］Pellati F，Benvenuti S.Chromatographic and electrophoretic methods for the analysis of phenetylamine alkaloids in Citrus aurantium ［J］.Journal of Chromatography A，2007，1161:71-88.

［30］張紅梅，白妮，魯楊.高效液相色譜法同時(shí)測定土地海苓煎顆粒中芒果苷、辛弗林的含量［J］.中南藥學(xué)，2014，12(3):265-267.

［31］楊華，易小蘭，謝金華，等.HPLC 同時(shí)測定四磨湯口服液中辛弗林、檳榔堿和去甲異波爾定的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(22):79-81.

［32］楊惠，等.反相離子對高效液相色譜法測定四逆散中辛弗林的含量［J］.中南藥學(xué)，2013，11(8):622-637.

［33］陳燕軍，吳有根.離子交換色譜法測定枳實(shí)中辛弗林含量［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9(6):46-47.

［34］于敏，焦連慶.HPLC 法測定消食清肺膏中辛弗林的含量［J］.特產(chǎn)研究，2014，4:63-64.

［35］竇金鳳.反相高效液相色譜法測定香砂養(yǎng)胃丸中辛弗林含量［J］.中國藥業(yè)，2012，21(23):16-17.

［36］趙奎君，玉忠，董婷霞，等.不同產(chǎn)地枳殼藥材HPLC指紋圖譜及其柚皮苷、新橙皮苷和辛弗林含量分析［J］.中國醫(yī)學(xué)雜志，2011，46(12):955-959.

［37］Di Lorenzo C，et al.Development and validation of HPLCmethod to measure active amines in plant food supplements containing Citrus aurantium L ［J］.Food Control，2014，46:136-142.

［38］Andrade AS，et al.Gas Chromatographic Method for Analysis of p-Synephrine in Citrus aurantium L.Products ［J］.Chromatographia，2009，69:225-229.

［39］Marchei E，et al.A rapid and simple procedure for the determination of synephrine in dietary supplements by gas chromatography-mass spectrometry ［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006，41 (4):1468-1472.

［40］Beyer J，et al.Detection and validated quantification of nine herbal phenalkylamines and methcathinone in human blood plasma by LC-MS/MS with electrospray ionization ［J］.Journal of Mass Spectrometry，2007，42 (2):150-160.

［41］Santana J，et al.Determination of para-synephrine and metasynephrine positional isomers in bitter orange-containing dietary supplements by LC/UV and LC/MS/MS ［J］.Food Chemistry，2008，109 (3):675-682.

［42］Nelson BC，et al.Mass spectrometric determination of the predominant adrenergic protoalkaloids in bitter orange (Citrus aurantium) ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55 (24):9769-9775.

［43］Rossato LG，et al.Development and validation of a GC/ITMS method for simultaneous quantitation of para and metasynephrine in biological samples ［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2010，52:721-726.