韓 楓，凌 心

徐州市腫瘤醫(yī)院,徐州221005

吡非尼酮對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

韓 楓，凌 心

徐州市腫瘤醫(yī)院,徐州221005

目的：研究吡非尼酮（pirfenidone，PF）對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2增殖和凋亡的影響。方法：CCK-8法測(cè)定不同濃度PF對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響；Hoechst 33258熒光染色法觀察PF處理后HepG2細(xì)胞形態(tài)的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：PF對(duì)HepG2細(xì)胞具有顯著增殖抑制作用，并呈濃度和時(shí)間依賴性；Hoechst 33258染色可見PF處理后細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，PF處理后的HepG2細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）。結(jié)論：PF對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用，且與誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡有關(guān)。

吡非尼酮；HepG2細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）[1-2]是最常見的惡性腫瘤之一，同時(shí)也是第三大引起患者死亡的腫瘤。原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見惡性腫瘤，其死亡率居惡性腫瘤的第二位。然而，因早期癥狀不明顯，一經(jīng)診斷，多為晚期，喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，其治療仍有賴于化療或與化療相關(guān)的治療。因此，尋找并開發(fā)有效的治療肝癌藥物顯得極其重要。

吡非尼酮（pirfenidone PF）[3-4]為近年來(lái)用于治療肺纖維化的藥物，該藥物是由日本鹽野義于2008年上市。研究證實(shí)其具有抗炎、抗氧化作用[5-6]。在體外，PF可抑制子宮肌瘤細(xì)胞和平滑肌瘤細(xì)胞的增殖[7]。而其對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2作用尚未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究PF對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的體外增殖抑制作用及能否誘導(dǎo)HepG2發(fā)生凋亡，為臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器

3111型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；Power Pac系列垂直電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清 （杭州四季青生物工程材料有限公司）；CCK-8（Cell counting kit-8）檢測(cè)試劑盒 （日本同仁堂）；Hoechst 33258染色液、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶細(xì)胞凋亡雙染試劑盒 （Annexin VFITC/PI apoptosis kit，碧云天生物技術(shù)研究所）；活性天冬氨酸-胱氨酸特異性抗體 （Actived-caspase-3）一抗（Bioworld Technology，Inc）。

1.3 藥物與細(xì)胞株

吡非尼酮（純度99%，購(gòu)自南京榮世醫(yī)藥科技有限公司）；人肝癌細(xì)胞株HepG2（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

人肝癌細(xì)胞株HepG2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每1～2 d換一次液，常規(guī)消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PF溶于二甲基亞砜（DMSO），給藥時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，DM-SO的最終濃度小于0.001（體積分?jǐn)?shù)）；對(duì)照組給予相應(yīng)體積的溶媒，DMSO終濃度為0.001（體積分?jǐn)?shù)）。

1.5 CCK-8法檢測(cè)PF對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，0.25%胰酶消化，用培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔5000個(gè)細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)24 h后，分組：0.1%DM-SO為溶媒對(duì)照組和不同濃度（0.5、1、2、5、10 mM）的PF組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，吸除培養(yǎng)基，加入無(wú)血清培養(yǎng)基（含10%CCK-8）溶液，2 h后于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.6 Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，消化后接種于6孔板中，待長(zhǎng)至80%，加入無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12 h后更換培養(yǎng)液，分別設(shè)0．1%DMSO組和10 mmol· L-1PF組，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基，各孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定15 min，吸除固定液，PBS洗滌 2次每次 4 min，各孔加入Hoechst 33258染色液500 μL，避光室溫放置 8 min，吸除染色液，PBS洗滌2次每次4 min，加入抗猝滅液后于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，消化后接種于6孔板中，待長(zhǎng)至80%，加入無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12h后，更換培養(yǎng)液，分別設(shè)0．1%DMSO組和10 mmol·L-1PF組，各3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，常規(guī)消化細(xì)胞后，PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取5萬(wàn)～10萬(wàn)細(xì)胞，1000 g離心5 min，棄上清液，加入195 μL Annexin VFITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin VFITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，1000 g離心5 min，棄上清液，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕重懸細(xì)胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，隨后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 免疫印跡（Western blot）檢測(cè)凋亡蛋白Actived-caspase-3表達(dá)情況

取同代長(zhǎng)至80%的細(xì)胞兩瓶，無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12 h后，分別設(shè)0．1%DMSO組和10 mmol·L-1PF組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，搜集細(xì)胞，提取蛋白。Western blot實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[8]。顯影、定影、拍照后，用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，actived-caspase-3蛋白的含量用目的條帶灰度值比上內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8法檢測(cè)PF對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制

CCK-8法結(jié)果顯示，不同濃度 PF組作用HepG2細(xì)胞24、48、72 h后，對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，見表1，P＜0．05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨著給藥濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)濃度、時(shí)間依賴性。

2.2 Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

Hoechst 33258熒光染色結(jié)果顯示，0．1%DMSO對(duì)照組，細(xì)胞無(wú)熒光濃染，細(xì)胞核無(wú)固縮，細(xì)胞數(shù)目密集，見圖1A；PF組出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、濃染、細(xì)胞核碎裂，并可見凋亡小體產(chǎn)生，見圖1B。

表1 CCK-8法檢測(cè)不同濃度下PF對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s，n=5）

表1 CCK-8法檢測(cè)不同濃度下PF對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s，n=5）

同一時(shí)間點(diǎn)，PF下一濃度與上一濃度比較：*P＜0．05、**P＜0．01；同一PF濃度，下一時(shí)間點(diǎn)與上一時(shí)間點(diǎn)比較：#P＜0．05、##P＜0．01

組別劑量/ mmol·L-1抑制率/% 24 h 48 h 72 h DMSO 0 0 0 PF 0．5 2．06±3．55 5．99±2．99 13．33±4．04#PF 1 7．32±2．91*14．73±4．19**#20．07±2．73*#PF 2 15．16±4．53*30．95±3．42**##41．93±3．89**##PF 5 31．01±4．37**45．21±3．67**##61．06±2．71**##PF 10 48．21±2．33**62．39±2．11**##85．78±3．34**##

圖1 熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，PF處理HepG2細(xì)胞48 h后發(fā)生細(xì)胞凋亡，見圖2B，凋亡率為（12．53± 1．35）%；DMSO組為 （3．43±0．86）%，見圖2A，P＜0．01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 PF對(duì)凋亡蛋白actived-caspase-3表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，PF處理HepG2細(xì)胞48 h后，可激活caspase-3蛋白表達(dá)，使activedcaspase-3蛋白表達(dá)增加，見圖3，與DMSO組相比，P＜0．01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

吡非尼酮是一種新型抗纖維化藥物，近年來(lái)通過(guò)大量試驗(yàn)證明，吡非尼酮具有較好的抑制細(xì)胞增殖作用，其在抗腫瘤方面的作用也受到醫(yī)藥界的關(guān)注。

圖3 0.1%DMSO組，10 mmol·L-1PF組activedcaspase-3蛋白表達(dá)情況

使用化學(xué)藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡是一種很有前景的治療癌癥的方法。由Hoechst 33258染色及Western blot結(jié)果顯示，吡非尼酮可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，且可能是通過(guò)細(xì)胞特異性caspase依賴的信號(hào)途徑，其中caspase-3為凋亡的效應(yīng)因子，負(fù)責(zé)對(duì)凋亡途徑最后執(zhí)行階段的全部或部分關(guān)鍵性蛋白酶的剪切，被稱為凋亡的“執(zhí)行者”。

綜上所述，本研究證實(shí)吡非尼酮可抑制HepG2細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，且增殖抑制作用具有濃度、時(shí)間依賴性。吡非尼酮可能是通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡來(lái)抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，為進(jìn)一步研究吡非尼酮抗腫瘤的機(jī)制，提供了理論依據(jù)。然而，其能否對(duì)肝癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng)有抑制作用及對(duì)正常肝細(xì)胞是否有影響，還需通過(guò)今后的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

[1]Moudgil V,Redhu D,Dhanda S,et al．A review of molecular mechanisms in the development of hepatocel-lular carcinoma by aflatoxin and hepatitis B and C viruses[J]．J Environ Pathol Toxicol Oncol,2013,32(2): 165-75．

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[3]Burghardt I,Tritschler F,Opitz CA,et al．Pirfenidone inhibits TGF-β expression in malignant glioma cells[J]．Biochem Biophys Res Commun,2007,354(2):542-7．

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Effect of Pirfenidone on Proliferation and Apoptosis of Human Hepatocellular Carcinoma HepG2 Cells*

HAN Feng,LING Xin
Xuzhou Cancer Hospital,Xuzhou 221005

Objective:To investigate the effect of pirfenidone(PF)on cell proliferation and apoptosis of HepG2 cells in vitro．Methods:The cell proliferation inhibition of HepG2 cells by PF was observed by CCK-8 assay．The morphology of HepG2 cells with Hoechst 33258 staining was observed under a fluores-cent microscope．The apoptosis was analyzed by flow cytometry．Results:PF obviously inhibited the prolif-eration of HepG2 cells in a time and dose dependent manner．Hoechst 33258 staining showed apoptosis was induced after PF treatment．Flow cytometry results showed that PF could induce HepG2 cells apopto-sis,compared with the control group (P＜0．01)．Conclusion:PF inhibits the proliferation of HepG2 cells probably because of inducing HepG2 cells apoptosis．

Pirfenidone;HepG2 cells;Apoptosis

R965.1

A

1673-7806（2015）03-223-03

徐州市科技發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（No.XZZDY1404）

韓楓，女，副主任藥師 E-mail:hanfeng1966@126.com

2015-01-13

2015-02-25