劉 達，康 夏，謝慶云，廖冬發(fā)，黃 晨，唐影超，權 毅，張 波

（成都軍區(qū)總醫(yī)院骨科，四川成都610083）

研究表明，中國50歲以上的人群中骨質疏松性骨折占所有骨折的70.00%～80.00%，其中髖部是骨質疏松性骨折最常見的發(fā)病部位之一，中國每年新增的髖部骨折患者約23萬。治療骨質疏松導致的髖部骨折主要包括藥物治療及內固定等手術治療［1-2］。而這兩方面的研究都必須建立在良好的髖部骨質疏松動物模型的基礎上來進行，需通過動物實驗來評價藥物對髖部骨密度（bone density，BD）及力學強度的作用和內固定穩(wěn)定性，而良好的髖部骨質疏松動物模型是該領域研究的必要前提條件。有研究表明，綿羊髖部的解剖結構和生物力學特點與人體近似，且卵巢切除術（ovariectomy，OVX）后的綿羊體內骨質條件的變化與婦女絕經后的變化近似，可以模擬絕經后婦女的骨質疏松癥［3-5］。因此，很多的研究將綿羊作為建立骨質疏松大動物模型的首選。通過文獻回顧發(fā)現，越來越多的學者通過OVX 聯(lián)合激素的方法來建立綿羊骨質疏松模型，主要評價了綿羊腰椎的BD 及生物力學的變化［6-11］，對于綿羊股骨近端BD 及生物力學變化的研究甚少。本實驗采用去勢手術聯(lián)合激素應用的方法建立髖部骨質疏松動物模型，通過雙能X線吸收法測量股骨近端BD，通過生物力學測試評價股骨近端的力學強度，綜合評價上述建模方法對上述指標的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雌性綿羊共16只，均已過生育哺乳期，年齡為（4.56±0.52）歲，體質量為（55.02±6.47）kg，均由成都軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心提供。所有涉及動物實驗的操作均嚴格遵守動物實驗的醫(yī)學倫理學規(guī)定。

1.1.2 實驗耗材和藥品 手術所需器械、耗材及場地均由成都軍區(qū)總醫(yī)院實驗中心提供。雙能X 線骨密度儀（Lunar Corp，Madison，WI，USA）由成都軍區(qū)總醫(yī)院們門診部提供。普通空心螺釘（長度為40.00mm，直徑為6.00mm）16枚，長度和直徑只用于綿羊股骨頸固定，均由醫(yī)用鈦合金制成，由山東威高骨科器械有限公司生產。MTS 858 （MTS System，Minneapolis，MN，USA）力學實驗機由西南交通大學力學實驗中心提供。麻醉藥品速眠新Ⅱ（每支2.0mL）為解放軍獸醫(yī)大學軍事獸醫(yī)研究所生產，每毫升含氟哌啶醇2.5mg，雙氫埃托啡4.0μg，保定寧60.0mg?？咕幬铮鹤⑸溆妙^孢唑林鈉（每支1.0g，上海先鋒藥業(yè)有限公司）。激素：注射用甲潑尼松龍琥珀酸鈉（每支0.5g，美國輝瑞制藥有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、手術及BD 的測量 將16只綿羊分為假手術組和實驗組，每組8只。肌內注射速眠新Ⅱ（0.10 mL／kg）麻醉成功后，將綿羊側臥于雙能X 線BD 儀的掃描臺上，采用手動分析模式測定股骨近端感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）的BD（圖1），從股骨頭下、沿股骨頸方向取矩形的ROI，其寬度接近股骨頸的寬度，長度為從股骨頭下到股骨外側皮質。測量BD 之后將綿羊仰臥于手術臺上，術區(qū)常規(guī)消毒鋪單后，切開皮膚及皮下組織，假手術組經腹腔盆腔顯露至雙側卵巢，無任何處理，反復沖洗后逐層分縫合切口。實驗組實行雙側OVX，仔細縫合結扎后反復沖洗，逐層縫合。術后1個月開始肌內注射甲潑尼松龍（0.45 mg·kg-1·d-1），每月的同一天測量綿羊體質量，根據體質量調整甲潑尼松龍的注射劑量。連續(xù)注射10個月，最后1個月內逐漸減量至停止注射。停藥后觀察1個月，再次測量雙側股骨近端的BD。注射激素期間，對所有綿羊常規(guī)飼養(yǎng)。觀察所有綿羊的切口愈合、注射部位感染情況及注射期間和停藥后的不良反應。

圖1 股骨近端ROI的BD 測量

圖2 股骨近端骨組織的鉆取

1.2.2 股骨近端標本的制備 去勢手術后1年，處死兩組中所有綿羊。取出雙側股骨，每只綿羊隨機選取一側股骨，緊貼股骨頭下緣垂直于股骨頸鋸斷，用內徑1.50cm 的自制環(huán)鉆于斷面中央、沿股骨頸的軸向鉆取標本直至鉆透股骨近端外側皮質（圖2），整個過程中采用生理鹽水濕潤標本。最終制成上下截面平行、高度為3.00cm、直徑為1.50cm 的圓柱狀股骨近端松質骨標本。另一側股骨標本，于大粗隆尖部下方3.00～3.50cm 處順股骨頸方向擰入螺釘。X 線檢查確定空心釘位置。生理鹽水紗布包裹所有標本，密封并存儲于-20 ℃的條件下。實驗前所有標本均在室溫下自然解凍。

1.2.3 壓縮實驗 將松質骨標本置于特制夾具上，以5mm／min的加載速度逐漸施加軸向壓力［10］，直到標本破壞即為實驗終止。實驗機的載荷信號由計算機數據采集系統(tǒng)記錄并自動生成載荷-位移曲線，曲線達到最高點隨即明顯下降即為標本出現破壞，由相應的測試軟件計算出最大壓縮應力（σult）和能量吸收值（E1）。

1.2.4 軸向拔出實驗 用特制夾具將標本固定于MTS 858上，沿螺釘的長軸方向以5 mm／min的加載速度進行拔出實驗［10］，螺釘被拔出后停止。實驗機的載荷信號由計算機數據采集系統(tǒng)記錄并自動生成載荷-位移曲線，曲線達到最高點隨機明顯下降即為螺釘被拔出松動，由相應的測試軟件計算出螺釘的最大軸向拔出力（Fmax）和能量吸收值（E2）。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數據采用SPSS16.0 進行統(tǒng)計學分析。計量資料均采用±s表示，同組中處理前、后BD 間的比較采用配對t檢驗；處理前、后兩組中BD 間的比較及處理后兩組中生物力學參數之間的比較，均采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組綿羊大體觀察 術后16只綿羊活動、進食情況及大小便正常，未發(fā)生任何手術并發(fā)癥。術后切口10d后均甲級愈合。注射部位的皮膚均無感染跡象，注射期間和停藥后兩組綿羊均未見明顯異常反應。

2.2 兩組綿羊處理前、后股骨近端BD 比較 處理前兩組綿羊股骨近端的BD 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.752）。假手術組綿羊處理前、后的BD 無明顯變化（P＝0.387），而實驗組處理后的BD 顯著低于處理前（P＝0.000），平均下降29.46%。處理后實驗組的BD 低于假手術組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.018），見表1。

表1 兩組綿羊處理前、后股骨近端BD 比較（±s，g／cm2）

表1 兩組綿羊處理前、后股骨近端BD 比較（±s，g／cm2）

a：P＜0.05，與實驗組比較；b：P＜0.05，與同組處理前比較。

組別 n 處理前 處理后假手術組 8 1.05±0.10 1.07±0.11 a b 實驗組 8 1.12±0.13 0.79±0.15

2.3 兩組綿羊股骨近端σult及E1比較 與假手術組比較，實驗組中的σult和E1分別下降38.88%和41.34%，均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組綿羊股骨近端σult及E1比較（±s）

表2 兩組綿羊股骨近端σult及E1比較（±s）

a：P＜0.05，與實驗組比較。

組別 n σult（MPa） E1（J）假手術組 8 955.90±268.50a 2.08±0.45 a實驗組8 584.20±193.62 1.22±0.38

表3 兩組綿羊股骨近端Fmax及E2比較（±s）

表3 兩組綿羊股骨近端Fmax及E2比較（±s）

a：P＜0.05，與實驗組比較。

組別 n Fmax（N） E2（J）假手術組 8 937.80±272.52a 2.25±0.60 a實驗組8 564.60±178.83 1.30±0.28

2.4 兩組綿羊股骨近端Fmax及E2比較 與假手術組比較，實驗組中的Fmax和E2分別下降39.79%和42.22%，均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

3 討 論

隨著人口老齡化的日益加重，骨質疏松性骨折（脆性骨折）逐漸成為臨床上的常見病。屈波等［12］通過成都市流行病學調查發(fā)現，在納入的2 457例骨質疏松性骨折老年患者中髖部骨折的比例最高為37%。郝永強等［13］對上海地區(qū)5 923例骨質疏松性骨折的發(fā)病特點研究分析顯示，髖部骨折為22%，脊柱骨折為8%。研究表明，中國骨質疏松性髖部骨折發(fā)生率為16%～20%，年發(fā)病率為180萬至200萬例。預計2020年和2050年髖部骨折人數為163.8萬和590.8萬。在2006年用于髖部骨折治療的費用已經超過63.5億元，預計至2020年預計會增至850億元以上，到2050年則將達18 000億元。骨質疏松性骨折的危害很大，導致病殘率和死亡率的增加。髖部骨折后1年內死于各種并發(fā)癥者高達20%，而存活者中約50%致殘，生活不能自理，生活質量明顯下降。而且，骨質疏松性骨折的治療和護理需要投入巨大的人力、物力和財力，造成沉重的家庭、社會和經濟負擔。

目前，很多學者采用小鼠和大鼠等嚙齒類動物作為骨質疏松動物模型建模的對象，主要用于抗骨質疏松藥物的治療，但該類動物體型較小，不適合進行髖部骨折內固定的模擬及力學性能的相關研究［14］。而靈長類動物無論從生理周期、行走方式，還是骨骼結構上均是與人類最為接近的動物，是骨質疏松動物模型的最佳選擇。但是，飼養(yǎng)管理要求高，實驗費用昂貴及醫(yī)學倫理道德的原因讓該動物的獲取和應用均受到極大的制約。近年來，越來越多的學者青睞使用綿羊建立骨質疏松動物模型。綿羊價格較便宜，獲取方便；性情溫順，易于管理和飼養(yǎng)；且激素分泌與女性類似，OVX 后的綿羊體內骨質條件的變化與婦女絕經后的變化近似，最為重要的是成年綿羊髖部的解剖結構及力學分布與人類接近［3-5］。因此，適合采用綿羊進行髖部骨質疏松動物模型的建立及內固定穩(wěn)定性的相關研究。

文獻回顧發(fā)現，眾多學者基于綿羊進行了相關骨質疏松模型建立的實驗研究。有研究發(fā)現，OVX 聯(lián)合糖皮質激素注射半年和一年后，脛骨近端松質骨的BD、骨小梁體積、彈性模量分別降低了27%和33%、34%和37%、36%和62%［6］。然而，單純行OVX 處理6個月和12個月后上述指標均無明顯降低。研究認為，OVX 聯(lián)合激素使用可降低骨小梁的數量和質量，是建立綿羊骨質疏松模型的可行方法。單獨使用OVX 方法并不能顯著降低綿羊體內某些部位的骨質條件。Schorlemmer等［7］發(fā)現，OVX 聯(lián)合持續(xù)注射甲潑尼松龍（0.45mg·kg-1·d-1）6個月可以顯著減少脛骨干皮質骨和脛骨近端松質骨的生成；使用上述方法12個月后可使脛骨近端松質骨的BD 和壓縮剛度分別降低34%和55%。Lill等［8］研究發(fā)現，OVX 聯(lián)合甲潑尼松龍注射持續(xù)6個月后，腰椎和股骨頭松質骨的骨小梁數量和骨小梁厚度明顯減少，骨小梁間隙明顯增寬，生物力學強度也明顯下降，表明OVX 聯(lián)合激素可以有效地建立骨質疏松動物模型。有研究通過OVX 聯(lián)合低鈣飲食和激素注射的方法建立骨質疏松綿羊模型，選取BD 下降25%作為評價模型是否成功的標準，經過綜合處理半年后綿羊腰椎和股骨近端的BD 分別較處理前下降29.5%和29.1%，均超過了25%的評價標準，骨質疏松模型成功建立［9］。而低鈣飲食的依從性和可行性不如激素注射，并且目前中國還無統(tǒng)一、公認的低鈣飼料，因此本實驗采用了OVX 聯(lián)合激素注射的建模方法。有研究發(fā)現，經OVX 的綿羊注射甲潑尼松龍3個月停藥后，6～11周內會出現橈骨遠端松質骨BD 的反彈（每周上升0.22%），但它 顯 著 低 于 用 藥 期 間BD 的 下 降 幅 度［10］。Zarrinkalam 等［11］采用OVX 聯(lián)合激素注射及低鈣飲食的方法建立綿羊骨質疏松模型后發(fā)現，停止使用激素后綿羊腰椎仍然保持骨質疏松骨組織的微觀結構特點，并為觀察骨質疏松的系統(tǒng)或局部治療效果及內固定的相關研究提供了充足的觀察窗口。因此，本實驗中，停藥后1個月的觀察期并不會嚴重影響骨質疏松模型的建立。

目前的研究主要針對脊柱、橈骨遠端及脛骨近端等部位的骨質條件及生物力學的評價，對髖部周圍、尤其是股骨近端的研究甚少。本課題組在前期針對股骨近端的BD 和微觀結構的變化進行了研究，而缺乏對股骨近端的生物力學強度的變化進行評價。本研究通過OVX 聯(lián)合激素的方法建立髖部骨質疏松動物模型，考慮到股骨近端的脆性骨折及內固定松動的風險，采用了DEXA 測量股骨近端的BD 變化，通過壓縮實驗評價股骨近端的生物力學強度，順股骨頸置入螺釘后通過螺釘的軸向拔出實驗來評價股骨近端骨質對內固定的把持力。研究發(fā)現通過去勢手術聯(lián)合激素注射綜合處理12個月后，綿羊股骨近端的BD 較前有顯著的下降（P＜0.05），且平均下降大于25%（29.46%）。該方法處理后綿羊股骨近端的自身機械強度顯著下降，局部骨質對螺釘的把持力也顯著下降，證實了BD下降可導致骨質生物力學強度的下降，符合骨質疏松病理改變的特點。

綜上所述，本研究認為去勢手術聯(lián)合激素注射可顯著降低綿羊股骨近端的BD、骨質強度及螺釘在股骨近端的穩(wěn)定性?？傊?，去勢手術聯(lián)合激素注射的方法可用于建立髖部骨質疏松動物模型。

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