蔡 磊，侯外林，程 遠(yuǎn)，潘明新△，高 毅

（1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽二科，廣東廣州510280；2.郴州市第一人民醫(yī)院肝膽外科，湖南郴州423000）

眾多研究證實(shí)，骨髓干細(xì)胞（BMSCs）在肝衰竭環(huán)境下能夠在肝內(nèi)分化成具備部分甚至全部肝細(xì)胞功能的肝樣細(xì)胞［1-3］，具體分化機(jī)制尚不明確［4-5］。比較一致的看法是：在肝衰竭微環(huán)境中存在著的某些蛋白分子，通過(guò)一定的信號(hào)通路傳遞，選擇性地抑制或激活BMSCs的轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動(dòng)BMSCs向肝樣細(xì)胞定向分化的相應(yīng)關(guān)鍵基因，進(jìn)而出現(xiàn)特定的轉(zhuǎn)錄和翻譯，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白合成并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，從而使BMSCs分化后的細(xì)胞在生化、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生變化。在此分化過(guò)程中，有啟動(dòng)作用的“關(guān)鍵”蛋白在該過(guò)程中可能起到了十分重要的作用。因而，如何篩選出這些“關(guān)鍵”蛋白成為了探討其分化機(jī)制的難點(diǎn)。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向凝膠電泳（2-DE）和質(zhì)譜分析等技術(shù)觀察急性藥物性肝衰竭模型大鼠和正常大鼠肝臟組織蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，試圖以微環(huán)境為突破口，探討B(tài)MSCs在肝內(nèi)向肝樣細(xì)胞定向分化的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性SD 大鼠24只，10周齡，體質(zhì)量200～250g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。主要試劑與儀器：D-氨基半乳糖鹽酸鹽購(gòu)自南京嘉源醫(yī)藥科技有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）三羧基氨基甲烷（Tris 堿），丙烯酰胺（Arc）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ddH2O、無(wú)水乙醇和100%乙氰（CAN）均購(gòu)自廣州市化學(xué)試劑廠；脫色工作液、酶解工作液、酶解緩沖液和CCA 基質(zhì)工作液均購(gòu)自德國(guó)SERVA Electrophoreses公司；固相pH 梯度干膠條（IPG dry strip pH 4-7 NL，24cm）、IPG 緩沖液Bio-Lytes＋4／7、等電聚焦儀（IPGPhorII）和垂直電泳系統(tǒng)（GE Ettan DALT six，26×20cm）均為美國(guó)通用（GE）公司；基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）儀為德國(guó)Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型制作 將24只SD 大鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組12只。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔內(nèi)注射10g／L的D-氨基半乳糖（0.12L／kg），對(duì)照組大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水（0.12L／kg）。

1.2.2 動(dòng)物模型的鑒定和肝臟組織標(biāo)本的采集 兩組大鼠腹腔用藥48h后，對(duì)存活大鼠均用30g／L 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹部正中切口打開(kāi)腹腔，觀察肝臟大體形態(tài)，迅速行心臟采血，靜置2h后離心取上清液檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）。同時(shí)每只大鼠取2個(gè)肝臟組織標(biāo)本（每個(gè)標(biāo)本大小約為1mm3），其中一標(biāo)本用于病理鑒定，另一標(biāo)本用于蛋白電泳實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 標(biāo)本組織的全蛋白質(zhì)提取 取-80 ℃保存的各組肝臟組織塊，迅速研磨至細(xì)粉末狀，再分別收集于勻漿器內(nèi)，分別加入0.5mL裂解液，冰浴中勻漿；1 000r／min離心10min，收集勻漿液于EP 管中，液氮反復(fù)凍融3次，每次融開(kāi)后注意混勻，離心管加入核酸酶，分別加入10 mg／mL 的DNA 酶3.6 μL和RNA 酶1.2μL，放入冰浴裂解20min并間斷輔以超聲促進(jìn)裂解；12 000r／min 4 ℃離心60min后收集上清液，Bradford法定量蛋白水平。

1.2.4 2-DE和圖像分析 將兩組樣品分別溶于300μL 重泡漲液中，將IPG 膠條放入槽中液體之上，膠條上覆蓋1層礦物油。條件為：恒壓50V，15 ℃，持續(xù)16h。設(shè)置聚焦條件：（1）250V，15 ℃，15 min；（2）從250～10 000 V，15 ℃，5h；（3）10 000V，15 ℃，6h；（4）500V，15 ℃，維持。等電聚焦完成后將IPG 膠條置于-20 ℃冰箱中保存過(guò)夜。4%～20%梯度SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），大小為20.0cm ×20.0 cm×0.1cm。將平衡后的IPG 膠條移至凝膠的上方，相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記物與膠條平行放置，用0.5%的瓊脂糖凝膠封閉。電泳緩沖液為Tris-甘氨酸-SDS，在室溫下以恒壓100V 開(kāi)始電泳，直到溴酚藍(lán)條帶前沿達(dá)到玻璃板下緣為止。以固定液將膠片固定至完全脫色，用兼容質(zhì)譜銀染法染色，將兩組2-DE圖譜進(jìn)行匹配。

1.2.5 質(zhì)譜鑒定 將差異顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)從膠上切下，置于1.5mL 的EP 管中并分別標(biāo)記位點(diǎn)，加入超純水振動(dòng)洗滌3次后，每點(diǎn)加脫色工作液50μL水浴37℃下脫色30min，經(jīng)完全脫水后每點(diǎn)加酶解工作液5μL并冰上吸漲60min后，加酶解緩沖液30μL，37℃下酶解過(guò)夜后取上清置于0.5mL的EP管中，每點(diǎn)加萃取工作液30μL，水浴37 ℃下萃取60min，之后經(jīng)抽干濃縮至體積為5μL。按先后DDH2O、無(wú)水乙醇和100% ACN 乙氰各2次洗板后，每點(diǎn)樣孔先均勻點(diǎn)0.5μL 樣品，再加0.5μL CCA 基質(zhì)工作液（CCA 0.001g＋5%TFA 20 μL＋100% ACN 乙氰500μL＋DDH2O 480μL）于靶模板上，室溫干燥后用MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定。將經(jīng)反相樹(shù)脂柱純化、濃縮后的肽段用內(nèi)標(biāo)法校正的MALDI-TOF-MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定后，將所得的肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)輸入網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用程序（http：／／prowl.rockefeller.edu／prowl-cgi／profound.exe）進(jìn) 行 檢索，得出蛋白質(zhì)名稱、等電點(diǎn)（pI）、相對(duì)分子質(zhì)量等詳細(xì)信息。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以Image Master 2D 軟件分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組該蛋白質(zhì)點(diǎn)相對(duì)水平的平均值并進(jìn)行比較，同時(shí)進(jìn)行Student′s檢測(cè)及Mann-WhitneyU檢測(cè)（軟件自帶），計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠急性藥物性肝衰竭模型的鑒定 給藥48h 后，實(shí)驗(yàn)組SD 大鼠的ALT 及AST 水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)組大鼠給藥48h后見(jiàn)肝臟腫大，包膜緊張，表面呈顆粒狀改變鏡下見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞大片變性壞死，細(xì)胞質(zhì)疏松、壞死區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇擴(kuò)張，呈網(wǎng)眼狀，其內(nèi)可見(jiàn)淤血及出血。對(duì)照組大鼠48h后肝臟組織未見(jiàn)明顯異常（圖1）。證明SD 大鼠急性藥物性肝衰竭模型構(gòu)建成功。

表1 兩組大鼠ALT 及AST 水平比較［±s，n＝12，U／L］

表1 兩組大鼠ALT 及AST 水平比較［±s，n＝12，U／L］

a：P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)組比較。

組別ALT AST實(shí)驗(yàn)組1 109.41±79.41 1 120.50±80.38對(duì)照組 42.68±7.07a 38.91±5.33 a

圖1 兩組大鼠肝臟大體標(biāo)本和病理組織學(xué)觀察

2.2 兩組大鼠肝臟組織蛋白質(zhì)2-DE 結(jié)果 兩組SD 大鼠肝臟組織電泳結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)在pH 3～10、相對(duì)分子質(zhì)量在16～250×103能被很好地分離。比較兩組SD 大鼠肝臟組織蛋白質(zhì)2-DE結(jié)果，發(fā)現(xiàn)27個(gè)差異蛋白質(zhì)位點(diǎn)，其中實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組上調(diào)15個(gè)（圖2A），下調(diào)12個(gè)（圖2B）。在實(shí)驗(yàn)組所篩選出的蛋白中，酪蛋白激酶Ⅰα（casein kinaseⅠ，CKⅠα）和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）較對(duì)照組明顯上調(diào)，酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase，PTK）明顯下調(diào)。

2.3 肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果與肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有蛋白質(zhì)的匹配程度確定所檢測(cè)點(diǎn)位的蛋白質(zhì)屬性，結(jié)合GPMAW 8.00DEMO 蛋白質(zhì)質(zhì)譜與序列分析軟件分析檢索結(jié)果中的Protein Score值，得到27個(gè)具有意義的蛋白質(zhì)，見(jiàn)表2。

圖2 兩組大鼠肝臟組織蛋白質(zhì)2-DE結(jié)果圖像

表2 27個(gè)差異蛋白質(zhì)位點(diǎn)的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)

3 討 論

BMSCs在肝衰竭微環(huán)境中向肝樣細(xì)胞分化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。在此分化過(guò)程中，肝衰竭的肝內(nèi)微環(huán)境中某些蛋白質(zhì)可能起了關(guān)鍵作用。目前，利用蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)對(duì)脂肪肝、肝纖維化的研究較多［6-7］，對(duì)肝衰竭的研究鮮有報(bào)道［8］。

本研究根據(jù)文獻(xiàn)［9-10］報(bào)道，建立了急性藥物性肝衰竭大鼠模型，并通過(guò)肝功能檢測(cè)及病理組織學(xué)分析鑒定了模型的可靠性，為本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選肝衰竭微環(huán)境中的“關(guān)鍵蛋白”奠定了良好的基礎(chǔ)。成功建模后，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠肝組織內(nèi)微環(huán)境的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，并通過(guò)蛋白組學(xué)相關(guān)軟件從中篩選出了27個(gè)差異蛋白，其中，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟中15種蛋白表達(dá)上調(diào)，12種表達(dá)下調(diào)。這些蛋白質(zhì)根據(jù)它們的功能分類，可分為細(xì)胞結(jié)構(gòu)重組相關(guān)蛋白、細(xì)胞新陳代謝相關(guān)蛋白。在實(shí)驗(yàn)組所篩選出的蛋白中，CKⅠα和PCNA 較對(duì)照組明顯上調(diào)，PTK 明顯下調(diào)，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)上述3個(gè)蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞增殖和組織分化密切相關(guān)，因此可推測(cè)它們可能在BMSCs定向分化為肝樣細(xì)胞的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。

CKⅠα是一類具有獨(dú)特理化特性的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于真核生物中，并主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜及細(xì)胞骨架等部位［11］。其可參與到包括基因表達(dá)、DNA 修復(fù)、細(xì)胞周期的進(jìn)行及細(xì)胞增殖等多種細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程中?？梢粤姿峄孜锏鞍踪|(zhì)中已被磷酸化的位點(diǎn)，也可作為其他蛋白激酶的底物被磷酸化，從而參與蛋白質(zhì)的級(jí)聯(lián)磷酸化過(guò)程，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用［12］。研究證實(shí)CKⅠα在經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)蛋白，起著雙向調(diào)節(jié)的作用［13］?？伦鸶唬?4］發(fā)現(xiàn)在MSCs向肝樣細(xì)胞分化過(guò)程中，Notch信號(hào)通路明顯下調(diào)，而TGF-β和Jak-stat信號(hào)通路各基因的表達(dá)趨勢(shì)不規(guī)則，同時(shí)Wnt信號(hào)上調(diào)可以抑制MSCs向肝細(xì)胞分化，使MSCs保持未分化狀。本結(jié)果表明，肝臟損傷后CKⅠα表達(dá)量上調(diào)，推斷其可能通過(guò)Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)BMSCs向肝樣細(xì)胞分化。PTK 是一類催化ATP上γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白酪氨酸殘基上的激酶，能催化多種底物蛋白質(zhì)酪氨酸殘基磷酸化，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化中具有重要作用。目前與PTK 相關(guān)的信號(hào)通路中研究較多的是MAPK 和JAKSTAT 信號(hào)通路［15-16］。大多數(shù)生長(zhǎng)因子的受體都有受體酪氨酸激酶活性，而這些因子中的許多如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）、成 纖 維 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 因 子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）等均已被證實(shí)單獨(dú)和（或）聯(lián)合均能誘導(dǎo)BMSCs向肝樣細(xì)胞分化［17］。PCNA 是DNA 聚合酶δ的輔助蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，PCNA 與細(xì)胞DNA 合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，檢測(cè)PCNA 在細(xì)胞中的表達(dá)，可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)［18］。有報(bào)道表明，P21Cip／WAF1的高表達(dá)抑制了BMSCs增殖，同時(shí)在其向肝樣細(xì)胞分化過(guò)程中起一定調(diào)控作用，P27Kip1 可能并不起作用，PCNA 的表達(dá)則與P21Cip／WAF1相反，呈逐步減少趨勢(shì)［19］。本結(jié)果顯示，PCNA 在肝衰竭肝組織中表達(dá)比正常大鼠肝組織高，推測(cè)該蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)干細(xì)胞RNA 的轉(zhuǎn)錄，促使歸巢于肝臟中的干細(xì)胞迅速合成大量的核酸和蛋白質(zhì)，進(jìn)一步修復(fù)受損的肝功能。目前，雖然微環(huán)境中各種因子的作用尚未完全確定，但是必要的因子在準(zhǔn)確的時(shí)間和階段起作用是BMSCs分化為肝樣細(xì)胞的關(guān)鍵［20］。因此，對(duì)微環(huán)境中蛋白分子及其相關(guān)信號(hào)通路的研究有助于初步闡明BMSCs體內(nèi)定向分化為肝樣細(xì)胞的分子機(jī)制。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)2-DE 和質(zhì)譜分析等技術(shù)觀察急性藥物性肝衰竭模型大鼠和正常大鼠肝臟組織蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，并對(duì)其中的CKⅠα、PTK、PCNA 等蛋白可能與干細(xì)胞的增殖及分化的關(guān)系進(jìn)行了探討。對(duì)進(jìn)一步研究骨髓干細(xì)胞如何在肝衰竭環(huán)境下分化成肝樣細(xì)胞提供了可能的研究方向。

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