宋 芳 馮若鵬 趙紫薇 陳 晶 賀 帥 陳小艷

1.包頭醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（014010）；2.包頭醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室

妊娠期母體產(chǎn)生大量的雌激素、孕激素等，它們能抑制輔助性T細(xì)胞（Th）1亞群反應(yīng)，促進(jìn)Th2細(xì)胞亞群 反 應(yīng)［1－2］。Fotiadou 等［3］和 Piccinni等［4］發(fā)現(xiàn)孕酮可以促進(jìn)Th2型細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子，如白介素（IL）－4和IL－5的高水平表達(dá)，參與免疫調(diào)節(jié)，減少流產(chǎn)發(fā)生。因此，有望通過調(diào)整孕酮水平對Th1／Th2型細(xì)胞因子間的平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)，有效地降低流產(chǎn)率。IL－8為Th1型細(xì)胞因子，表現(xiàn)為免疫殺傷作用，可引發(fā)自然流產(chǎn)，本實驗通過比較孕酮干預(yù)的 CBA／J×DBA／2 小鼠流產(chǎn)模型和 CBA／J×BALB／c小鼠正常妊娠模型IL－8及其mRNA的變化，探討孕酮對自然流產(chǎn)小鼠IL－8的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗人IL－8多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；孕酮和IL－8酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒、PV－6001試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNA抽提試劑RNArose Reagent購于上海華舜生物工程有限公司；通用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）試劑盒購于北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 建立小鼠自然流產(chǎn)模型

將雌性CBA／J小鼠分別與雄性DBA／2或BALB／c小鼠合籠交配，次日晨檢出陰栓者記為妊娠1d，分別建立自然流產(chǎn)模型與正常妊娠模型。于妊娠14d處死孕鼠，計算胚胎吸收率（R），以評價模型成功與否。R＝Re／（Re＋F）（Re為吸收胚胎數(shù)，F(xiàn)為存活胚胎數(shù)）。

1.3 實驗分組

將自然流產(chǎn)小鼠分為兩組：孕酮組和模型組，孕酮組于妊娠5d腹腔注射黃體酮溶液（2mg／kg），每日1次，維持至妊娠14d；模型組同步注射等量的生理鹽水；正常妊娠小鼠不做任何處理。每組10只小鼠。

1.4 ELISA 檢 測

3組孕鼠均于妊娠14d采用眼球摘除術(shù)收集血樣，2000rpm／min離心10min，取血清，用 ELISA試劑盒檢測孕酮及IL－8水平。以標(biāo)準(zhǔn)品2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.06、0pg／ml所對應(yīng)的濃度作為縱坐標(biāo)，OD值作為橫坐標(biāo)在半對數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有OD值均減去空白管值后再計算。根據(jù)樣品OD值在該標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查出相應(yīng)樣品中孕酮、IL－8的含量。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

將符合實驗條件的各組小鼠絨毛、蛻膜組織制備成石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；0.3%H2O2·甲醇室溫孵育30min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶；滴加兔抗人IL－8抗體工作液（1∶200），4℃過夜；滴加羊抗兔IgG抗體－辣根過氧化物酶（HRP）多聚體，室溫孵育30min。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）－H2O2室溫顯色，Mayer蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同。用捷達(dá)801圖像分析系統(tǒng)分別測定各組絨毛、蛻膜組織IL－8蛋白表達(dá)的相對含量。

1.6 RT－PCR

各組小鼠絨毛、蛻膜組織，生理鹽水洗凈后分別投入液氮到組織硬化，然后凍存于－80℃冰箱，以供提取RNA用。按通用RT－PCR試劑盒所示步驟，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用所得cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，采用JeDa 801凝膠成像分析系統(tǒng)對DNA條帶進(jìn)行灰度掃描。

將同一標(biāo)本IL－8DNA條帶的灰度值／β-actin DNA條帶的灰度值＝IL－8mRNA的相對含量

IL－8引物序列：上游引物5＇－GACAAGAGCCAGGAAGAAAC－3＇，下游引物5＇－CTACAACAGACCCACACAATAC－3＇，擴(kuò)增片段長度459bp；βactin引物序列：上游引物5＇－CGGGAAATCGTGCGTGACAT－3＇，下游引物5＇－GAACTTTGGGGGATGCTCGC－3＇，擴(kuò)增片段長度712bp。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件分析處理，用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，經(jīng)方差齊性檢驗后，用單因素方差分析（one－way ANOVA）中的LSD法處理，并進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA 檢 測

孕酮組血清孕酮水平高于模型組，而IL－8水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。孕酮組血清孕酮、IL－8水平與正常組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組血清孕酮、IL－8水平比較（）

表1 各組血清孕酮、IL－8水平比較（）

＊與孕酮組比較P＜0.01

組別 孕酮（ng／ml） IL－8（pg／ml）孕酮組 84.91±10.05 615.23±213.62模型組 41.83±9.77＊ 1653.14±321.25＊正常組 91.27±10.91 653.87±183.43

2.2 免疫組織化學(xué)染色

在絨毛和蛻膜組織中，各組IL－8的蛋白表達(dá)主要定位在絨毛上皮細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒，陽性反應(yīng)強(qiáng)弱不等（圖1）。

圖1 IL－8蛋白在各組絨毛和蛻膜組織中的表達(dá)（HRP，200×）

圖像分析結(jié)果顯示：孕酮組IL－8的蛋白相對含量在絨毛組織、蛻膜組織的蛻膜細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞中均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），與正常組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 各組IL－8在絨毛、蛻膜組織中的蛋白相對含量比較（）

表2 各組IL－8在絨毛、蛻膜組織中的蛋白相對含量比較（）

與孕酮組比較＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01 ＃P＞0.05

組別 絨毛上皮 蛻膜蛻膜細(xì)胞 腺上皮孕 酮 組 0.067±0.028 0.094±0.025 0.104±0.021模型 組 0.135±0.012＊＊ 0.107±0.024＊ 0.116±0.019＊正常 組 0.059±0.021＃ 0.088±0.022＃ 0.110±0.017＃

2.3 RT－PCR實驗

2.3.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的定性分析 IL－8mRNA在各組絨毛、蛻膜組織中均有表達(dá)，IL－8和β-actin的RTPCR產(chǎn)物與理論長度一致見圖2。

圖2 IL－8mRNA在各組絨毛、蛻膜組織表達(dá)的RT－PCR分析

2.3.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的半定量分析 在絨毛組織和蛻膜組織中，孕酮組IL－8mRNA的表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01），與正常組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 各組IL－8mRNA在絨毛、蛻膜組織相對含量比較（）

表3 各組IL－8mRNA在絨毛、蛻膜組織相對含量比較（）

與孕酮組比較＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01 ＃P＞0.05

組別 絨毛組織 蛻膜組織孕酮組 61.28±4.13 72.14±3.04模型組 85.72±2.63＊＊ 82.23±4.11＊正常組 58.33±2.87＃ 70.55±3.66＃

3 討論

目前，不明原因的自然流產(chǎn)已被公認(rèn)為與機(jī)體的免疫因素有關(guān)，且Th1／Th2細(xì)胞因子平衡對正常妊娠是十分重要的。正常妊娠是以Th2型細(xì)胞因子為主的生理現(xiàn)象，當(dāng)發(fā)生向Th1型細(xì)胞因子的偏離時，可能會導(dǎo)致自然流產(chǎn)［5－7］。IL是由多種細(xì)胞分泌的在免疫調(diào)節(jié)過程中起重要作用的細(xì)胞因子，國內(nèi)外已有學(xué)者研究了自然流產(chǎn)患者血清或組織中IL－2、IL－4、IL－5、IL－6、IL－8、IL－10等的變化，但關(guān)于IL－8與自然流產(chǎn)的相關(guān)性研究的文獻(xiàn)報道較少，Madhappan等［8］、Koumantaki等［9］以 及 國 內(nèi) 學(xué) 者齊衛(wèi)紅［10］和黃江寧等［11］均是采用ELISA法檢測反復(fù)自然流產(chǎn)患者血清IL－8的含量，且得出結(jié)論不一致。我們在前期工作中采用RT－PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)在自然流產(chǎn)母胎界面進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)并報道：反復(fù)自然流產(chǎn)患者絨毛、蛻膜組織中IL－8mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于正常妊娠婦女，提示IL－8參與反復(fù)自然流產(chǎn)的病理過程。然而引發(fā)自然流產(chǎn)的免疫機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，Th1／Th2型細(xì)胞因子間的平衡受多種因素的調(diào)控，如何調(diào)節(jié)正常的免疫平衡，維持正常妊娠的進(jìn)行，減少流產(chǎn)的發(fā)生是關(guān)鍵，因此，有必要進(jìn)一步研究引發(fā)自然流產(chǎn)的調(diào)節(jié)機(jī)制。

眾所周知，蛻膜的正常生長和發(fā)育對妊娠的維持起著相當(dāng)重要的作用，而孕酮是維持早孕期蛻膜正常形態(tài)和功能的必要激素。由于臨床研究受到患者遺傳背景、生活習(xí)慣、工作環(huán)境等諸多復(fù)雜因素的影響，而采用近交系小鼠可以排除混雜因素，CBA／J和DBA／2是較為常用的近交品系小鼠。CBA／J×DBA／2小鼠具有反復(fù)自然流產(chǎn)的特點，胚胎吸收率恒定于30%～45%，而CBA／J×BALB／c小鼠的胚胎吸收率僅為5%～10%。目前普遍認(rèn)為，免疫因素是這一動物模型發(fā)生自然流產(chǎn)的主要原因，因此它們是用于研究母胎免疫調(diào)節(jié)機(jī)制較為理想的動物模型［12－13］。

ELISA實驗結(jié)果表明：外源性給予黃體酮的自然流產(chǎn)小鼠，其血清孕酮水平明顯升高，而IL－8水平明顯降低，且血清孕酮、IL－8水平與正常組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見，孕酮對IL－8產(chǎn)生抑制作用，從而減少中性粒細(xì)胞侵入蛻膜組織，可以保證妊娠的順利進(jìn)行。同時，免疫組化染色和RTPCR結(jié)果顯示：在絨毛組織中，外源性給予黃體酮的自然流產(chǎn)小鼠IL－8的蛋白和mRNA相對含量明顯降低，與正常孕鼠比較無顯著性差異；在蛻膜組織中，外源性給予黃體酮的自然流產(chǎn)小鼠IL－8蛋白和mRNA相對含量也降低，并接近正常孕鼠的水平。

因此推測，孕酮通過下調(diào)IL－8表達(dá)來減少自然流產(chǎn)的發(fā)生和發(fā)展，此研究可為防治反復(fù)自然流產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

［1］ Sereshki N，Gharagozloo M，Ostadi V，et al.Variations in T－h(huán)elper 17and Regulatory T Cells during The Menstrual Cycle in Peripheral Blood of Women with Recurrent Spontaneous A－bortion［J］.Int J Fertil Steril，2014，8（1）：59－66.

［2］ 廖義鴻，李紅發(fā).孕酮調(diào)節(jié)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Th1、Th2因子及機(jī)制［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2009，17（11）47－48.

［3］ Fotiadou C，LazaridouE，Sotiriou E，et al.Spontaneous abortion during ustekinumab therapy［J］.J Dermatol Case Rep，2012，6（4）：105－107.

［4］ Piccinni MP，Maggi E，Romagnani S.Role of hormone－controlled T－cell cytokines in the maintenance of pregnancy［J］.Biochem Soc Trans，2000 ，28（2）：212－215.

［5］ Wang Y，Xu B，Li M，et al.IL－22secreted by decidual stromal cells and NK cells promotes the survival of human trophoblasts［J］.Int J Clin Exp Pathol，2013，6（9）：1781－1790.

［6］ Liu F，Luo SP.Effect of Chinese herbal treatment on Th1－and Th2－type cytokines，progesterone and beta－h(huán)uman chorionic gonadotropin in early pregnant women of threatened abortion［J］.Chin J Integr Med，2009 ，15（5）：353－358.

［7］ 郭暢，韓寶生，陸冬梅，等.IL－2受體和IL－6在復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者胚胎組織中的表達(dá)［J］.中國婦幼保健，2009，24（27）：3873－3874.

［8］ Madhappan B，Kempuraj D，Christodoulou S，et al.High levels of intrauterine corticotropin－releasing hormone，urocortin，tryptase，and interleukin－8in spontaneous abortions［J］.Endocrinol，2003，144（6）：2285－90.

［9］ Koumantaki Y，Matalliotakis I，Sifakis S，et al.Detection of interleukin－6，interleukin－8，and interleukin－11in plasma from women with spontaneous abortion［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2001，98（1）：66－71.

［10］ 齊衛(wèi)紅.反復(fù)自然流產(chǎn)患者外周血及母胎界面中白細(xì)胞介素10、8及腫瘤壞死因子-α的表達(dá)［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2007，16（1）：52－53.

［11］ 黃江寧，趙期菊，劉瓊芬，等.孕婦IL－8、IL－10血清學(xué)水平與早期自然流產(chǎn)的相關(guān)性研究［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2009，17（10）：76－77.

［12］ Clark DA，Chaouat G，Arck PC，et al.Cytokine－dependent abortion in CBA×DBA／2mice is mediated by the procoagulant fgl2prothrombinase［J］.J Immunol，1998，160（2）：545－549.

［13］ Jiang PJ，Zhao AM，Bao SM，et al.Expression of chemokine receptors CCR3，CCR5and CXCR3on CD4（＋）T cells in CBA／J×DBA／2mouse model，selectively induced by IL－4 and IL－10，regulates the embryo resorption rate［J］.Chin Med J.2009，122（16）：1917－1921.