耿家金 程加峰 趙 平 楊 名 張永強

Follistatin是Robertson和Ueno于1987年分別從牛和豬卵泡液中分離出的一種富含半胱氨酸的糖基化單鏈多肽，又稱為促卵泡生成素抑制蛋白（FSP）［1］。實驗研究［2－3］顯示，F(xiàn)ollistatin可通過與BMP相互作用來阻止BMP與其受體結(jié)合，從而阻斷下游信號轉(zhuǎn)導，阻斷BMP的生物學作用，所以Follistatin是BMP的細胞外拮抗劑。Follistatin通過與骨形態(tài)發(fā)生蛋白 （BMP）－2、BMP－4、BMP－6、BMP－7結(jié)合來抑制其作用，但它的抑制方式卻不同于其他抑制劑，有其獨特的方式。它與BMP及其受體結(jié)合，通過形成三聚體結(jié)構(gòu)來阻礙BMP與其受體結(jié)合，阻斷Smad信號轉(zhuǎn)導，使BMP不能發(fā)揮成骨作用。而在比例為1∶1的Follistatin－BMP復合物中，BMP能通過它的第2個Ⅰ型受體結(jié)合部位與Ⅰ型受體發(fā)生作用［4］。BMP信號轉(zhuǎn)導可能受Follistatin－BMP－BMP受體復合物和包含BMPⅠ型受體的 Follistatin－BMP復合物（比例為1∶1）抑制［5］，因此Follistatin對BMP配體的抑制作用更強。由于這些復合物的影響，BMP信號轉(zhuǎn)導可能因Ⅱ型受體招募阻斷而受抑制，從而直接或間接影響骨吸收與骨新生的平衡過程。然而，F(xiàn)ollistatin對人類BMSC成骨分化的影響目前尚未明確，本研究旨在探索Follistatin表達抑制對人類BMSC活性及BMP－2誘導人類BMSC成骨分化的影響。

1 資料與方法

1.1 人類BMSC分離與培養(yǎng)

骨髓樣本由5名施行髖關節(jié)置換術患者提供，已獲得患者知情同意書，并通過本院倫理委員會的批準。骨髓樣本采用Ficoll分離液（美國Sigma公司）經(jīng)密度梯度離心分離出單核細胞，以4×105個／cm2的密度接種于DMEM成骨誘導培養(yǎng)基（高糖）（美國 Hyclone公司），培養(yǎng)基中含10%胎牛血清（FBS）（美國 Hyclone公司）、100 U／mL的青霉素（美國Invitrogen公司）、100μg／mL的鏈霉素（美國Invitrogen公司）、0.29 mg／mL的 Glutamax（美國Invitrogen公司）、4 ng／mL的堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）（美國PeproTech公司），所有單核細胞均于37℃、含有5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 BMP－2誘導培養(yǎng)

先以1×105個／孔的密度將人類BMSC接種于6孔培養(yǎng)板中。24 h后，將DMEM生長培養(yǎng)基（高糖）換成DMEM成骨誘導培養(yǎng)基（高糖）（美國Hyclone公司），培養(yǎng)基中含10%FBS（美國Hyclone公 司）、100 U／mL 的 青 霉 素 （美 國Invitrogen 公 司）、100μg／mL 的 鏈 霉 素 （美 國Invitrogen公司）、0.29 mg／mL的 Glutamax（美國Invitrogen公司）及0～50μg／mL的重組人類BMP－2（美國PeproTech公司）。在 BMP－2誘導培養(yǎng)72 h后，采用Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）裂解收集細胞。采用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈式反應（RT－PCR）檢測Follistatin mRNA表達量。以同樣的方式將人類BMSC接種于培養(yǎng)皿中，分別加入或不加入BMP－2 0.1μg／mL。細胞樣品在BMP－2處理即刻、24 h、48 h、72 h 及 96 h 后 收 集，檢 測Follistatin mRNA的表達。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄與qRT－PCR

采用 NanoDrop ND－1000分光光度計（美國Thero Scientific公司）測定Follistatin總RNA含量，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國Tiangen公司）將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。對20μL的Follistatin進行逆轉(zhuǎn)錄，步驟為25℃下放置5 min，42℃下放置30 min，85℃下放置5 min。進行3次定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈式反應（qRT－PCR），由羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司LightCycler 480系統(tǒng)完成。

1.4 Follistatin siRNA效率評估

設計合成4個siRNA，用來靶向人類Follistatin（基因ID：10468）mRNA（德國 Qiagen公司）不同區(qū)域，其排序信息見表1。

表1 siRNA靶向人類Follistatin mRNA不同區(qū)域排序信息

以 BLOCK－iT siRNA（美國Invitrogen公司）作為對照siRNA。為驗證這些Follistatin特異性siRNA的敲除效率，利用Lipofectamine（美國Life Technologies 公 司）將 BLOCK－iT siRNA 和Follistatin特異性siRNA轉(zhuǎn)染入人類BMSC。轉(zhuǎn)染24 h后，BMSC 置于含有0.1μg／mL BMP－2的基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)BMP－2處理72 h后，將總RNA抽離，應用qRT－PCR分析Follistatin mRNA表達。此 外，BMP－2 處 理 后 72 h，采 用 人 類Follistatin Elisa試劑盒（美國R＆D公司）檢測培養(yǎng)基上清液中Follistatin蛋白含量。選擇對Follistatin mRNA和蛋白質(zhì)表達抑制效率最高的siRNA進行下一步實驗。

在BMP－2存在的情況下，轉(zhuǎn)染Follistatin siRNA后會抑制Follistatin表達，為進一步檢測抑制持續(xù)時間，需針對siRNA轉(zhuǎn)染后Follistatin不同時間點的表達進行研究。在轉(zhuǎn)染前（0d），收集樣品以確定Follistatin表達水平。根據(jù)轉(zhuǎn)染情況，將樣品分為3組，即未轉(zhuǎn)染（Mock）組、對照轉(zhuǎn)染siRNA（NC siRNA）組、頭蛋白siRNA轉(zhuǎn)染組，并進行3次重復實驗。轉(zhuǎn)染24 h后，培養(yǎng)基換成DMEM成骨誘導培養(yǎng)基（含有0.1μg／mL的BMP－2），培養(yǎng)基每3天換1次。在培養(yǎng)后3、7、10 d分別收集細胞樣品，并抽取總RNA，進行qRT－PCR分析，檢測Follistatin表達水平。

1.5 人類BMSC增殖活性分析

將人類BMSC接種于48孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，密度為5×104個／孔。接種24 h后，人類BMSC分別用對照siRNA和抑制效率最高的Follistatin siRNA進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，將DMEM生長培養(yǎng)基換為 DMEM 成骨誘導培養(yǎng)基（含有0.1μg／mL的BMP－2）進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)后0、3、7 d檢測人類BMSC代謝活性。采用2－（2－甲氧基－4－硝苯基）－3－（4－硝 苯 基）－5－（2，4－二 磺 基 苯）－2H－四 唑 單 鈉 鹽（WST－8）試劑檢測人類BMSC線粒體脫氫酶活性。在波長450 nm處采用微孔盤吸收儀（美國BioTek公司）讀取吸光值，對照波長為650 nm。

1.6 人類BMSC DNA含量分析

將人類BMSC接種于96孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，密度為3×103個／孔。接種24 h后，人類BMSC分別用對照siRNA和抑制效率最高的Follistatin siRNA進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，將DMEM生長培養(yǎng)基換成DMEM成骨誘導培養(yǎng)基（含有0.1μg／mL的BMP－2）進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)后0、3、7 d，溶解細胞并收集樣品。采用CyQUANT細胞增殖分析試劑盒（美國Invitrogen公司）進行DNA含量檢測。

1.7 人類BMSC成骨誘導

利用siRNA抑制人類BMSC中的Follistatin表達，然后使用DMEM成骨誘導培養(yǎng)基（含10%FBS、100 U／mL的青霉素、100μg／mL的鏈霉素、0.29 mg／mL的 GlutaMAX－L、1×105mol／m3的地塞米松、5 mol／m3的甘油磷酸鹽、0.1μg／mL 的BMP－2及50 mg／L的維生素C磷酸酯鎂）誘導人類BMSC成骨分化。

1.8 成骨相關基因表達分析

在成骨誘導14 d，收集細胞樣品并抽取總RNA，按照以上表述進行逆轉(zhuǎn)錄。應用qRT－PCR檢測成骨細胞基因如堿性磷酸酶（ALP）、IBSP、MSX2、OC、OPN及 RUNX2基因表達水平。以GAPDH為內(nèi)參基因。

1.9 ALP染色和活性分析

在成骨誘導14 d，分別采用固紫B染色試劑盒（美國Sigma公司）和ALP分析試劑盒（美國BioAssay Systems公司）進行染色和ALP活性分析。

1.1 0 茜素紅染色和鈣含量測定

在成骨誘導28 d，分別采用茜素紅S（美國Sigma公司）和QuantiChrom鈣分析試劑盒（美國BioAssay Systems公司）進行染色和鈣含量分析。

1.1 1 統(tǒng)計學分析

采用PASW Statistics 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，并采用t檢驗與單因素方差分析進行分析，必要時使用Bonferroni事后檢驗法進行檢驗。P＜0.05認為具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 BMP－2誘導Follistatin mRNA表達

BMP－2誘導Follistatin mRNA表達呈劑量依賴性，濃度為1μg／mL的BMP－2誘導產(chǎn)生的Follistatin mRNA表達水平最高（圖1a）。BMP－2濃度為0～1μg／mL時，F(xiàn)ollistatin表達隨BMP－2濃度升高而逐漸增加；BMP－2濃度為1～50μg／mL時，F(xiàn)ollistatin表達則隨BMP－2濃度升高而逐漸受到抑制。未經(jīng)BMP－2 處 理 組 與 經(jīng) 50 μg／mL BMP－2 處 理 組Follistatin表達水平無統(tǒng)計學差異（圖1a）。

BMP－2誘導Follistatin mRNA表達呈時間依賴性。以濃度為1μg／mL的BMP－2進行誘導時，F(xiàn)ollistatin mRNA水平隨時間增加而逐漸升高，在BMP－2處理后48、72、96 h增加最為顯著（圖1b）。

2.2 Follistatin siRNA 抑 制 BMP－2 誘 導 的Follistatin mRNA表達升高

與 Mock組相比，NC siRNA 組 Follistatin mRNA及蛋白水平未改變（圖 2a、b）。然而，F(xiàn)ollistatin siRNA1與siRNA2轉(zhuǎn)染顯著減少了人類BMSC頭蛋白mRNA的表達水平（圖2a）和培養(yǎng)液上清液中Follistatin蛋白水平（圖2b）。而Follistatin siRNA3與siRNA4轉(zhuǎn)染對于Follistatin mRNA表達水平的影響并不顯著（圖2a），僅輕微增加培養(yǎng)液上清液中頭蛋白表達水平（圖2b）。由于Follistatin siRNA1對Follistatin表達起到最佳的抑制效果（圖2a、b），我們僅使用頭蛋白siRNA3進行以下實驗。

BMP－2誘導后0～7 d Mock組與 NC siRNA組Follistatin mRNA表達增加。siRNA轉(zhuǎn)染后3、7 d，F(xiàn)ollistatin siRNA1轉(zhuǎn)染能顯著抑制Follistatin表達，而siRNA轉(zhuǎn)染后10 d，抑制效果則不明顯（圖2c）。

2.3 Follistatin表達抑制提高人類BMSC活性

經(jīng) WST－8 分 析 顯 示，siRNA 轉(zhuǎn) 染 后 3、7 d Follistatin siRNA1可顯著提高人類BMSC代謝（圖3a）。在 DNA分析中亦出現(xiàn)同樣情況。Follistatin siRNA1使得總DNA含量在siRNA轉(zhuǎn)染后3、7 d顯著增加（圖3b）。此外，siRNA轉(zhuǎn)染后14 d，F(xiàn)ollistatin siRNA1轉(zhuǎn)染組總蛋白含量顯著高于NC siRNA組總蛋白含量（圖3c）。

圖1 BMP－2誘導Follistatin mRNA表達 a.BMP－2誘導后Folliatatin mRNA表達呈劑量依賴性 b.BMP－2（1μg／mL）誘導后Folliatatin mRNA表達呈時間依賴性

圖2 Follistatin siRNA抑制效率 a.不同siRNA轉(zhuǎn)染后72 h Follistatin mRNA表達 b.不同siRNA轉(zhuǎn)染后72 h培養(yǎng)基上清液中Follistatin蛋白濃度 c.人類BMSC中Follistatin RNA表達，轉(zhuǎn)染后細胞經(jīng)0.1μg／mL BMP－2處理

圖3 Follistatin表達抑制時人類BMSC活性增強。在siRNA1轉(zhuǎn)染后3、7 d，由于Follistatin表達抑制，人類BMSC代謝（a）和DNA含量（b）增加；在siRNA1轉(zhuǎn)染后14 d，由于Follistatin表達抑制，人類BMSC總蛋白含量（c）增多

2.4 Follistatin表達抑制提高人類BMSC成骨分化能力

由于Follistatin siRNA1單次轉(zhuǎn)染的抑制作用最長持續(xù)7 d（圖2c），故我們在人類BMSC成骨分化期間，每7天進行1次siRNA轉(zhuǎn)染。同時，頭蛋白siRNA1可顯著提高成骨相關基因如ALP、OCN、OSX、OC、OPN和RUNX2表達水平（圖4a～f）。

成骨誘導后14 d，ALP染色表明Follistatin siRNA1轉(zhuǎn)染增強了細胞ALP活性（圖5a）。定量ALP活性檢測也出現(xiàn)類似結(jié)果，表明Follistatin siRNA1轉(zhuǎn)染可顯著增強細胞ALP活性（圖5b）。

定量茜素紅染色顯示，與 Mock組和NC siRNA組相比，F(xiàn)ollistatin siRNA2轉(zhuǎn)染組鈣素沉淀產(chǎn)生增多（圖6a）。定量鈣含量檢測也表明在細胞培養(yǎng)中Follistatin siRNA2可增加鈣沉降（圖6b）。

圖4 Follistatin表達抑制時人類BMSC成骨相關基因表達。在含有0.1μg／mL BMP－2的DMEM成骨誘導培養(yǎng)基中進行成骨誘導時，成骨相關基因如 ALP（a）、OCN（b）、OSX（c）、OC（d）、OPN（e）及 RUNX2（f）表達水平增高

圖5 Follistatin表達抑制時人類BMSC成骨分化ALP檢測。在含有0.1μg／mL BMP－2的DMEM 成骨誘導培養(yǎng)基中進行成骨誘導，14 d后ALP染色（a）和定量ALP活性檢測（b）顯示ALP活性因Follistatin表達抑制而增強

圖6 Follistatin表達抑制時人類BMSC成骨分化鈣沉積檢測。在含有0.1μg／mL BMP－2的DMEM 成骨誘導培養(yǎng)基中進行成骨誘導，28 d后茜素紅染色（a）與鈣含量分析（b）顯示鈣沉降因Follistatin表達抑制而增加

3 討論

3.1 BMP促進BMSC成骨分化

骨折后，BMSC在多種生長因子的誘導下遷移至骨折處骨表面，分化為成骨細胞，合成大量細胞外基質(zhì)，修復受損骨骼［6－9］。多種細胞生長因子參與調(diào)控BMSC修復受損骨骼［10］，其中BMP起了至關重要的作用［11－12］。研究［13－14］表明，BMP－2、BMP－4、BMP－6、BMP－7和BMP－9均可在體內(nèi)外誘導人類BMSC向成骨細胞方向分化。BMP發(fā)揮作用時，先與細胞表面BMPⅠ型、Ⅱ型受體結(jié)合，并激活細胞內(nèi)Smad蛋白復合體，繼而激活的Smad蛋白復合體與各種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)成骨細胞基因表達［15－17］。

3.2 BMP拮抗劑作用機制

BMP誘導的成骨分化受細胞外BMP拮抗劑如Noggin、Chordin、Gremlin 及 Follistatin 等 調(diào)節(jié)［18－19］。BMP拮抗劑通過與BMP結(jié)合阻止BMP與細胞膜上的相應受體結(jié)合，從而阻礙BMP下游信號轉(zhuǎn)導通路的激活，減弱BMP生物學活性，間接調(diào)控BMP生物學作用，同時BMP拮抗劑也可直接作用于細胞膜上的受體。每種BMP拮抗劑都與BMP超家族中的成員有不同程度的親和力。BMP拮抗劑在細胞分化及生物發(fā)育中起了至關重要的作用。

3.3 BMP－2誘導人類BMSC表達Follistatin

BMP對人類BMSC具有促成骨分化作用。在BMP－2誘導作用下人類BMSC會表達一些與成骨相關的標志基因如ALP、RUNX2等。但我們的研究顯示，BMP－2濃度從0.01μg／mL升至1μg／mL過程中，它對Follistatin誘導逐漸增強，而濃度從1μg／mL升至50μg／mL時，它對Follistatin表達的誘導作用則逐漸減弱；表明在BMP－2誘導作用下人類BMSC中Follistatin表達與BMP－2呈濃度和時間依賴性。但對于BMP－2濃度進一步升高至大于1μg／mL后會導致Follistatin蛋白誘導減少，我們尚不清楚原因，推測可能是高濃度的BMP－2對細胞產(chǎn)生毒性的緣故。在我們的研究中濃度為50μg／mL的BMP－2未能誘導Follistatin表達，而Follistatin表達抑制則增強了人類BMSC成骨分化能力，表明高濃度BMP－2可能對新骨形成并無益處。BMP－2在促進了人類BMSC成骨分化的同時也促進BMP－2抑制劑表達，通過降低BMP－2生物學活性來負反饋調(diào)節(jié)BMP－2生物學活性，以防體內(nèi)過度骨化。

3.4 Follistatin對BMP－2誘導人類BMSC成骨分化的影響

BMSC成骨分化在骨折修復過程中起了至關重要的作用，BMP對BMSC的成骨分化有促進作用，但BMP在細胞外受到多種細胞因子的影響，F(xiàn)ollistatin可與BMP形成復合物，阻礙BMP對BMSC成骨分化信號轉(zhuǎn)導通路的激活。有研究報道Follistatin通過與BMP相互作用來調(diào)控細胞分化及生物發(fā)育，而我們的研究亦顯示了Follistatin在人類BMSC成骨分化方面的作用及Follistatin對BMSC活性的影響。以上研究表明，F(xiàn)ollistatin表達抑制可增加人類BMSC活性，增強BMP－2對BMSC成骨分化的影響，從而進一步認識了Follistatin在人類BMSC成骨分化中扮演重要角色。Follistatin表達抑制可增強人類BMSC的細胞代謝、DNA和蛋白含量。有研究認為，F(xiàn)ollistatin可抑制腫瘤增殖速度。我們的研究表明，在BMP－2存在的情況下，F(xiàn)ollistatin對于人類BMSC成骨分化具有抑制作用。其可能機制為Follistatin結(jié)合BMP－2，使得BMP－2不易與人類BMSC膜受體結(jié)合，導致BMP－2生物學活性減弱，從而抑制下游信號轉(zhuǎn)導。通過檢測BMP－2下游的Smad信號轉(zhuǎn)導通路來驗證我們的假設，是我們下一步所要進行的研究。BMP－2信號減弱可能導致下游Smad信號減弱，Smad1／5／8 復 合 體 磷 酸 化 降低，磷 酸化Smad1／5／8入核減少，相關靶基因表達減弱，從而影響B(tài)MSC成骨分化及細胞活性。我們現(xiàn)有的數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)ollistatin表達抑制可增強RUNX2、MSX2及成骨細胞分化中關鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達。此外，成骨細胞標記物如ALP、IBSP、OC及OPN的表達水平也隨Follistatin表達抑制而升高。

我們得出結(jié)論是，BMP－2可呈劑量依賴性和時間依賴性地正調(diào)節(jié)Follistatin表達。Follistatin表達抑制可增強人類BMSC細胞活性及BMP－2誘導的人類BMSC成骨分化作用，表明Follistatin在人類BMSC成骨分化中起到了抑制作用。Follistatin通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)人類BMSC成骨分化，目前其胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路作用機制尚未明確，需進一步研究。

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