王 鑫 茍文隆 徐小龍 李丙巖 王 程 汪愛媛 王 玉 劉舒云 許文靜 盧 強(qiáng) 彭 江 盧世璧

干細(xì)胞具有多向分化潛能及自我更新能力，在組織損傷時(shí)可歸巢至損傷組織處促進(jìn)組織修復(fù)，目前在心肌、肺、胰、神經(jīng)及骨等組織有較多報(bào)道［1－5］，其歸巢修復(fù)能力已逐漸達(dá)成共識(shí)，但損傷后全身干細(xì)胞的動(dòng)員、遷移機(jī)制以及遷移到損傷處后的具體作用機(jī)制仍不清楚。體內(nèi)干細(xì)胞來源有限，骨髓中僅有0.001%～0.01%的單核細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）［6］。損傷較嚴(yán)重時(shí)，通?？刹捎皿w外擴(kuò)增培養(yǎng)后再回輸體內(nèi)的方法應(yīng)對(duì)自體MSC不足。本研究通過尾靜脈向閉合性股骨骨折內(nèi)固定小鼠模型注射紅色熒光蛋白標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（RFP－BMSC），觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）在骨折愈合中的作用，同時(shí)通過注射基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF）－1受體CXCR4的特異性阻斷劑橋聯(lián)1，4，8，11－四氮雜環(huán)十四烷（AMD3100），探討 SDF－1／CXCR4通路在這一過程中的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)成品細(xì)胞

6周齡健康成年雄性清潔級(jí)C57／BL小鼠65只，體重17～25 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、方法及小動(dòng)物福利等均已經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。RFP－BMSC由賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司提供。

1.2 小鼠閉合性股骨骨折內(nèi)固定模型建立

1.2.1 造模支架設(shè)計(jì)制作

參照文獻(xiàn)［7］設(shè)計(jì)制作造模支架，該支架可根據(jù)小鼠體型調(diào)整支架的載物臺(tái)及置腿臺(tái)；增加了力學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)及彈簧裝置，使砝碼下落形成的沖量能更加穩(wěn)定準(zhǔn)確地傳導(dǎo)至小鼠大腿，并防止重錘反彈導(dǎo)致二次損傷（圖1）。

圖1 小鼠閉合性股骨骨折模型造模支架示意圖 a.正面觀 b.側(cè)面觀 c.支架結(jié)構(gòu)示意圖 d.載物臺(tái)、置腿臺(tái)及重錘

1.2.2 小鼠模型制造

小鼠予1%水合氯醛3 mL／kg腹腔注射麻醉，仰臥位屈膝90°固定，右膝術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒鋪巾，于右膝關(guān)節(jié)髕骨水平作一1 cm縱行正中切口，沿髕骨內(nèi)側(cè)緣切開關(guān)節(jié)囊和股四頭肌肌腱，將髕骨翻向外側(cè)，充分暴露股骨內(nèi)外髁間溝，于此處將直徑0.45 mm不銹鋼針刺入骨髓至約股骨轉(zhuǎn)子間窩水平以起到髓內(nèi)釘固定的作用。剪斷鋼針針柄，將針尾埋于股骨髁間窩內(nèi)，使其不影響膝關(guān)節(jié)活動(dòng)，關(guān)閉創(chuàng)口。術(shù)畢將小鼠轉(zhuǎn)移至載物臺(tái)，置其右大腿于沖擊臺(tái)上。從17～20 cm高處落下200 g砝碼（根據(jù)小鼠體重適度調(diào)整），使該側(cè)股骨骨折并立即采用美國(guó)Faxitron公司MX－20型放射檢測(cè)系統(tǒng)確定骨折情況。造模成功的小鼠飼養(yǎng)于25℃室溫籠中，自由活動(dòng)，常規(guī)食水。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

65只小鼠造模成功后7 d分為3組，給予不同干預(yù)：MSC組（35只）尾靜脈注射0.5 mL生理鹽水，0.5 h后注射內(nèi)含1×106個(gè) RFP－BMSC 溶液0.5 mL；AMD3100 組 （15 只 ）尾 靜 脈 注 射1 mmol／L AMD3100 0.5 mL，0.5 h后注射內(nèi)含1×106個(gè)RFP－BMSC溶液0.5 mL；對(duì)照組（CON）組（15只）：尾靜脈注射生理鹽水0.5 mL，0.5 h后再次注射生理鹽水0.5 mL。造模成功后14、28、42 d取右側(cè)股骨干，抽出內(nèi)固定針后分別制備冰凍切片標(biāo)本、免疫熒光標(biāo)本凍存于－80℃冰箱，組織切片標(biāo)本則以10%中性甲醛固定。其中各組14、42 d后均分別取5只小鼠制備組織切片標(biāo)本，且42 d后再各取5只小鼠進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)；MSC組術(shù)后14、28、42 d均各取5只制備冰凍切片，采用熒光示蹤法觀察小鼠RFP－BMSC歸巢情況，并在28 d后取5只小鼠采用免疫熒光法觀察BMSC位置和骨橋蛋白（OPN）、骨鈣素（OCN）的表達(dá)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 冰凍切片熒光示蹤法

將MSC組標(biāo)本用最佳切片溫度（OCT）冰凍包埋劑包埋并切取厚約7μm切片，采用美國(guó)Sigma公司Hochest33258染色試劑盒對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，使未經(jīng)紅色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞在熒光激發(fā)下發(fā)出藍(lán)光，而RFP－BMSC則發(fā)出紅色熒光，進(jìn)行疊加后可對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行示蹤，進(jìn)而可在熒光顯微鏡下觀察RFP－BMSC歸巢情況。

1.4.2 免疫熒光法

骨折后28 d是骨折愈合過程中骨性骨痂生成并進(jìn)行塑形改造的關(guān)鍵期，許多促進(jìn)骨折愈合的骨形成因子表達(dá)均在此時(shí)達(dá)到高峰。本實(shí)驗(yàn)選擇造模成功后28 d通過免疫熒光法檢測(cè)小鼠股骨骨折區(qū)RFP－BMSC骨標(biāo)志蛋白表達(dá)情況。取 MSC組標(biāo)本用OCT冰凍包埋劑包埋并切取厚約7μm切片，晾干30 min，丙酮內(nèi)固定10 min，過蒸餾水后以3% 過氧化氫浸泡5 min去抗原，磷酸鹽緩沖液內(nèi)浸潤(rùn)3次，再依次滴加SDF－1、OPN、OCN 一抗及二抗，采用Hochest33258染色試劑盒染色后在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。其中未經(jīng)紅色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)出藍(lán)色熒光，RFP－BMSC發(fā)出紅色熒光，而目的因子的一抗與二抗結(jié)合后發(fā)出綠色熒光，進(jìn)行疊加后可觀察歸巢的干細(xì)胞位置及是否表達(dá)OCN、OPN。

1.4.3 組織學(xué)觀察

取各組造模成功后14、42 d標(biāo)本在10%中性甲醛中固定，10% 乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液中脫鈣，石蠟包埋，連續(xù)切取厚5μm切片，60℃烤片過夜，制備組織切片標(biāo)本；進(jìn)行HE染色和Masson三色染色，常規(guī)脫水后中性樹脂封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。HE染色可顯示骨折基本形態(tài)及骨痂形成情況，Masson染色中呈綠色的為鈣化骨性骨痂成分。

1.4.4 生物力學(xué)檢測(cè)

取各組造模成功后42 d小鼠5只，去除右側(cè)股骨內(nèi)固定針后使用美國(guó)Bose公司Electro Force5100生物力學(xué)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲力學(xué)檢測(cè)，并以各自健側(cè)股骨干作為正常對(duì)照組。置標(biāo)本于載物臺(tái)，使負(fù)荷加載點(diǎn)位于股骨骨折線處，跨距1 cm，加載速度5 mm／min（圖2），直至骨斷裂。實(shí)驗(yàn)過程保持標(biāo)本濕潤(rùn)。計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制載荷－形變曲線，并計(jì)算最大載荷、最大橈度、彈性橈度及剛度。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)F檢驗(yàn)及組間SNK檢驗(yàn)。

圖2 三點(diǎn)彎曲力學(xué)檢測(cè)示意圖

2 結(jié)果

2.1 RFP－BMSC歸巢定位觀察結(jié)果

MSC組造模成功后14、28、42 d均可見小鼠股骨骨折區(qū)骨痂內(nèi)有RFP－BMSC歸巢，而周圍軟組織及正常骨組織內(nèi)未見大量該類細(xì)胞聚集（圖3）。

2.2 免疫熒光觀察結(jié)果

MSC組造模成功后28 d，小鼠右側(cè)股骨部位可見大量RFP－BMSC表達(dá)，并可見OCN和OPN表達(dá)（圖4）。

2.3 病理組織切片觀察結(jié)果

造模成功后14 d CON組與AMD3100組 HE染色可見骨折斷端清晰，周圍呈梭形膨大骨痂，Masson三色染色示骨痂以軟骨成分為主，少量鈣化成為骨性骨痂；MSC組骨折線不明顯，骨痂已多為骨性骨痂。3組42 d后骨折線均消失，編織骨向板層骨轉(zhuǎn)化，CON組與AMD3100組處于骨痂塑形期，皮質(zhì)骨質(zhì)量差，MSC組骨痂已基本塑形完成（下頁(yè)圖5）。

圖3 冰凍切片熒光示蹤顯微觀察示MSC組骨折后14、28、42 d骨折斷端骨痂區(qū)可見RFP－BMSC歸巢 a.骨折后14 d冰凍切片大體觀（×12.5），藍(lán)色框表示圖b觀察區(qū)域 b.骨折后14 d冰凍切片熒光示蹤觀察結(jié)果（×200） c.骨折后28 d冰凍切片大體觀（×12.5），藍(lán)色框表示圖d觀察區(qū)域 d.骨折后28 d冰凍切片熒光示蹤觀察結(jié)果（×200） e.骨折后42 d冰凍切片大體觀（×40），骨痂區(qū)（白實(shí)線框內(nèi)）可見RFP－BMSC，而肌肉區(qū)（紅實(shí)線框內(nèi)）及正常骨髓區(qū)（紅虛線框內(nèi)）均未見 f.骨折后42 d骨痂區(qū)熒光示蹤觀察結(jié)果（×200） g.骨折后42 d肌肉區(qū)熒光示蹤觀察結(jié)果（×200） h.骨折后42 d骨髓區(qū)熒光示蹤觀察結(jié)果（×200）

圖4 MSC組免疫熒光觀察結(jié)果（×100），紅色為RFP－BMSC，綠色為目標(biāo)蛋白，藍(lán)色為細(xì)胞核染色，重合圖即為表達(dá)目標(biāo)蛋白的BMSC a1～a4.OCN表達(dá)情況 b1～b4.OPN表達(dá)情況

2.4 生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果

三點(diǎn)彎曲力學(xué)檢測(cè)顯示，造模成功后42 d MSC組最大載荷、最大橈度、彈性橈度及剛度均顯著高于AMD3100組及CON組，與正常骨接近（表1）。

表1 各組造模成功后42 d生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果

圖5 3組術(shù)后14 d（a1、a2、b1、b2、c1、c2）及42 d（d1、d2、e1、e2、f1、f2）病理組織切片觀察結(jié)果

3 討論

骨折愈合包括兩種機(jī)制，即軟骨內(nèi)成骨和骨膜成骨，長(zhǎng)骨愈合以前者多見。軟骨內(nèi)成骨過程中包括MSC的招募、遷移、增殖、分化這一歸巢過程，及隨后的軟骨生成、鈣化成骨。但MSC是如何動(dòng)員并遷移到骨損傷處的機(jī)制目前仍不清楚。有研究［8－9］認(rèn)為損傷后可能有某種分子上調(diào)并釋放入血，從而刺激全身MSC進(jìn)入外周血并遷移至損傷處。細(xì)胞因子和趨化因子很可能在這一過程中有著重要作用。白細(xì)胞靶向遷移至感染及損傷處的分子機(jī)制是趨化因子及其受體結(jié)合［10］，而MSC被發(fā)現(xiàn)可表達(dá)許多趨化因子受體［11－12］，推測(cè) MSC歸巢機(jī)制可能與白細(xì)胞遷移相似。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)［13－14］均已證實(shí)MSC可在趨化因子誘導(dǎo)下發(fā)生遷移，其中以與SDF－1／CXCR4相關(guān)研究最為廣泛。大量研究［15－16］顯示SDF－1／CXCR4通路在 MSC歸巢機(jī)制中具有關(guān)鍵作用，如肝、心、皮膚等損傷時(shí)SDF－1表達(dá)上調(diào)可招募并誘導(dǎo)外周血中表達(dá)相應(yīng)受體CXCR4的MSC向損傷處遷移［17－18］。近年關(guān)于這一通路在骨修復(fù)中的作用報(bào)道［19－20］也逐漸增多。

有研究［21］報(bào)道對(duì)大鼠注射的外源性BMSC 90%在3 d內(nèi)發(fā)生凋亡，且絕大部分停留在其肺部，這可能是由于肺毛細(xì)血管的孔徑小于干細(xì)胞直徑（30μm）所致［22］。但小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中經(jīng)尾靜脈注射的MSC第1天聚集于肺部，3 d后則到達(dá)骨損傷處［19］。而體外實(shí)驗(yàn)［23－24］中，Transwell小室下室內(nèi)的SDF－1仍能誘導(dǎo)上室內(nèi)直徑30μm的BMSC穿過直徑8μm的濾膜孔到達(dá)下室，肺泡屏障應(yīng)該不是阻止BMSC遷移的主要原因。損傷處的高濃度趨化因子可能是動(dòng)員全身干細(xì)胞向損傷處遷移的驅(qū)動(dòng)力，其中SDF－1起到重要作用，其受體CXCR4的阻斷劑可明顯抑制這一過程［20，23］。本實(shí)驗(yàn)通過制備骨折處標(biāo)本的冰凍切片、Hochest33258染色后經(jīng)熒光顯微鏡下觀察到RFP－BMSC經(jīng)尾靜脈注射后第3天到達(dá)骨折端，聚集于骨膜旁，并持續(xù)表達(dá)至第42天。這與文獻(xiàn)［23］報(bào)道骨損傷后SDF－1主要由骨膜分泌一致。本實(shí)驗(yàn)中，AMD3100這一表達(dá)于細(xì)胞表面的CXCR4阻斷劑能明顯抑制BMSC向骨損傷處遷移，證明SDF－1／CXCR4通路在促BMSC歸巢過程中起到重要作用。

病理學(xué)組織切片染色結(jié)果及生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，BMSC可明顯加速骨折愈合過程，提高了新生骨的質(zhì)量及生物力學(xué)性能。冰凍切片熒光示蹤觀察結(jié)果表明BMSC可歸巢到骨折端并存活、增殖。研究提示，SDF－1／CXCR4通路可從多個(gè)層面調(diào)動(dòng)MSC促進(jìn)骨折愈合：利用粒細(xì)胞集落刺激因子（G－CSF）或巨細(xì)胞集落刺激因子（M－CSF）等動(dòng)員骨髓中表達(dá)CXCR4的干細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)血；采集骨髓血體外擴(kuò)增培養(yǎng)并對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行缺氧預(yù)處理使其表面CXCR4表達(dá)水平上調(diào)；增加骨折局部SDF－1水平，促進(jìn)外周MSC歸巢等。

骨折后14、28、42 d，骨折區(qū)可見RFP－BMSC且定位于骨膜區(qū)域骨痂內(nèi)，證明BMSC可通過歸巢、增殖及促進(jìn)骨形成明顯加速骨折愈合，且新生骨具有更好的生物力學(xué)性能，SDF－1／CXCR4通路在歸巢過程中起到重要作用。

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