李　麗，徐　璐，王　琴，李金海，鄧　飛，周莉媛，陳弟詩，張　毅，張　睿（.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川成都6004；.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀0008）

兩種檢測試劑盒對豬瘟抗體水平檢測結(jié)果的比較

李麗1，徐璐2，王琴2，李金海1，鄧飛1，周莉媛1，陳弟詩1，張毅1，張睿1
（1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川成都610041；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀100081）

摘要：選擇一種由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的國產(chǎn)試劑盒與美國IDEXX公司的進口試劑盒對300份豬血清同時進行檢測，結(jié)果顯示，兩種試劑盒的符合率為83.67%；國產(chǎn)試劑盒檢出的陽性率高于進口試劑盒；對檢測結(jié)果不一致的49份血清用熒光抗體病毒中和試驗（FVNT）進行了復(fù)核，國產(chǎn)試劑盒與FVNT的符合率為63.2%，進口試劑盒與FVNT的符合率為31.6%。試驗結(jié)果表明，國產(chǎn)試劑盒具有更高的敏感性，能滿足我國豬瘟抗體監(jiān)測的需要。

關(guān)鍵詞：豬瘟抗體；ELISA檢測試劑盒；FVNT；符合率

豬瘟是困擾我國養(yǎng)豬業(yè)的最主要的疫病之一，由于疫苗的廣泛使用，豬瘟流行形式由過去大面積的高發(fā)多發(fā)變?yōu)榫植康臏睾托偷纳l(fā)。豬瘟抗體檢測是疫苗免疫效果評價主要方法，而ELISA檢測方法又以其操作簡便、方法敏感、檢測樣本量大等優(yōu)點成為豬瘟抗體檢測的主要手段。目前，市場上檢測豬瘟抗體的ELISA試劑盒繁多，主要以進口試劑盒為主。由于進口試劑盒價格昂貴，給基層抗體普查工作造成很大的經(jīng)濟負擔(dān)，因此我們選擇一種國產(chǎn)化豬瘟抗體檢測試劑盒，與進口試劑盒同時對同一批血清樣本進行檢測，并采用豬瘟抗體檢測的“金標準”-熒光抗體病毒中和試驗對檢測結(jié)果有分歧的血清進行定性復(fù)核檢測，通過對檢測結(jié)果的分析，旨在為篩選更適合我國實際需要的豬瘟抗體檢測試劑盒提供更多的數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1PK15傳代細胞系、豬瘟病毒T株、豬瘟病毒熒光抗體：系由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存并提供。

1.2ELISA試劑盒豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒（簡稱國產(chǎn)試劑盒）：由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。批號為20121110。

豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒（簡稱進口試劑盒），購自美國IDEXX公司，批號為A651。

1.3臨床豬血清采自四川省境內(nèi)。其中，商品豬場采集豬瘟疫苗免疫豬血清100份；種豬場采集二免或三免種豬血清140份；四川偏遠地區(qū)采集散養(yǎng)戶的非免疫仔豬血清60份。共計300份。

1.4ELISA試劑盒檢測用國產(chǎn)試劑盒和進口試劑盒同時檢測待檢豬血清，操作方法均嚴格按照試劑盒說明書進行，每份血清重復(fù)2孔。

1.5熒光抗體病毒中和試驗（FVNT）將上述兩種ELISA試劑盒檢測結(jié)果不符合的血清用FVNT進行符合驗證。具體操作方法按照《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》[1]進行。

2　結(jié)果

2.1兩種試劑盒的檢測結(jié)果及符合率在300份血清中，國產(chǎn)試劑盒檢測出豬瘟抗體陽性血清199份，陰性血清78份，可疑23份；進口試劑盒檢測出豬瘟抗體陽性血清184份，陰性血清106份，可疑10份。兩者的符合率為83.67%（符合率= （176+75）/300×100%=83.67%），見表1。

表1　國產(chǎn)試劑盒與進口試劑盒符合率

2.2兩種試劑盒對不同來源豬血清的檢測結(jié)果在臨床采集的豬血清中，有采自商品豬場和種豬場的免疫血清共計240份，散養(yǎng)戶采集的非免疫豬血清60份。在240份免疫血清中，國產(chǎn)試劑盒與進口試劑盒的符合率為80.8%（符合率= （170+24）/240×100%=80.8%），兩者對陽性血清檢測的結(jié)果差異較大。國產(chǎn)試劑盒檢測出陽性血清193份，占免疫血清總數(shù)的80.4%；進口試劑盒檢測出陽性血清156份，占免疫血清總數(shù)的65%。結(jié)果見表2。在60份非免疫血清中，兩種試劑盒的符合率為95%（符合率=（6+51）/60× 100%=95%），均檢測出6份陽性，國產(chǎn)試劑盒檢測出51份陰性，3份可疑，陰性率為85%；進口試劑盒檢測出54份陰性，陰性率為90%，見表3。

表2　兩種試劑盒對免疫血清檢測結(jié)果統(tǒng)計

表3　兩種試劑盒對非免疫血清檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.3FVNT驗證試驗結(jié)果兩種試劑盒檢測結(jié)果差異的血清共計49份，采用熒光抗體病毒中和試驗（FVNT）對有異議的血清進行檢測，結(jié)果是陽性22份，陰性19份，可疑8份。國產(chǎn)試劑盒的檢測結(jié)果是陽性23份，陰性3份，可疑23份，與FVNT的符合率為63.3%（符合率=（21+2+8）/49×100%= 63.3%）；進口試劑盒檢測出陽性8份，陰性31份，可疑10份，與FVNT的符合率為32.7%（符合率（1+13+2）/49×100%=32.7%）。兩種試劑盒與FVNT符合率見表4、表5。

表4　國產(chǎn)試劑盒與FVNT符合率

表5　進口試劑盒與FVNT符合率

3　討論

3.1豬瘟抗體檢測方法目前，國際上推薦的豬瘟抗體檢測方法有過氧化物酶中和試驗（NPLA）、熒光抗體病毒中和試驗（FVNT）和ELISA檢測方法[1]。其中NPLA和FVNT采用的原理相近，需將血清與一定量的病毒孵育后接種敏感細胞，檢測的是中和抗體，二者被認為是檢測豬瘟抗體的“金標準”。這兩種檢測方法對實驗室條件及操作人員要求很高，并且耗時長（至少3 d），因此，不適合進行大量樣本的檢測。除了NPLA、FVNT這兩種以外，我國使用的體外檢測豬瘟抗體的方法還有正向間接血凝（IHA）、免疫金標快速檢測技術(shù)、瓊脂擴散試驗（AGP）、抗體芯片技術(shù)等[2]。其中IHA依據(jù)肉眼判斷結(jié)果，易受主觀因素影響；免疫金標檢測只能做定性判斷并且在大量檢測樣本時不及ELISA方便；瓊擴試驗雖操作簡單但敏感性差；抗體芯片技術(shù)的自動化檢測結(jié)果可靠但儀器設(shè)備要求很高，不適合基層；而ELISA方法則以更為簡便，易操作，檢測樣本量大，敏感性高，特異性好等優(yōu)勢更適合田間的大范圍推廣應(yīng)用。

3.2ELISA試劑盒的研發(fā)原理基于不同的研發(fā)原理，不同的試劑盒在特異性和敏感性上可能會有所差異。目前，較為常用的ELISA試劑盒為進口的阻斷ELISA試劑盒。該試劑盒采用阻斷ELI?SA原理，以豬瘟病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白進行包被，將待檢血清加入后進行孵育反應(yīng)，特異性抗體能夠?qū)⑻囟ǖ谋砦贿M行結(jié)合封閉，當(dāng)再加入辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體后，所呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)與特異性抗體含量成反比。由于在該種方法中使用的是特異性的單克隆抗體，因此該方法檢測的陽性抗體為針對單一表位的抗體，所以有更好的特異性。本試驗中選用的國產(chǎn)試劑盒是采用間接ELISA原理，同樣以豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白作為包被抗原，將待檢血清加入后進行孵育反應(yīng)，然后加入酶標二抗進行顯色，所呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)亦與特異性抗體含量成正比[3]。間接ELISA方法檢測對象為針對包被蛋白所有的陽性抗體，因此，該方法有更好的敏感性。

我們采用兩種試劑盒共同對300份血清樣本進行了檢測，結(jié)果兩者的符合率為83.67%。通過對血清的免疫背景進行分析后發(fā)現(xiàn)，國產(chǎn)試劑盒檢測免疫血清的陽性率高出進口試劑盒15個百分點，說明國產(chǎn)試劑盒較進口試劑盒有更高的敏感性。在對非免疫血清的檢測結(jié)果中，進口試劑盒較國產(chǎn)試劑盒陰性率高出5個百分點，因此說明進口試劑盒較國產(chǎn)試劑盒有更高的特異性。這一結(jié)果正是由于兩種試劑盒的研發(fā)原理不同而造成的。

3.3兩種試劑盒與“金標準”的符合率在檢測的300份血清中，兩種試劑盒檢測結(jié)果有差異的血清共計49份，將49份血清進行FVNT定性檢測。結(jié)果國產(chǎn)試劑盒與FVNT的符合率高出進口試劑盒30個百分點，因此說明，國產(chǎn)試劑盒較進口試劑盒更接近“金標準”的檢測結(jié)果，所得到的結(jié)果更為準確。

3.4國產(chǎn)試劑盒更適合我國的抗體監(jiān)測工作在本研究中，國產(chǎn)試劑盒檢測免疫血清的陽性率為80.4%，而進口試劑盒僅為65%。在農(nóng)業(yè)部每年發(fā)布的《國家動物疫病監(jiān)測計劃》中，要求免疫豬群陽性率≥70%才能能判為群體免疫合格。按照這一標準，采用國產(chǎn)試劑盒進行檢測，則該群體為免疫合格群；若采用進口試劑盒進行檢測，則該群體為不合格群。因此，在進行豬瘟抗體監(jiān)測時，要慎重選擇檢測試劑盒，否則會對免疫效果的評價造成很大影響。本研究所采用的國產(chǎn)試劑盒的敏感性高，雖然在特異性上稍遜于進口試劑盒[4]，但根據(jù)國產(chǎn)試劑盒的說明，檢測結(jié)果可疑血清可被判定為陰性。如按照這一標準，兩種試劑盒的特異性相當(dāng)。因此我們認為，國產(chǎn)試劑盒具有良好的敏感性與特異性，操作簡便，質(zhì)量可靠，更適合在我國的抗體監(jiān)測工作。

參考文獻：

[1]世界動物衛(wèi)生組織.陸生動物診斷試驗和疫苗手冊（哺乳動物、禽鳥與蜜蜂）[M].農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局/中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，譯.5版.2004．

[2]李振.豬瘟實驗室抗體檢測技術(shù)[J].當(dāng)代畜牧，2012，2：17-18.

[3] John R . Crowther，the ELISA guide book[M] . 2001：Humana Press.

[4]徐璐，范學(xué)政，徐和敏.豬瘟抗體間接ELISA檢測試劑盒方法的建立研制和應(yīng)用優(yōu)化[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，48（9）：21-24.

通訊作者：徐璐，E-mail：421203912@qq.com

作者簡介：李麗（1985-），女，獸醫(yī)師，碩士，從事動物疫病防控工作，E-mail：365087955@qq.com

收稿日期：2014-05-15

中圖分類號：S858.28

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0080- 03