劉婷婷，謝芝勛，宋德貴，羅思思，謝麗基，李　孟，謝志勤，鄧顯文（.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林54000；.廣西獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧53000）

H3亞型禽流感病毒二溫式RT- PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

劉婷婷1，謝芝勛2，宋德貴1，羅思思2，謝麗基2，李孟2，謝志勤2，鄧顯文2
（1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林541000；
2.廣西獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

摘要：為建立快速、準(zhǔn)確檢測H3亞型禽流感病毒（AIV）的方法，根據(jù)GenBank中H3亞型AIV HA基因序列，設(shè)計(jì)出1對特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了H3亞型AIV二溫式RT-PCR檢測方法。對該法進(jìn)行特異性、敏感性檢測，并對256份臨床樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，該法只能擴(kuò)增H3亞型AIV，對其他亞型AIV及常見禽病病原體不擴(kuò)增；對H3亞型AIV檢測下限為1×104拷貝/μL；256份臨床樣品檢測結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果一致。與普通RT-PCR相比該法節(jié)省了30 min，表明所建立的H3亞型AIV二溫式RT-PCR方法是一種快速、簡便和特異的檢測方法。

關(guān)鍵詞：H3亞型AIV；二溫式RT-PCR；檢測

Corresponding author：XIE Zhi-xun

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的家禽及野生禽類感染及疾病的總稱[1]，其感染范圍很廣，幾乎所有的野生及家養(yǎng)禽類均可感染。根據(jù)AIV的致病性強(qiáng)弱可分為高致病性和低致病性AIV，以H5N1、H7N7亞型毒株為代表的高致病性AIV可以感染人并致人死亡。低致病性AIV在禽類體內(nèi)只表現(xiàn)輕微癥狀或不發(fā)病，往往不引起人們的廣泛關(guān)注，直至1999年的香港H9N2亞型AIV感染人的事件才引起世界對低致病性AIV的關(guān)注。越來越多的研究報(bào)道表明，低致病性AIV可為高致病性AIV提供基因片段造成對人類的感染[2]。H3亞型AIV為低致病性AIV，在家禽中分離率較高且在不同家禽中分布的季節(jié)性與我國人群中流感病毒流行的季節(jié)性比較一致[3-4]，這為禽-人兩種宿主的流感病毒在豬這個(gè)“混合器”中發(fā)生基因重組提供了條件。1968年暴發(fā)的香港流感病毒A/HongKong/68（H3N2）經(jīng)研究證實(shí)就是由人的H2N2亞型流感病毒與H3亞型AIV的HA基因重組得來[5]。因此，加強(qiáng)對H3亞型AIV的監(jiān)測對養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生都有重要意義。長期以來，針對AIV的檢測主要依靠傳統(tǒng)血清學(xué)，耗時(shí)費(fèi)力，具有一定的局限性。二溫式RTPCR是根據(jù)常規(guī)RT-PCR技術(shù)原理改進(jìn)而成，其將退火和延伸合并為同一個(gè)溫度，即變性和退火-延伸溫度，增強(qiáng)了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。因此二溫式RT-PCR是一種簡單、快速、特異的技術(shù)，但至今未見有二溫式RT-PCR檢測H3亞型AIV的報(bào)道。為此，本研究針對H3亞型AIV設(shè)計(jì)了二溫式RT-PCR檢測方法，旨在為H3亞型AIV感染的診斷提供快速、簡便的方法。

1　材料與方法

1.1毒株H1、H3、H4、H6、H9亞型AIV由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，H5、H7亞型AIV RNA為美國賓夕法尼亞州立大學(xué)禽病診斷研究室惠贈，新城疫病毒（NDV）F48E9株、傳染性支氣管炎病毒（IBV）H52株、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）北京株、雞毒支原體（MG）S6株及禽呼腸孤病毒（ARV）S1733株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑DNA/RNA抽提試劑盒、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、5×AMV Buffer、dNTP、RNA酶抑制劑、pMD-18T載體，均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自廣州東盛生物科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix，購自Invitrogen公司。

1.3其他SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；PCR儀為美國Perkin Elmer Cetus公司生產(chǎn)的PE9600儀。

1.4引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中H3亞型AIV HA基因的保守核苷酸序列，利用Primer 5.0軟件以已上傳的H3序列為模板（登錄號：CY100443）設(shè)計(jì)合成1對特異性引物，由Invitrogen公司合成。引物序列信息如表1。

表1　引物序列信息

1.5病毒RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄參照DNA/RNA抽提試劑盒說明書抽提ILTV、MG的DNA，同時(shí)提取各亞型AIV及NDV、IBV和ARV的RNA，并用隨機(jī)引物（9mer）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,將反轉(zhuǎn)錄的cDNA，置-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6標(biāo)準(zhǔn)品的制備對H3亞型AIV HA基因全長進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行膠回收，將回收產(chǎn)物連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化平板上的重組菌，提取重組菌質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定，并將陽性的克隆質(zhì)粒送至Invitrogen公司進(jìn)行序列測定。

1.7二溫式PCR條件的優(yōu)化采用25 μL反應(yīng)體系：12.5 μL 2×PCR Master Mix、0.5 μL 25 pmol/μL引物H3-F和H3-R、2 μL cDNA、以ddH2O補(bǔ)足25 μL，瞬時(shí)離心。根據(jù)引物Tm值，將退火溫度按60℃～68℃依次遞增，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)確定最佳退火溫度。

1.8二溫式PCR的特異性試驗(yàn)利用本研究優(yōu)化后的二溫式PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增5株分離的H3亞型AIV核苷酸作為陽性對照，同時(shí)擴(kuò)增H1、H4、H5、H6、H7、H9亞型AIV、NDV、IBV、ILTV、MG、和ARV的核苷酸，檢測其特異性。

1.9二溫式PCR的敏感性試驗(yàn)對H3亞型AIV HA基因測序正確的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，使其濃度為1×107～1×102拷貝/μL，用二溫式RT-PCR方法分別對1×107～1×102拷貝/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察該方法敏感度。

1.10臨床樣品檢測對256份（其中雞、鴨、鵝和鴿子分別為63、98、46、49份)從廣西南寧市活禽市場采集的咽喉和泄殖腔拭子反復(fù)擠壓、清洗，從中抽提病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用所建立的二溫式RT-PCR方法進(jìn)行檢測。同時(shí)對這256份樣品進(jìn)行抗生素處理后，用雞胚法分離病毒，通過HA、HI試驗(yàn)驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

2　結(jié)果與分析

2.1二溫式PCR條件的優(yōu)化通過對二溫式PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定PCR反應(yīng)模式為：94℃4 min；94℃40 s，65℃50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃結(jié)束。其PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2.2特異性試驗(yàn)特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，只有H3亞型AIV有特異性條帶出現(xiàn)，大小為548 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）；而其他亞型AIV和禽呼吸道疾病病毒均未擴(kuò)增出對應(yīng)條帶，說明該方法特異性強(qiáng)。

2.3敏感性試驗(yàn)利用本研究優(yōu)化好的二溫式RT-PCR反應(yīng)條件對濃度為1×107～1×102拷貝/μL 的H3亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增，如圖2所示，1× 107～1×104拷貝/μL的H3亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)明顯擴(kuò)增條帶，片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，表明本研究建立的H3亞型AIV二溫式RT-PCR檢測方法最低能檢測到1×104拷貝/μL H3亞型AIV。

圖1　二溫式RT- PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖2　二溫式PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4臨床樣品檢測在廣西南寧市256份活禽市場樣品中，二溫式RT-PCR檢測結(jié)果有19份呈現(xiàn)H3亞型AIV陽性；病毒分離鑒定結(jié)果為19份陽性樣品。表明所建立的二溫式RT-PCR檢測結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果一致。圖3為部分臨床樣品檢測結(jié)果。

圖3　部分臨床樣品檢測結(jié)果

3　討論

AIV是分節(jié)段的病毒，由于RNA聚合酶保真性低，其基因組變異率很高，當(dāng)同一宿主同時(shí)感染多種亞型的AIV，不同毒株間可能會發(fā)生基因片段的重組，產(chǎn)生新的AIV亞型的病毒，其對人類的危害不可預(yù)測。H3亞型AIV是低致病性的，在水禽身上隱性攜帶，并未引起人們的廣泛關(guān)注，但有研究表明，H3亞型AIV可能跨越種屬屏障直接感染人[9-10]，因此，建立一種針對H3亞型AIV的快速、準(zhǔn)確的檢測方法顯得十分必要。

本研究二溫式RT-PCR是在普通RT-PCR基本原理基礎(chǔ)上建立的，并參考相關(guān)文獻(xiàn)優(yōu)化了反應(yīng)條件[11-13]。與常規(guī)RT-PCR相比，本研究所建立的二溫式RT-PCR方法節(jié)省約30 min；特異性試驗(yàn)表明，該二溫式RT-PCR只能擴(kuò)增出H3亞型AIV，而對其他亞型AIV及其他禽呼吸道疾病病原體不擴(kuò)增，具有高度特異性；敏感性試驗(yàn)也表明該方法高度敏感，能檢測到1×104拷貝/μL的質(zhì)粒；臨床樣品檢測結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果一致，證明了該方法的有效實(shí)用性。因此本研究所建立的H3亞型AIV二溫式PCR方法具有簡便、快速、特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)，為H3亞型AIV快速檢測提供了新方法。

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Dule- temperature RT- PCR for diagnosis of H3 Subtype Avian Influenza Virus

LIU Ting-ting1，XIE Zhi-xun2，SONG De-gui1，LUO Si-si2，XIE Li-ji2，LI Meng2，XIE Zhi-qin2，DENG Xian-wen2
（1.Guangxi Normal University，College of life science，Guilin 541000，China；2.Guangxi Veterinary
Research Institute，Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccines and New Technology，Nanning 530001，China）

Abstract：In order to establish a rapid and accurate method to detect H3 subtype avian influenza virus（AIV），a pair of specif?ic primer were designed according to the sequences of the hemagglutinin（HA）genes of H3 subtype AIV in GenBank.Then the re?action conditions were optimized and a Dule-temperature RT-PCR was established.The results showed that this Dule-temperature RT-PCR was only specific for the H3 subtype AIV without amplification of the other viruses.The detection limit of Dule-tempera?ture RT-PCR was 1×104copies/uL.Clinical samples test were accorded with the viral isolation completely.The detection time was reduced about 30 min than the routine PCR.These results indicated the method is rapid，simple and specific for the detection of H3 subtype AIV.

Key words：H3 subtype AIV；dule-temperature PCR；detection

通訊作者：謝芝勛，E-mail：xiezhixun@126.com

作者簡介：劉婷婷（1988-），女，碩士，研究方向?yàn)閯游锷鷳B(tài)學(xué)，E-mail：lttyy8849@163.com

基金項(xiàng)目：廣西特聘專家專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（2011B020）；廣西科技攻關(guān)重大專項(xiàng)（1222003-2-4）；廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（13-051-27-A-2）；廣西基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（14-1）共同資助

收稿日期：2014-07-23

中圖分類號：S854.43

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0014- 03