寧　康，王　丹，王府民，劉　寧，張　冰，張大丙（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)與人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀100193）

櫻桃谷北京鴨短喙和侏儒綜合征的初步研究

寧康，王丹，王府民，劉寧，張冰，張大丙
（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)與人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀100193）

摘要：2014年1月至今，我國(guó)部分地區(qū)所飼養(yǎng)的櫻桃谷北京鴨商品肉鴨發(fā)生了一種疾病。為診斷該病，從1個(gè)38日齡感染鴨群選典型病例和外觀正常者各9只，對(duì)其體重、喙和舌頭進(jìn)行了測(cè)量和分析，隨后進(jìn)行了分子檢測(cè)和人工感染試驗(yàn)。結(jié)果顯示，典型病例的體重（1.40±0.51 kg）和喙長(zhǎng)（4.00±0.26 cm）與外觀正常者（2.87±0.51 kg和5.74±0.58 cm）存在顯著差異，提示該病具有半番鴨短喙和侏儒綜合征（Short beak and dwarfism syndrome，SBDS）的特征，即喙短、舌頭伸出、生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受阻。用水禽細(xì)小病毒的PCR進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，從37日齡病例采集的36份組織樣品均為小鵝瘟病毒（Goose parvovirus，GPV）陽(yáng)性。用VP1和VP3序列進(jìn)行進(jìn)化分析的結(jié)果均顯示，櫻桃谷北京鴨源毒株與導(dǎo)致半番鴨SBDS的毒株聚為一個(gè)分支，二者屬GPV的同一類變異株。用GPV陽(yáng)性樣品感染2日齡北京鴨，可復(fù)制出與自然病例相似的短喙癥狀。結(jié)果表明，GPV變異株與櫻桃谷北京鴨SBDS相關(guān)。

關(guān)鍵詞：櫻桃谷北京鴨；短喙和侏儒綜合征；鵝細(xì)小病毒

Corresponding authors：ZHANG Da-bing；ZHANG Bing

短喙和侏儒綜合征（Short beak and dwarfism syndrome，SBDS）是危害半番鴨的一種病毒性疾病，以喙短、舌頭伸出、生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受阻為特點(diǎn)。在發(fā)病群體，約10%～30%的鴨只受影響。該病于1971-1972年在法國(guó)首次報(bào)道，1997年，在波蘭的半番鴨中也發(fā)生了該病。2009年，匈牙利研究者Palya等對(duì)法國(guó)的半番鴨SBDS病例進(jìn)行了病毒分離和鑒定，確定病原為鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）的變異株[1]。

1989-1990年間，在我國(guó)臺(tái)灣曾發(fā)生過(guò)一種發(fā)病率和死亡率均很高（86%～100%）的急性傳染病。據(jù)報(bào)道，番鴨、北京鴨、半番鴨、臺(tái)灣菜鴨（Tsaiya duck）以及白改鴨（Kaiya ducks）等不同品種的鴨均可發(fā)病，感染后的存活鴨表現(xiàn)出與半番鴨SBDS類似的癥狀。研究者認(rèn)為，該病是由鴨肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）混合感染所致，但用SPF鴨進(jìn)行實(shí)驗(yàn)感染試驗(yàn)，只有1株MDPV（902193株）可復(fù)制出SBDS的癥狀[2]。

2014年1月以來(lái)，我國(guó)部分地區(qū)所飼養(yǎng)的櫻桃谷北京鴨商品肉鴨發(fā)生了一種疾病，從臨床癥狀看，該病與半番鴨SBDS極為相似。在感染群體，10%～60%的鴨子受到影響，因此，該病的發(fā)生和流行對(duì)我國(guó)肉鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。針對(duì)這一現(xiàn)狀，筆者開(kāi)展了研究工作，初步研究結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1流行病學(xué)和臨床特征調(diào)查2015年，某公司送檢6只37日齡櫻桃谷北京鴨商品肉鴨病例。筆者對(duì)其外觀進(jìn)行了檢查，并經(jīng)剖檢觀察了內(nèi)臟組織的大體病變。為了解疾病對(duì)鴨只體重、喙和舌頭的影響程度，從發(fā)病群體選典型病例（短喙、舌頭伸出）和外觀較為正常的鴨（短喙不明顯、舌頭未伸出）各9只，測(cè)量其體重、喙長(zhǎng)、喙寬、舌長(zhǎng)和舌寬。測(cè)量時(shí)，鴨只日齡為38日齡。獲得數(shù)據(jù)后，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用Prism 6.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。隨后，采用現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研以及與不同地區(qū)養(yǎng)鴨企業(yè)進(jìn)行溝通等方式，對(duì)疾病發(fā)生和流行的范圍、發(fā)病率、死亡率以及臨床特征進(jìn)行了調(diào)查。

1.2樣品采集與處理剖檢時(shí)，取組織樣品，用于PCR檢測(cè)。從6只鴨子采集組織樣品36份，包括心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腔上囊和胸腺各6份，按1∶5的比例加入0.9%生理鹽水（含1%雙抗）磨成勻漿，用12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm濾器過(guò)濾，收獲濾液，置-80℃保存。

1.3細(xì)菌分離無(wú)菌蘸取肝組織，分別接種于胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic soy agar，TSA）和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.4 PCR檢測(cè)取200 μL濾液，用組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取DNA，用Chang等（2000）報(bào)道的水禽細(xì)小病毒引物和條件[3]進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增539 bp 的VP3基因。此外，設(shè)計(jì)引物對(duì)F2512（5′-GAGCCCCTCAGCCAAAA CCAAACC- 3′）和R3156（5′-TGGTCTTTGTGATGACTGTGTTTC- 3′），以擴(kuò)增VP1基因，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為645 bp，反應(yīng)條件按Chang等（2000）的報(bào)道[3]。

建立25 μL反應(yīng)體系，包括DNA 5 μL、2×Taq PCR Master Mix（南京諾維贊生物科技有限公司）12.5 μL、上游引物和下游引物各2 μL、ddH2O 3.5 μL。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢查。

1.5測(cè)序和序列分析用EasyPure?Quick Gel Extraction Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）純化回收PCR產(chǎn)物，連接于pGEM?-T Easy Vector（美國(guó)Promega公司），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，取菌液進(jìn)行鑒定后，選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

從645 bp VP1序列中截取443 bp序列，去掉539 bp VP3序列中的引物序列、截取495 bp序列。用BLASTx在GenBank中進(jìn)行序列相似性檢索。從GenBank下載部分GPV分離株的對(duì)應(yīng)VP1 和VP3序列作為參考序列，用CLUSTALW（http:// www.genome.jp/tools/clustalw/）進(jìn)行在線比對(duì)，以獲得所測(cè)序列之間及其與參考序列的同源性，用MEGA 5.0軟件[4]進(jìn)行進(jìn)化分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)時(shí)，用MDRV FM株作為參照。各參考毒株的序列登錄號(hào)見(jiàn)進(jìn)化樹(shù)。

1.6病毒分離取PCR陽(yáng)性肝臟、脾臟和腎臟樣品各1份，作為接種材料，各用5枚12日齡鵝胚、經(jīng)尿囊腔途徑接種進(jìn)行病毒分離，每枚胚接種0.2 mL濾液，接種后，將鵝胚置38℃培養(yǎng)，觀察14 d。在接種后120～140 h收獲尿囊液、絨毛尿囊膜和內(nèi)臟，制成勻漿，按1.2方式進(jìn)行處理，取濾液進(jìn)行傳代，共傳3代，以VP3為靶基因，按1.4方式對(duì)各代次培養(yǎng)物進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.7動(dòng)物感染試驗(yàn)因病毒分離效果不理想，故選取PCR陽(yáng)性樣品進(jìn)行感染試驗(yàn)。預(yù)先按文獻(xiàn)[5]思路對(duì)其他常見(jiàn)水禽病原進(jìn)行排除，包括禽流感病毒、新城疫病毒、鴨瘟病毒、坦布蘇病毒、鴨甲肝病毒、鴨星狀病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨圓環(huán)病毒和產(chǎn)蛋下降綜合征病毒。

選2日齡北京鴨40只，隨機(jī)分為兩組，每組20只，一組為接種組，經(jīng)口服途徑接種0.5 mL濾液，一組為對(duì)照組，接種等體積生理鹽水，置于隔離器中隔離飼養(yǎng)，每日觀察，觀察2周，分別于接種后6 d和12 d測(cè)量?jī)山M鴨的體重和喙長(zhǎng)。

2　結(jié)果

2.1流行病學(xué)和臨床特征2014年年初，該病在江蘇出現(xiàn)，隨后以較慢的速度向鄰近地區(qū)擴(kuò)散，迄今為止，該病先后在安徽、山東以及河北等地發(fā)生和流行。在發(fā)生過(guò)疾病的鴨場(chǎng)，再次引進(jìn)雛鴨時(shí)，會(huì)再次發(fā)病。用抗菌藥物治療無(wú)效，疾病發(fā)生與否與雛鴨來(lái)源和所用飼料無(wú)相關(guān)性。

該病主要發(fā)生于櫻桃谷北京鴨商品肉鴨，病鴨主要表現(xiàn)為喙短、舌頭伸出、發(fā)育嚴(yán)重受阻（見(jiàn)中插彩版圖1），在感染鴨群，典型病例的比例多為10%～30%，嚴(yán)重者亦可達(dá)50%～60%，死亡率很低，或可忽略不計(jì)。據(jù)農(nóng)戶介紹，在雛鴨5～6日齡時(shí)，即可見(jiàn)部分鴨子不愿行走，至9～10日齡時(shí)，可觀察到部分鴨只生長(zhǎng)遲緩，隨后便可觀察到短喙病例，在3周齡后，鴨群中短喙和生長(zhǎng)不良癥狀更加明顯。常見(jiàn)部分鴨只腿骨斷裂、不能行走。至40日齡左右出欄時(shí)，體重輕者只有1 kg左右，屠宰時(shí)可見(jiàn)腿骨和翅膀易折斷，比例可達(dá)30%～40%。

剖檢病鴨，未見(jiàn)內(nèi)臟器官有特征性病理變化，個(gè)別病鴨有心包積液、腿肌和胸肌出血、胸腺腫大并伴有出血點(diǎn)等病變。

如表1和表2所示，在外觀正常組中，6只鴨的體重位于正常水平（3.1～3.3 kg），僅3只鴨的體重（2～2.6 kg）比正常水平略低，而典型病例的體重均低于正常水平，其中8只鴨的體重僅為0.8～1.7 kg，兩組體重平均值分別為1.40±0.51 kg 和2.87±0.51 kg，差異極顯著（P<0.01）。典型病例的喙長(zhǎng)4.00±0.26 cm明顯短于外觀正常組5.74± 0.58 cm，差異極顯著（P<0.01）。就舌頭寬度而言，典型病例組1.88±0.21 cm與外觀正常組2.14± 0.21 cm亦存在顯著差異（P<0.05）。兩組間喙寬和舌長(zhǎng)差異不顯著（P>0.05）。

2.2細(xì)菌分離培養(yǎng)24 h后，在TSA和麥康凱平板上均未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3PCR檢測(cè)針對(duì)水禽細(xì)小病毒的VP1和VP3進(jìn)行PCR檢測(cè)，從36份（100%）樣品中均擴(kuò)增出預(yù)期長(zhǎng)度的條帶，圖2表示從1只37日齡病例不同組織樣品（心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腔上囊和胸腺）檢出VP3基因的結(jié)果。

表1　38日齡外觀正常鴨體重、喙和舌頭的測(cè)量

表2　38日齡典型病例體重、喙和舌頭的測(cè)量

圖2　1只37日齡病例不同組織樣品中GPV VP3基因的擴(kuò)增

2.4序列同源性分析和進(jìn)化分析測(cè)定了11份陽(yáng)性樣品的645 bp和539 bp擴(kuò)增產(chǎn)物序列，BLASTx結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為GPV的VP1和VP3基因。Clusat W結(jié)果顯示，在443 bp VP1和495 bp VP3區(qū)，所測(cè)毒株之間的核苷酸序列同源性均為100%，與GPV參考毒株對(duì)應(yīng)序列的核苷酸同源性分別為95%～99%和96%～99%，與導(dǎo)致半番鴨SBDS的毒株的同源性均為99%。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，在443 bp VP1（圖3A）和495 bp VP3（圖3B）區(qū)，所測(cè)毒株均與導(dǎo)致半番鴨SBDS的毒株聚類，形成一個(gè)小分支。

2.5病毒分離用3份PCR陽(yáng)性樣品接種鵝胚后，僅在接種脾臟樣品后96～144 h致死2枚鵝胚，用GPV VP3特異性PCR進(jìn)行檢測(cè)，3份樣品的3個(gè)代次培養(yǎng)物均為弱陽(yáng)性。

圖3　小鵝瘟病毒的進(jìn)化分析

2.6動(dòng)物感染試驗(yàn)接種GPV陽(yáng)性樣品后5 d，可觀察到臨床癥狀，病鴨主要表現(xiàn)出站立不穩(wěn)、喜臥、腿瘸等癥狀，先后有6只鴨（30%）表現(xiàn)出明顯的癥狀。在接種后5～11 d，共死亡3只（15%），病鴨和死亡鴨體型明顯小于對(duì)照組或同群未表現(xiàn)癥狀者。在觀察期，未見(jiàn)對(duì)照組表現(xiàn)出臨床癥狀。

在接種后6 d和12 d，接種組中分別有9只和7只鴨表現(xiàn)出較明顯的短喙和生長(zhǎng)不良癥狀，與同組中外觀正常者以及對(duì)照組相比，體重和喙長(zhǎng)差異均極顯著（P<0.01），但接種組中外觀正常者與對(duì)照組之間體重和喙長(zhǎng)的差異均不顯著（P> 0.05）（表3）。

3　討論

在我國(guó)部分地區(qū)所發(fā)生的櫻桃谷北京鴨疾病具有半番鴨SBDS的特征臨床表現(xiàn)，可將該病稱為櫻桃谷北京鴨短喙和侏儒綜合征。測(cè)量結(jié)果顯示，病毒感染對(duì)喙的影響極大，但對(duì)舌頭尺寸的影響較小。即感染發(fā)生后，舌頭并未變大，而是雙喙長(zhǎng)度顯著短于正常水平，使得舌頭露于喙外。事實(shí)上，舌頭尺寸不僅未變大，反而因長(zhǎng)期露于喙外，導(dǎo)致舌尖下垂，舌頭還略有萎縮。因此，養(yǎng)殖戶所稱的“大舌頭病”或“長(zhǎng)舌頭病”并不準(zhǔn)確。結(jié)合調(diào)研結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[1]，可見(jiàn)病毒感染多發(fā)生于1周齡內(nèi)，因此，病毒感染可能影響了鴨喙的發(fā)育。在自然病例中，常見(jiàn)部分腿瘸的病例，在實(shí)驗(yàn)感染試驗(yàn)中，亦復(fù)制出腿瘸的癥狀，這一結(jié)果提示，病毒感染可能對(duì)鴨的骨骼發(fā)育亦產(chǎn)生了影響。

表3　實(shí)驗(yàn)感染鴨只與對(duì)照組的體重、喙的比較

對(duì)于典型病例而言，其體重亦受到極大的影響。因鴨只生長(zhǎng)發(fā)育受阻，可造成1.1～1.5元/只的直接經(jīng)濟(jì)損失。此外，在屠宰時(shí)，鴨腿骨和翅膀易折斷，鴨頭、鴨舌等副產(chǎn)品的質(zhì)量亦受到影響，還可造成0.3～0.5元/只左右的直接經(jīng)濟(jì)損失。由此可見(jiàn)，該病的發(fā)生和流行對(duì)我國(guó)部分地區(qū)櫻桃谷北京鴨商品肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)所造成的經(jīng)濟(jì)損失不可小視。

根據(jù)細(xì)菌分離結(jié)果，可以排除細(xì)菌病的可能。所采集的組織樣品均呈GPV核酸陽(yáng)性，提示疾病與GPV感染之間的相關(guān)性。序列同源性分析和進(jìn)化分析結(jié)果證實(shí)，從櫻桃谷北京鴨病例中所檢出的GPV與導(dǎo)致半番鴨SBDS的GPV毒株具有相近的遺傳演化關(guān)系，在進(jìn)化樹(shù)中位于同一個(gè)小分支，屬于GPV的同一類變異株。

據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道，經(jīng)尿囊腔接種10～15日齡鵝胚是分離GPV的適宜途徑，但目前種鵝普遍接種GPV弱毒疫苗，鵝胚中必然含有母源抗體，因此，本試驗(yàn)在3個(gè)代次鵝胚培養(yǎng)物均只檢出弱陽(yáng)性結(jié)果，可能與母源抗體的影響有關(guān)。鑒于此，筆者改用GPV陽(yáng)性樣品進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在排除其他

常見(jiàn)水禽病原后，接種GPV陽(yáng)性樣品可復(fù)制出與自然病例相似的癥狀，據(jù)此可認(rèn)為，櫻桃谷北京鴨發(fā)生SBDS與GPV變異株有關(guān)。病毒分離工作仍在進(jìn)行中，用較高滴度的GPV分離株進(jìn)行感染試驗(yàn)，將有助于得出更確實(shí)的結(jié)論。

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Preliminary studies on short beak and dwarfism syndromeof Cherry Valley Pekin duck

NING Kang，WANG Dan，WANG Fu-min，LIU Ning，ZHANG Bing，ZHANG Da-bing
（Key Laboratory of Animal Epidemiology and Zoonosis，Ministry of Agriculture，College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Abstract：From January 2014 to the present，a disease occurred in commercial Cherry Valley Pekin ducks in some regions of China.For the purpose of diagnosis，the body weight and beak size were measured and analyzed for 9 typical cases and 9 apparent?ly healthy ducks collected from a 38-day-old diseased population.Subsequently，molecular detection and experimental infections were performed.The body weight（1.40±0.51 kg）and mean length of beaks（4.00±0.26 cm）of the typical cases significantly differ?ent from those（2.87±0.51 kg and 5.74±0.58 cm）of the apparently healthy ducks，suggesting that the disease had characteristics of short beak and dwarfism syndrome（SBDS）of mule duck，which is characterized by strong growth retardation with smaller beak and protruding tongue.Using a pan-waterfowl parvovirus PCR assay，thirty-six samples were collected from 37-day-old diseased ducks were tested positive for goose parvovirus（GPV）.Phylogenetic analyses of partial VP1 and VP3 sequences revealed that the GPV strains in this study were grouped together with previously known GPVs from SBDS of mule duck and belonged to a distinct clade of GPV-related group . The signs of SBDS could be reproduced by inoculation of a GPV-positive sample in two-day-old Pekin ducklings.These investigations demonstrated that the disease was associated with the GPV variant.

Key words：Cherry Valley Pekin duck；Short beak and dwarfism syndrome；Goose parovirus

通訊作者：張大丙，E-mail：zdb@cau.edu.cn；張冰，E-mail：zhangdb@cau.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：寧康（1989-），男，博士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物分子病毒學(xué)，E-mail：ningkang@cau.edu.cn

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-43）

收稿日期：2015-05-01

中圖分類號(hào)：S852.65+9.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2015）10- 0007- 04