楊秋明，李靖雅，肖安風(fēng)，陳　俊

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

福建 廈門(mén) 361021；3.廈門(mén)市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361021；

4.廈門(mén)南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021)

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柚皮中柚皮苷和類(lèi)檸檬苦素的提取及分離純化

楊秋明1,2,3,4，李靖雅1，肖安風(fēng)1,2,3,4，陳俊1,2,3,4

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

福建 廈門(mén) 361021；3.廈門(mén)市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361021；

4.廈門(mén)南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021)

[摘要]用熱水煮提法提取出柚皮中柚皮苷和類(lèi)檸檬苦素等大量苦味活性物質(zhì)，通過(guò)靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)，篩選出具有較大吸附和解吸率的D101大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，得出最優(yōu)的吸附條件：樹(shù)脂添加量3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，25 ℃恒溫條件下?lián)u床以180 r/min振蕩90 min.在此條件下，柚皮苷和檸檬苦素吸附率都達(dá)到100%.吸附完全后進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫，洗脫液再通過(guò)萃取和重結(jié)晶后可有效分離純化柚皮苷和檸檬苦素類(lèi)似物，純化后的樣品用HPLC法測(cè)得柚皮苷純度達(dá)到95.8%，用紫外分光光度法測(cè)得檸檬苦素類(lèi)似物純度達(dá)到90.9%.

[關(guān)鍵詞]柚皮苷；檸檬苦素類(lèi)似物；大孔吸附樹(shù)脂；分離純化

0引言

柚皮苷(4,5,7-trihydroxy flavanone-7-β-L-rhamnoglucoside-(1,2)-α-D-glucopyranoside)是一種二氫黃酮糖苷類(lèi)化合物，它是蕓香科植物如葡萄柚、蜜柚、酸橙等的主要苦味物質(zhì)[1].常溫下的柚皮苷在水中的溶解度為1 g/L，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸、稀堿溶液及熱水.檸檬苦素(Limonin)類(lèi)化合物是三萜系后苦味化合物[2-3]，主要存在于蕓香科植物果實(shí)中，易溶于溶酯性有機(jī)溶劑，難溶于水，在甲醇、乙醇中溶解度較大.

柚皮苷作為柚汁當(dāng)中的主要苦味物質(zhì)，具有很高的藥用價(jià)值.柚皮苷生物活性高，具有很好的抗氧化作用[4]，對(duì)致突變性具有抑制作用[5-7]，具有抗癌防癌等功能[8-11].因此，在醫(yī)藥工業(yè)上，柚皮苷可用于生產(chǎn)防治心腦血管疾病及消炎類(lèi)的藥物[12-13].類(lèi)檸檬苦素也有生物學(xué)功能，如對(duì)人體乳腺癌細(xì)胞的抗癌功能[14]、鎮(zhèn)痛抗炎作用[15-16]、抗焦慮和鎮(zhèn)靜作用以及昆蟲(chóng)拒食功能[17].雖然柚皮苷和類(lèi)檸檬苦素都具有生物活性，但過(guò)多的含量會(huì)影響商品果汁的感官質(zhì)量，使消費(fèi)者難以接受，從而降低了果汁的商品價(jià)值，因此需要進(jìn)行脫苦處理.脫苦處理的方法有很多，目前在應(yīng)用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行柑橘汁脫苦方面有一些報(bào)道：文獻(xiàn)[18-20]使用Amberlite XAD系列樹(shù)脂對(duì)柑橘汁進(jìn)行脫苦效果很好，且對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分影響較少；2009年，邢建榮等利用HZ樹(shù)脂對(duì)胡柚汁進(jìn)行脫苦，柚皮苷和檸檬苦素的脫除率分別達(dá)64.6%和76.7%[21].本文選取優(yōu)良樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附工藝的優(yōu)化，并通過(guò)動(dòng)態(tài)洗脫分離純化柚皮苷和類(lèi)檸檬苦素，并結(jié)合萃取和結(jié)晶的方法使柚皮脫苦.

1材料與方法

1.1　材料與試劑

琯溪蜜柚，購(gòu)自漳州市平和縣琯溪鎮(zhèn)；AB-8、DM130、D4020、D101、D101-I大孔吸附樹(shù)脂，購(gòu)自杭州星群儀器公司.

甲醇、乙腈均為色譜純，購(gòu)自美國(guó) Tedia公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2　儀器與設(shè)備

Waters 2489高效液相色譜儀(配有Binary泵、2695紫外檢測(cè)器、Waters System Breeze系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)處理工作站)，購(gòu)自美國(guó)Waters公司；Unic 7200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自尤尼柯(上海)儀器有限公司.

1.3　方法

1.3.1柚皮苷及檸檬苦素的提取

采用熱水煮提法，具體過(guò)程為：將原料中霉?fàn)€、蟲(chóng)蛀及有病蟲(chóng)害疤痕的柚皮去除，用刀削去除接近果肉部分疏松的白皮組織，將柚皮切成1 cm×2 cm大小的塊，采用鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%，料液比為20∶1(g∶L)，每次煮沸2~3 min，進(jìn)行4次鹽水煮沸.水煮液用4層紗布過(guò)濾，取少量水煮液測(cè)定其中柚皮苷和檸檬苦素的含量.

1.3.2大孔吸附樹(shù)脂篩選

1.3.2.1大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理

樹(shù)脂先經(jīng)漂浮法進(jìn)行篩選，再用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇浸泡24 h，充分溶脹，浸泡過(guò)程中保持樹(shù)脂完全被浸沒(méi).然后濕法上柱，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇通過(guò)樹(shù)脂層，直至流出液不呈白色渾濁為止，再用蒸餾水以同樣流速洗至流出液無(wú)乙醇味，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的鹽酸溶液通過(guò)樹(shù)脂層，并浸泡3 h，而后用蒸餾水洗至流出水的pH值呈中性(操作2遍)，待用.

1.3.2.2靜態(tài)吸附

稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理后濾干水分的5種樹(shù)脂各0.27 g于50 mL三角瓶中，加入15 mL提取液，以25 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中恒速振蕩12 h，取適量提取液，測(cè)定柚皮苷、檸檬苦素的含量，計(jì)算5種樹(shù)脂對(duì)柚皮苷和檸檬苦素的吸附率.

1.3.2.3靜態(tài)解吸

取吸附飽和的樹(shù)脂，用去離子水洗去表面未被吸附的提取液，加入30 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，25 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中恒速振蕩12 h，取適量解吸液，檢測(cè)柚皮苷和檸檬苦素的含量，計(jì)算各樹(shù)脂的解吸率.

1.3.3靜態(tài)吸附等溫曲線(xiàn)

1.3.4靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取D101樹(shù)脂0.36 g于3個(gè)100 mL錐形瓶中，均加入50 g提取液，于25 ℃搖床以180 r/min 振蕩12 h，分別在1，2，3.5，5，7，9，12 h取樣測(cè)定吸附液中柚皮苷和檸檬苦素的含量，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn).

1.3.5單因素試驗(yàn)

稱(chēng)取樹(shù)脂0.25 g，加入20 g提取液，于25 ℃恒溫?fù)u床中以180 r/min振蕩2 h，取樣測(cè)定吸附液中柚皮苷和檸檬苦素含量，計(jì)算樹(shù)脂吸附量.在保持其他條件不變的情況下分別改變樹(shù)脂添加量、吸附時(shí)間、吸附溫度、振蕩速率進(jìn)行單因素試驗(yàn).

1.3.6動(dòng)態(tài)洗脫

吸附完全的樹(shù)脂濕法上柱，先用大量水淋洗至淋洗液無(wú)色并用濃硫酸檢測(cè)不出糖；然后用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇洗脫；流速約為1 Bv/h，約每3 mL接一管，用薄層色譜法對(duì)洗脫液中成分進(jìn)行跟蹤檢測(cè)定性，將成分相同的洗脫液進(jìn)行合并，并減壓蒸餾濃縮得濃縮物.

1.3.7萃取純化

濃縮物用體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇溶解后，用兩倍體積的石油醚萃取3次，將得到的兩部分分別濃縮.甲醇部分濃縮后用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶解后測(cè)其純度，石油醚部分濃縮后用乙腈溶解測(cè)其純度.

1.4　計(jì)算

吸附率/%=(C0-Ce)/C0×100；解吸率/%=C1V1/[(C0-Ce)V]×100，其中：Ce是平衡的質(zhì)量濃度；C1是解析液的質(zhì)量濃度；C0是初始的質(zhì)量濃度；V是吸附液體積；V1是解析液體積.

2結(jié)果與分析

2.1　熱水煮提

柚皮苷易溶于熱水，通過(guò)加熱處理可使其溶出，且加熱使柚皮細(xì)胞壁軟化，柚皮中的苦味物質(zhì)更容易隨可溶性固形物一起溶出.隨著柚皮煮沸次數(shù)的增加，煮出液中苦味物質(zhì)溶出越來(lái)越少，在柚皮煮沸3~4次時(shí)，可以將柚皮中大部分苦味物質(zhì)釋放到煮出液中.經(jīng)檢測(cè)，煮出液中約含有柚皮苷154.25 μg/mL，檸檬苦素53.33 μg/mL.

2.2　大孔吸附樹(shù)脂篩選

選擇不同極性和不同平均孔徑的樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附和靜態(tài)解析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示.由表1可知，平均孔徑最大的D101樹(shù)脂對(duì)柚皮苷的吸附率和解吸率都最高，對(duì)檸檬苦素的解吸率可以達(dá)到100%，可能由于孔徑大，活性物質(zhì)更容易進(jìn)入樹(shù)脂內(nèi)，也更容易脫離樹(shù)脂被解吸出來(lái).綜合考慮5種樹(shù)脂的吸附率和解吸率，選擇D101進(jìn)行下一步試驗(yàn).

表1　5種樹(shù)脂對(duì)柚皮苷和檸檬苦素的吸附能力

2.3　靜態(tài)吸附等溫模型

目前，大孔吸附樹(shù)脂吸附作用的機(jī)制普遍歸結(jié)為Freundlich或Langmuir模型，本實(shí)驗(yàn)采用Langmuir方程和Freundlich方程對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，柚皮苷及檸檬苦素?cái)M合參數(shù)如表2所示.可見(jiàn)，Langmuir和 Freundlich等溫吸附模型線(xiàn)性相關(guān)性符合均較好，但是相比而言，Langmuir等溫吸附模型符合得更好；柚皮苷吸附在 Freundlich吸附等溫式中參數(shù)n=3.61， 在2~10之間，表明吸附容易發(fā)生，而且是一個(gè)優(yōu)惠吸附過(guò)程.

表2　D101樹(shù)脂對(duì)柚皮苷和檸檬苦素等溫吸附模型參數(shù)

2.4　靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

由吸附量隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)(如圖1所示)可以看出，該曲線(xiàn)為指數(shù)形式，吸附量剛開(kāi)始的階段上升較快，吸附5 h后基本達(dá)到平衡，說(shuō)明D101樹(shù)脂達(dá)到吸附平衡所需要的時(shí)間較短，對(duì)柚皮苷和檸檬苦素的選擇吸附性好.

2.5　樹(shù)脂添加量的確定

改變樹(shù)脂添加量，在25 ℃、140 r/min條件下振蕩2 h，取樣測(cè)定吸附液中柚皮苷和檸檬苦素的含量，結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，樹(shù)脂添加量的增多可以提高柚皮苷和檸檬苦素的吸附率，這是由于樹(shù)脂量增多使得樹(shù)脂的總吸附表面積增大，一定時(shí)間內(nèi)吸附的活性物質(zhì)相應(yīng)增多.當(dāng)樹(shù)脂的添加量為3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，柚皮苷和檸檬苦素已全部被吸收.因此，確定樹(shù)脂的最佳添加量為3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)).

2.6　吸附時(shí)間的確定

固定樹(shù)脂添加量為3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，在25 ℃恒溫條件下，搖床以140 r/min振蕩2 h，時(shí)間為15，30，45，55，65，80，90，105，120 min進(jìn)行取樣測(cè)定吸附液中柚皮苷和檸檬苦素的含量，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，隨著吸附時(shí)間的增加，柚皮苷和檸檬苦素的吸附量呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì).當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到90 min時(shí)，柚皮苷吸附率達(dá)到穩(wěn)定，檸檬苦素吸附量變化不大.因此，確定最佳吸附時(shí)間為90 min.

2.7　吸附溫度的確定

固定樹(shù)脂添加量為3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，振蕩速度140 r/min，吸附時(shí)間為90 min，考察溫度10，15，20，25，30，35 ℃對(duì)吸附率的影響，結(jié)果如圖4所示.由圖4可以看出，溫度對(duì)檸檬苦素的吸附率影響較大，而對(duì)柚皮苷吸附率影響較小.這可能是由于溫度的升高，導(dǎo)致了樹(shù)脂的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得更為松弛，從而增大了活性物質(zhì)向樹(shù)脂內(nèi)滲透.由于D101樹(shù)脂對(duì)柚皮苷吸附為優(yōu)惠型吸附，所以溫度對(duì)其影響不大，但是卻增加了對(duì)檸檬苦素的吸附量.當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，檸檬苦素的吸附率隨溫度變化趨于平緩.因此，本試驗(yàn)選擇25 ℃作為樹(shù)脂吸附溫度.

2.8　振蕩速度的確定

固定樹(shù)脂添加量為3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，于25 ℃恒溫條件下振蕩90 min，考察轉(zhuǎn)速100，120，140，160，180，190 r/min對(duì)吸附率的影響，結(jié)果(見(jiàn)圖5)表明：5個(gè)不同振蕩速度下吸附率的變化不大，說(shuō)明振蕩速度對(duì)吸附率沒(méi)有明顯的影響.這可能與在100~180 r/min的轉(zhuǎn)速條件下，柚皮苷和檸檬苦素均能與樹(shù)脂充分接觸有關(guān).

2.9　動(dòng)態(tài)洗脫及純化結(jié)果

固定樹(shù)脂添加量為3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，于25 ℃恒溫條件下，轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩90 min吸附完全，動(dòng)態(tài)洗脫，結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可計(jì)算得洗脫下來(lái)的500 mL 70%體積分?jǐn)?shù)乙醇中檸檬苦素類(lèi)似物質(zhì)量濃度為15.44 μg/mL，質(zhì)量約7.72 mg.洗脫液蒸干后用石油醚萃取純化，石油醚部分再蒸干后得到固體質(zhì)量為8 mg，則得到檸檬苦素類(lèi)似物理論上為96.5%.由于萃取過(guò)程中有一定量檸檬苦素類(lèi)似物的損失，8 mg固體用100 mL乙腈溶解后測(cè)得檸檬苦素類(lèi)似物濃度為(72.75±1.23) μg/mL，純度為(90.9±1.54)%.

由圖6a可以看出，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫后的液體中基本不含柚皮苷，檸檬苦素類(lèi)似物較純，隨流動(dòng)相展開(kāi)的成分中，在最上邊有少量的其他成分，不是檸檬苦素，推測(cè)為檸檬苦素類(lèi)似物.由圖6b可以看出用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫后柚皮苷含量很高，且不含其他黃酮類(lèi)物質(zhì).為了確定分離純化得到的柚皮苷樣品的純度，分別對(duì)柚皮苷樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析，所得結(jié)果如圖7和圖8所示.從圖7和圖8中可以看出，柚皮苷樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖的峰形及保留時(shí)間基本一致，說(shuō)明樣品中柚皮苷的含量較高，根據(jù)面積外標(biāo)法測(cè)得柚皮苷樣品的純度為95.8%.

表3 動(dòng)態(tài)洗脫結(jié)果Tab.3 Theresultofdynamicelution洗脫液Elutionliquidρ(柚皮苷Naringin)/(μg·mL-1)ρ(檸檬苦素類(lèi)似物L(fēng)imonoids)/(μg·mL-1)提取液Extract215.75±3.5032.75±1.01樹(shù)脂吸附后Resinadsorption0030%乙醇洗脫30%ethanolelu-tion136.75±1.150500mL70%乙醇洗脫500mL70%Ethanolelution3.25±1.0315.44±1.12

3結(jié)論

1)采用熱水煮提法提取柚皮中的苦味物質(zhì)柚皮苷和檸檬苦素，提取液中約含有柚皮苷154.25 μg/mL，檸檬苦素53.33 μg/mL.

2)用靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸試驗(yàn)篩選出具有較大吸附和解吸率的D101大孔吸附樹(shù)脂對(duì)提取液進(jìn)行靜態(tài)吸附，得出最優(yōu)的吸附條件：樹(shù)脂添加量3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，25 ℃恒溫條件下?lián)u床以180 r/min 振蕩90 min.

3)吸附完全后進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫，洗脫液再通過(guò)石油醚3次萃取和重結(jié)晶后可有效分離純化出柚皮苷和檸檬苦素類(lèi)似物，純化后樣品用TLC法結(jié)合HPLC法有效地鑒別和測(cè)得柚皮苷純度達(dá)到95.8%，紫外分光光度法測(cè)得檸檬苦素類(lèi)似物純度達(dá)到90.9%.

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(責(zé)任編輯馬建華英文審校曹敏杰)

Extraction and Purification of Naringin and Limonoids from Pomelo PeelYANG Qiu-ming1,2,3,4，LI Jing-ya1，XIAO An-feng1,2,3,4，CHEN Jun1,2,3,4

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China；2.Key Laboratory of Food

Microbiology and Enzyme Engineering of Fujian Province,Xiamen 361021,China；3.Research Center of Food Biotechnology

of Xiamen,Xiamen 361021,China；4.Key Laboratory of Recycling Application and Deep Processing in Economic Marine

Alga,Xiamen South Oceanographic Research Center,Xiamen 361021,China)

Abstract:Bitterness active components such as naringin and limonoids were extracted by heating water.By means of adsorption-desorption experiments,the macro porous resin D101 was selected for isolation and purification of naringin and limonoids from pomelo peel due to its higher adsorption and desorption rate.The adsorption condition was optimized in the presence of 3% resin with absorption time of 90 min,at 25 ℃ and rotation speed of 180 r/min.After complete adsorption,the resulting solution was applied to dynamic-state elution.Naringin and limonoids were separated and purified effectively via concentration of the eluent and recrystalization.The samples thus prepared were determined by HPLC and UV spectrophotometer,the purities of naringin and limonoids reached 95.8% and 90.9%,respectively.

Key words:naringin;limonoids;macro porous resin;separation and purification

[中圖分類(lèi)號(hào)]TS 255.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-7405(2015)06-0414-07

[作者簡(jiǎn)介]楊秋明(1977—),男,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,主要從事食品微生物及工藝方面的研究.通信作者：陳俊(1977—)，男，副教授，從事藥學(xué)研究，E-mail:chenjun@jmu.edu.cn.

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271914)；福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2011N1008)；福建省教育廳科技項(xiàng)目(JA11160)

[收稿日期]2014-09-30[修回日期]2015-09-28