白辰 車念聰 劉文蘭 趙暉 司遠(yuǎn)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是指以膠原纖維 為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)大量沉積的病理過程［1］。與拮抗纖維化的西藥相比，中藥復(fù)方在對(duì)病人個(gè)體治療方面具有一定優(yōu)勢。滋陰疏肝的時(shí)方一貫煎為臨床常用治療肝纖維化的方劑。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明［2］，一貫煎湯劑能有效降低血清轉(zhuǎn)氨酶含量，減輕肝臟炎癥程度。本研究擬通過建立CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，觀察經(jīng)一貫煎湯劑干預(yù)后，肝組織細(xì)胞外I型膠原沉積情況的變化，探討一貫煎湯劑對(duì)降解細(xì)胞外I型膠原沉積是否有促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

選用健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g，鼠齡8周，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào):SCXK(京)2012-0001，共28只，飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物室。

一貫煎:根據(jù)原方藥物劑量和比例［3］，選取北京同仁堂藥店的標(biāo)準(zhǔn)中藥材北沙參9 g、麥冬9 g、當(dāng)歸9 g、生地黃20 g、枸杞子12 g、川楝子4.5 g，煎煮為湯劑。按照體表面積計(jì)算，大鼠每100 g體質(zhì)量所需生藥為0.65 g，將一貫煎湯劑按照100 g大鼠灌胃1mL的體積配成相應(yīng)濃縮液備用。

CCl4(四氯化碳分析純專用試劑，純度≥99.5%，北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào):20060132)，橄欖油(阿果薩特級(jí)初榨橄欖油，最大酸度0.4%，批號(hào):14001952)，秋水仙堿(西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào):120412)，生理鹽水(石家莊四藥有限公司，批號(hào):20729509)，蛋白定量試劑盒(北京蒂諾奧生物科技有限公司)，一抗:Anti-Collagen I antibody ab34710(美國 abcam)、蛋白質(zhì)印跡法二抗:Dylight 800-goat anti-rabbit IgG(美國 Earthox LLC)，二抗:Polink-2 plus@Polymer HRP Detection System(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PV-9001)。

1.2 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀(Bio-Rad，Model680，美國)垂直電泳槽(Bio-Rad，美國)，小型電泳儀(Bio-Rad，美國)，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(Li-Cor，美國)，熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)，恒溫箱(Sanyo)。

1.3 造模

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組，模型組，西藥組，中藥組。除正常組外，其余3組大鼠腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液(0.2 mL/100 g)，每周2次，共2周;隨后腹腔注射0.1 mL/100 g的CCl4橄欖油溶液，每周 2次，共 2周;接著腹腔注射0.05 mL/100 g的CCl4橄欖油溶液，每周2次，共2周。正常組大鼠以同樣方式等劑量腹腔注射橄欖油溶液。

1.4 治療

從第7周開始，停止腹腔注射，中藥組予一貫煎濃縮液1 mL/100 g灌胃，西藥組給予秋水仙堿灌胃，0.25 mg/kg(相當(dāng)于成人用量的 30 倍)［4］。正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。每天1次，連續(xù)4周。

1.5 采集及處理樣品

治療4周后，所有大鼠以10%水合氯醛按0.35 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉。取肝左葉同一部分，常規(guī)脫水、石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟至水，自來水洗5分鐘，蒸餾水洗5分鐘。抗原修復(fù)后，滴入適當(dāng)一抗(1∶800)，37度孵育90分鐘，磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.6)洗3次，每次2分鐘。滴入適當(dāng)二抗，37℃孵育20分鐘，pbs洗3次，每次3分鐘，室溫顯色。蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，光鏡觀察。采用NIS-Elements BR 3.2采集圖像，進(jìn)行積分光密度分析。每組隨機(jī)選取3個(gè)樣本，取肝右葉50～100 g，剪碎勻漿后蛋白定量，5%濃縮膠80 V電泳約30分鐘，10%分離膠120 V電泳至溴酚藍(lán)到底。60 mA冰浴過夜轉(zhuǎn)膜，封閉后一抗(1∶10000)室溫?fù)u床孵育 1小時(shí)，洗膜后二抗(1∶10000)室溫?fù)u床孵育1小時(shí)，洗膜后掃描成像，采用Imagej2x分析蛋白電泳灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，各組計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01視為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Origin 8繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果

正常組大鼠肝組織僅在中央靜脈及匯管區(qū)周圍可見極少量I型膠原沉積。與正常組相比，模型組大鼠I型膠原蛋白表達(dá)增加，在肝組織中央靜脈及匯管區(qū)周圍、橋接結(jié)構(gòu)中可見大量I型膠原沉積，且散見于小葉各處。與模型組相比，西藥組與中藥組I型膠原表達(dá)減少，肝組織細(xì)胞外I型膠原沉積明顯減少，在中央靜脈及匯管區(qū)周圍有部分I型膠原沉積。見圖1、圖2、表1。

圖1 各組大鼠肝組織I型膠原免疫組化染色(×400)

圖2 各組大鼠肝組織I型膠原蛋白表達(dá)

表1 各組大鼠肝組織I型膠原情況(x±s)

3 討論

一貫煎始載自清·魏玉璜所著《續(xù)名醫(yī)類案》，由生地黃、沙參、當(dāng)歸、枸杞、麥冬、川楝子組成，功擅滋陰疏肝，臨床常用于治療肝腎陰虛、肝郁氣滯所致脅痛、口干、腰膝酸軟等癥狀。根據(jù)HF的臨床表現(xiàn)和病癥特點(diǎn)，中醫(yī)學(xué)可參考“脅痛”、“肝積”“臌脹”“黃疸”等病證范疇。其病因多為飲食失節(jié)、情志失常、勞傷虛損、感染蟲毒等，致濕熱邪毒內(nèi)蘊(yùn)，傷陰耗氣，痰凝血瘀，損傷肝絡(luò)，發(fā)為此?。?］。因肝腎二臟母子相及，乙癸同源，故肝纖維化病變后期往往出現(xiàn)肝腎陰虛的證候［6-7］。一貫煎方中重用生地黃為君藥，滋陰養(yǎng)血，補(bǔ)益肝腎;以沙參、當(dāng)歸、枸杞、麥冬4藥共為臣藥，滋陰柔肝;同時(shí)少佐川楝子疏肝泄熱，諸藥合用，既滋補(bǔ)肝腎之陰又疏理肝氣，使肝陰得養(yǎng)，肝氣得舒。

包括蛋白多糖、膠原蛋白和黏連蛋白［8］在內(nèi)的ECM代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常，其中I型膠原蛋白變化幅度最大［9］，可作為肝臟內(nèi)膠原代謝變化的參考。正常肝組織細(xì)胞外間質(zhì)的I型膠原主要分布在匯管區(qū)和中央靜脈周圍，研究表明［10-11］，I型膠原由激活的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)合成及分泌，受基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)/金屬蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型大鼠肝組織I型膠原蛋白表達(dá)增加，在肝組織細(xì)胞外沉積增多，反映出CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化過程中出現(xiàn)I型膠原代謝紊亂，過度沉積。經(jīng)一貫煎湯劑治療后，肝組織內(nèi)沉積的I型膠原明顯減少。前期研究表明，I型膠原減少的原因考慮與調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)信號(hào)通路凋亡細(xì)胞抑制劑(cellular inhibitors of apoptosis，cIAP1)蛋白［12］，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞募集到肝臟［2］，調(diào)節(jié)MMP-1/TIMP-1有關(guān)。目前抗肝纖維化的現(xiàn)代藥物研究主要集中于逆轉(zhuǎn)纖維化的多種靶點(diǎn)，包括MMPs/TIMPs、TGF-β 細(xì)胞因子、Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)4、內(nèi)源性大麻素(endogenous cannabinoids，EC)及其受體、整合素αV、微小RNA-29在內(nèi)的多種潛在靶點(diǎn)，大部分仍處于臨床前研究階段［13］，應(yīng)用一貫煎湯劑等中藥復(fù)方拮抗肝纖維化的研究可為肝纖維化的治療提供新的思路。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:一貫煎湯劑能降低I型膠原在肝細(xì)胞外的沉積;同時(shí)提示一貫煎疏肝理氣的功用可能與其減少肝組織內(nèi)I型膠原，進(jìn)而改善臟器結(jié)構(gòu)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為闡釋一貫煎對(duì)肝纖維化的拮抗作用提供了一定的數(shù)據(jù)支持，為臨床合理應(yīng)用一貫煎治療相關(guān)疾病起到一定的指導(dǎo)作用。

［1］楊新疆，齊翠花，鄭勇，等.SB203580對(duì)肝纖維化大鼠肝臟Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響［J］.世界華人消化雜志，2014，22(3):310-318.

［2］劉文蘭，油紅捷，車念聰，等.一貫煎促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2014，7(6):401-405.

［3］謝鳴，周然.方劑學(xué)［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2012:201-202.

［4］黃繼漢，黃曉暉，陳志揚(yáng)，等.藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9(9):1069-1072.

［5］黃長樂，趙文霞.中醫(yī)藥治療肝纖維化進(jìn)展［J］.中醫(yī)臨床研究，2014，6(2):146-147.

［6］劉紹能，陶夏平，王融冰，等.慢性乙型肝炎中醫(yī)證候演變規(guī)律研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2008，15(3):161-163.

［7］岳煜，薛博瑜.肝纖維化中醫(yī)藥研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，25(6):1243-1245.

［8］法振鵬，車念聰，季巍巍，等.乙肝系列中成藥對(duì)免疫性肝纖維化大鼠肝功能和肝纖維化指標(biāo)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(5):1449-1451.

［9］Das SK，Vasudev an DM.Genesis of hepatic fibrosis and its biochemical markers［J］.Scand J Clin Lab Invest，2008，68(4):260-269.

［10］Benyo n RC，Ar thur MJ.Extracellular matrix degradation and the role of hepatic stellate cells［J］.Semin Liver Dis，2001，21(3):373-384.

［11］Hemmann S，Graf J，Roderfeld M，Ro eb E.Ex pression of MMPs and TIMPs in liver fibrosis-a systematic review with special emphasis on anti-fibrotic strategies［J］.J H epatol，2007，46(5):955-975.

［12］劉文蘭，油紅捷，張紅月，等.一貫煎治療肝炎藥理機(jī)制的研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，(5):192-194.

［13］趙雙雙，邵榮光，何紅偉.抗肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，(10):1365-1371.

(本文編輯:董歷華)