王　京,王艷麗,楊永霞,吳文昊,王　瑞,向必坤,許自成*

(1 河南農業(yè)大學 煙草學院,鄭州 450002;2 湖北省煙草公司恩施州公司,湖北恩施 445000)

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海拔對白肋煙質體色素含量及相關基因表達的影響

王京1,王艷麗1,楊永霞1,吳文昊2,王瑞2,向必坤2,許自成1*

(1 河南農業(yè)大學 煙草學院,鄭州 450002;2 湖北省煙草公司恩施州公司,湖北恩施 445000)

摘要:以‘鄂煙1號’為供試品種,于湖北恩施選取高、中、低3個海拔(海拔高度分別為1 560 m、1 200 m、800 m)種植區(qū),研究不同海拔白肋煙主要生育期(旺長期、成熟期)內煙葉質體色素含量及其合成代謝過程中相關基因表達的差異,探討白肋煙質體色素代謝對海拔高度的生理響應機制。結果表明:煙葉葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量及旺長期類胡蘿卜素總量均以中海拔地區(qū)最高,且顯著或極顯著高于其他海拔梯度;成熟期高海拔煙葉類胡蘿卜素總量最高,且較旺長期明顯增加。葉綠素及旺長期類胡蘿卜素合成有關的基因均為中海拔表達最強,成熟期類胡蘿卜素合成基因在高海拔表達最強。結果說明‘鄂煙1號’更適宜種植在中海拔地區(qū)。

關鍵詞:白肋煙;海拔;質體色素;基因表達

綠色植物質體色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素,其作為光合色素參與的光合作用是綠色植物生長發(fā)育及形態(tài)建成的基礎[1]。煙草質體色素作為重要的香氣前體物質,對煙草特色香氣風格的形成具有重要影響。在煙葉調制過程中,葉綠素分解形成的新植二烯是煙葉中含量最大的中性揮發(fā)物,其香氣閾值較高,具有一定的清香味,是煙葉重要的增香劑;類胡蘿卜素降解因雙鍵斷裂位置不同,形成多種重要的香氣物質,如巨豆三烯酮、β-大馬酮、螺巖蘭草酮等[2-3]。

生態(tài)環(huán)境因素決定了煙葉質量和風格的形成[4],海拔高度作為一個重要的生態(tài)因子對煙草的生長發(fā)育、物質代謝及品質有重要的影響。隨著海拔升高,大氣溫度、CO2濃度、大氣壓等隨之降低,光照強度增強,煙苗移栽期推遲,煙株生長速度逐漸減慢,株高稍矮,莖圍稍粗,葉片較窄,大田生育期和成熟期逐漸增長[5-7]。不同海拔地區(qū)煙葉化學成分也存在差異。有研究表明隨著海拔升高,煙葉還原糖含量增加,煙堿含量則隨海拔升高而降低[8]。曹學鴻等[9]也認為煙葉中總糖、還原糖含量與海拔高度呈正相關關系,總氮、煙堿含量則與海拔高度呈負相關關系,中海拔地區(qū)(800～1 400 m)煙葉化學成分協(xié)調性好于其他海拔層次。海拔對煙葉中性致香物質含量也有較大的影響,甄才宏等[10]對600～1 700 m海拔區(qū)域煙葉中性致香物質含量比較發(fā)現(xiàn),800 m海拔地區(qū)煙葉中性致香物質總量及各組分含量均最高,1 300 m海拔地區(qū)最低。有關海拔高度對綠色植物質體色素含量變化的研究多見于云杉、莨菪等植物。前人對云杉、落葉松的研究表明,植物葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量均隨海拔的升高而降低[11-12]。張波等[13]對青藏高原不同海拔唐古特山莨菪葉片光合色素含量比較表明高海拔地區(qū)質體色素含量明顯高于低海拔地區(qū)。關于不同海拔對白肋煙質體色素代謝的影響還鮮見報道。本試驗研究了白肋煙質體色素隨海拔梯度的變化及相關合成代謝基因的表達規(guī)律,旨在分析白肋煙質體色素代謝對海拔高度的生理響應機制,為研究恩施煙區(qū)特色白肋煙品種在不同海拔生態(tài)環(huán)境中煙葉品質的形成過程提供參考。

1材料與方法

1.1試驗地概況和試驗設計

試驗地點設在湖北省恩施市崔壩鎮(zhèn),設置低、中、高3個海拔梯度,分別為滾龍壩(800 m)、水淌(1 200 m)、馬跑山(1 560 m)。供試品種為當?shù)匕桌邿熤髟云贩N‘鄂煙1號’。各試驗地土壤理化性質基本一致,基礎肥力見表1。

3個海拔試驗地土壤均為黃棕壤,質地疏松,肥力中等。各海拔高度設3次重復,小區(qū)面積65 m2,行株距120 cm×60 cm,本試驗采用的肥料分別為煙草專用復合肥、重過磷酸鈣、硫酸鉀,N:P2O5:K2O=1:1:2。結合當?shù)厥┓柿晳T,70%復合肥和全部的重過磷酸鈣于整地后移栽前條施,30%復合肥和50%硫酸鉀于移栽時穴施,余下的硫酸鉀于移栽后30 d做追肥施用。其他田間栽培管理措施及病蟲害防治均按照當?shù)貎?yōu)質煙葉生產管理要求進行。高、中、低海拔煙株移栽時間分別為5月12日、5月7日和5月3日。于旺長期和成熟期選取各處理長勢均勻一致的煙株3株,取中部葉6至10支脈之間的葉片,迅速置于液氮中低溫保存。

1.2測定內容和方法

1.2.1質體色素代謝基因表達檢測取適量冷凍煙葉葉片,用Trizol法提取總RNA[14],隨機引物法反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板,Primer Premier 5軟件設計擴增引物(表2),以L25(煙草核糖體蛋白基因)為內參[15],采用RT-PCR法檢測質體色素代謝途徑關鍵基因的表達狀況。各基因對應的合成代謝關鍵酶名稱及功能見表3。

PCR體系為:cDNA為1 μL,diH2O(去離子水)為11 μL,上游引物和下游引物均為1.5 μL,含染料的Taqmix為15 μL,整個PCR體系共30 μL。反應程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s;退火溫度依各引物Tm值變化而變化(47 ℃～60 ℃);72 ℃延伸1 min;35個循環(huán);72 ℃延伸10 min,于4℃保存。

表1　不同海拔高度土壤基礎肥力狀況

表2　引物序列及PCR擴增基因片段

表3　參與質體色素合成代謝的酶及編碼基因

1.2.2質體色素含量的測定采用低溫冷凍干燥機將煙葉樣品凍干,粉碎機粉碎后,準確稱取0.2 g粉碎煙樣置于50 mL棕色瓶中,準確加入25 mL 90%丙酮溶液,輕微震蕩后低溫條件下超聲波萃取20 min,用移液管取適量萃取液后用有機膜(0.45 μm)過濾,移入1.5 mL棕色色譜瓶(液相色譜分析儀)。

工作條件為Symmetry C18反相色譜柱(3.9 mm i.d.×150 mm,5 μm,美國Waters公司),流動相A為甲醇的異丙醇溶液(體積比為1:1),流動相B為超純水。流速0.5 mL/min。梯度洗脫:0～10 min(70% A+30% B),10～17 min(100% A),17～30 min(90% A+10% B)。以梯度洗脫線性遞增(減)的梯度條件,平衡10 min后手動進樣。進樣量10 μL。檢測波長450 nm。柱溫為室溫。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003、SPSS 19.0等統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。并用LaunchVisionWorksLS軟件對RT-PCR檢測所得半定量圖片進行量化,提取各個基因表達的亮度相對值進行對比,每個基因均以旺長期高海拔處理為基準。

2結果與分析

2.1不同海拔白肋煙質體色素代謝關鍵基因的表達分析

2.1.1葉綠素代謝關鍵基因的表達差異對葉綠素代謝關鍵基因CAB、CHLI、PAO、CLH進行RT-PCR檢測分析(圖1、表4),結果表明,旺長期葉綠素合成關鍵基因CAB和CHLI的表達量均高于成熟期,而參與編碼葉綠素分解基因PAO和CLH表達量則正好相反,即成熟期高于旺長期。不同海拔比較,旺長期和成熟期CAB均在中海拔表達最強,低海拔最弱;PAO和CLH表達在旺長期以中海拔最強,成熟期CHLI和CLH均隨海拔的升高而增強,而PAO則逐漸減弱。

圖1　不同海拔白肋煙葉綠素代謝關鍵酶基因的檢測結果

2.1.2類胡蘿卜素代謝關鍵基因的表達差異由圖2和表5可知,旺長期PSY、ZDS、LCYb、LCYe、ZEP、CCD1均表現(xiàn)為中海拔表達量最高,而PDS則隨海拔升高表達逐漸增強。成熟期PDS和LCYb均在低海拔表達最強,中海拔最弱;ZDS、LCYe、ZEP、CCD1隨海拔升高表達逐漸增強;PSY在中海拔表達最強,低海拔次之,高海拔最弱。高海拔煙葉成熟期除PDS外各基因表達量均高于旺長期,表明高海拔成熟期煙葉中類胡蘿卜素合成分解旺盛。

圖2　不同海拔白肋煙類胡蘿卜素代謝

基因Genes生育期Growthperiod高海拔Highaltitude中海拔Middlealtitude低海拔LowaltitudeCAB旺長期Fastgrowingstage100.00b112.50a97.02b成熟期Maturestage95.45a96.82a92.76aCHLI旺長期Fastgrowingstage100.00b115.79a95.13c成熟期Maturestage96.46a96.18a93.66aPAO旺長期Fastgrowingstage100.00a101.24a96.32b成熟期Maturestage104.51c112.28b123.12aCLH旺長期Fastgrowingstage100.00c108.96a104.08b成熟期Maturestage119.76a112.90b108.54c

注:對同一生育期不同海拔煙葉中同一基因的相對表達量進行多重比較;同一行中不同小寫字母表示不同海拔間差異顯著(P<0.05);表5同。

Note:The multiple comparison of relative expression quantity refers to the comparison among different altitudes for same gene and same growth stage;Different small letters in the same row mean significant difference at 0.05 level among different altitudes.The same as in Table 5.

表5　不同海拔白肋煙類胡蘿卜素代謝關鍵酶基因相對表達量的多重比較

表6　不同海拔白肋煙質體色素含量的差異比較

注:同一行中同一生育期對應的3個數(shù)字后不同大、小寫字母分別表示該指標在不同海拔間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。

Note:Different big and small letters after the three values of same growth stage in the same row mean significant difference at 0.01 level and 0.05 level among different altitudes.

2.2不同海拔白肋煙質體色素含量變化的差異

白肋煙各生育期不同海拔間煙葉質體色素含量差異如表6所示。煙葉中葉綠素a、葉綠素b含量及葉綠素總量隨海拔升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,具體表現(xiàn)為:中海拔>高海拔>低海拔,且中海拔極顯著高于高海拔和低海拔,高海拔和低海拔差異不顯著。旺長期類胡蘿卜素總量及各組分含量的變化規(guī)律與葉綠素相似,也表現(xiàn)為先升高后降低。β-胡蘿卜素、新黃質、紫黃質含量及類胡蘿卜素總量在各海拔間差異均顯著,葉黃素含量在中海拔和高海拔間差異達到極顯著水平。成熟期除葉黃素含量為中海拔產區(qū)最高外,類胡蘿卜素總量及其他各組分含量均隨海拔升高而逐漸升高。β-胡蘿卜素、新黃質含量及類胡蘿卜素總量在高海拔和中海拔間差異不顯著,但極顯著高于低海拔產區(qū),葉黃素和紫黃質含量在各海拔間呈極顯著差異。各海拔煙葉葉綠素a含量是葉綠素b的2倍左右,且隨生育進程的推進葉綠素a/b有下降的趨勢,說明葉綠素a的降解速率快于葉綠素b,煙葉對光能的利用減弱。旺長期低海拔煙葉類胡蘿卜素/葉綠素最高,顯著高于高海拔煙葉;而成熟期高海拔煙葉該比值最高,不同海拔煙葉類胡蘿卜素/葉綠素在0.05水平差異顯著。

3討論

在旺長期,煙株生長迅速,葉面積迅速擴大,光合速率上升,質體色素含量增加,但隨著煙葉成熟,葉片在生育后期感知衰老信號,各項生理代謝減弱,光合速率下降,質體色素加速降解[1]。本研究表明,煙葉中質體色素含量在旺長期處于較高水平,隨著煙葉成熟,質體色素含量降低,這與已有研究一致[16]。煙葉葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量及旺長期類胡蘿卜素總量均以中海拔地區(qū)最高,且顯著或極顯著高于其他海拔梯度,這與曹艷玲等[17]研究結果一致。也有研究認為葉綠素含量隨著海拔升高而降低[18]。這種代謝差異可能是由于煙株生長的其他生態(tài)環(huán)境不同引起的,尚需進一步驗證。葉綠素a/b是衡量植物利用光能能力大小的指標。通常認為,隨著海拔升高,葉綠素a/b比值呈上升趨勢[12,19]。但本研究結果表明葉綠素a/b比值在各海拔間差異不顯著,可能是由于本試驗選取的海拔梯度尚未引起煙葉對不同波長光照的選擇性吸收所致。成熟期煙葉類胡蘿卜素含量隨海拔的升高而逐漸升高,類胡蘿卜素/葉綠素比值在高海拔顯著高于中海拔和低海拔,這可能是由于在煙株生育后期高海拔地區(qū)的紫外線強度過高,煙株為適應這種逆境脅迫,與類胡蘿卜素合成相關的關鍵酶基因表達量增加,進而調控合成大量類胡蘿卜素來調節(jié)類囊體膜的物理活性,保護葉綠素不受光氧化傷害[12,20]。這種類胡蘿卜素含量的增加是煙葉為應對環(huán)境變化而采取的一種保護性機制,與韓錦峰等[21]的研究結果一致。

從相關代謝基因RT-PCR檢測結果可以看出,與質體色素合成相關的基因在旺長期表達活躍,但此時與質體色素降解相關的基因的表達量卻維持在較低水平;成熟期相關合成基因的表達量略有下降或維持原有水平,而相關降解基因的表達明顯加強,這與質體色素含量隨煙葉成熟逐漸下降的趨勢一致。表明基因對代謝關鍵酶的調控是影響煙葉質體色素含量變化的原因之一。

恩施中海拔煙葉質體色素最高,相關基因表達活躍,更有利于煙葉進行光合作用,進而促進煙株物質代謝,為提高煙葉產質量和彰顯香氣風格提供了物質基礎?！鯚?號’更適宜在恩施中海拔地區(qū)種植。然而,煙葉品質的形成是煙草品種基因型和生態(tài)環(huán)境綜合作用的結果[4],不同煙草品種在相同生態(tài)環(huán)境下煙葉化學成分也存在較大差異[22],鑒于當?shù)匕桌邿煼N植品種較多,恩施白肋煙整體種植區(qū)劃還需進一步研究。

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(編輯:宋亞珍)

Effect of Different Altitudes on the Contents of Plastid Pigment

and Related Genes Expression of Burley Tobacco

WANG Jing1,WANG Yanli1,YANG Yongxia1,WU Wenhao2,

WANG Rui2,XIANG Bikun2,XU Zicheng1*

(1 Tobacco College of Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;2 Enshi Branch of Hubei Province Tobacco Company,Enshi,Hubei 445000,China)

Abstract:Taking E’yan 1 as the material and selecting three altitudes which were the altitude of 1 560 m,1 200 m and 800 m,respectively,we investigated the difference of the contents of plastid pigment and related genes expression of burley tobacco in Enshi at the fast grow stage and the mature stage.The results showed that the contents of chlorophyll a,chlorophyll b and total chlorophyll in burley tobacco leaves at medium altitude were the highest,and the content of total carotenoids at the fast grow stage among different altitude had the same trend.The difference between medium altitude and other altitudes was significant or very significant.The leaves of burley tobacco in high altitude had the higher content of total carotenoids at the mature stage and the content of total carotenoids increased fast compared to fast grow stage.In medium altitude planting area,the expression of chlorophyll synthesis genes at two growth stages and carotenoid synthesis genes at fast grow stage were efficient,while the efficient expression of the genes related carotenoid synthesis at mature stage appeared in high altitude planting area.Medium altitude was more suitable for planting E’ yan 1.

Key words:burley tobacco;altitude;plastid pigment;gene expression

中圖分類號:Q945.79;Q789

文獻標志碼:A

作者簡介:王京(1989-),男,在讀碩士研究生,主要從事煙草品質生態(tài)學研究。E-mail:nongdawangjing@163.com*通信作者:許自成,博士,教授,博士生導師,主要從事煙草質量評價研究。E-mail:zcxu@sohu.com

基金項目:中國煙草總公司科技計劃面上項目(中煙辦[2012]122號);中國煙草總公司湖北省公司科技攻關項目(027Y2011-050)

收稿日期:2014-07-18;修改稿收到日期:2014-10-27

文章編號:1000-4025(2015)01-0131-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0131