王雷 王陽(yáng) 吳小榮 沙建軍 陳勇輝 薛蔚 薄雋杰 劉東明 黃翼然

·實(shí)驗(yàn)研究·

DDR2在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

王雷 王陽(yáng) 吳小榮 沙建軍 陳勇輝 薛蔚 薄雋杰 劉東明 黃翼然

目的探討盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體2(DDR2)在腎透明細(xì)胞癌與正常腎組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法分別采用免疫組織化學(xué)染色和Real-time PCR檢測(cè)DDR2在腎透明細(xì)胞癌及相應(yīng)癌旁正常腎組織中的表達(dá)，進(jìn)一步分析其表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌相關(guān)臨床病理特征間的關(guān)系。結(jié)果腎透明細(xì)胞癌組織中DDR2蛋白及mRNA與癌旁組織比較均呈現(xiàn)異常低表達(dá)(P<0.05),且腎透明細(xì)胞癌組織中DDR2的表達(dá)與腎癌臨床分期及組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論DDR2在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)較正常腎組織低，且其表達(dá)量與腎癌的臨床分期和病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，提示DDR2可能在腎透明細(xì)胞癌中扮演抑癌基因的角色,但具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

【關(guān)鍵詞】腎透明細(xì)胞癌； DDR2； 抑癌基因

腎癌又稱(chēng)腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC), 主要起源于腎小管上皮細(xì)胞，是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占成人所有惡性腫瘤的2%～3%[1]，最主要的病理類(lèi)型是腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，約占腎癌的70%～85%[2]。目前腎癌的治療以手術(shù)為主，但仍有20%～40%的患者術(shù)后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。盡管目前靶向藥物治療可以延長(zhǎng)晚期腎癌患者的生存時(shí)間，但因腎癌對(duì)放療、化療等其他治療方式效果不佳，整體預(yù)后較差。因此研究腎癌的病因?qū)W對(duì)腎癌的早期診斷、治療和預(yù)后至關(guān)重要。

盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體2(discoidin domain receptor 2，DDR2)是一種受體型蛋白酪氨酸激酶，能特異性地和一系列膠原配體(Ⅰ～Ⅲ、Ⅹ型膠原)相結(jié)合并被膠原激活，進(jìn)而發(fā)揮一系列的生物學(xué)作用[3]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法和Real-time PCR研究DDR2在ccRCC及正常腎組織中的表達(dá)情況,以期對(duì)DDR2在ccRCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及預(yù)后意義的研究提供幫助。

材料與方法

一、一般資料

取2013年4月至2015年3月泌尿外科行手術(shù)治療的87例ccRCC患者的癌組織及其中53例患者的正常腎臟組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，均經(jīng)病理證實(shí)。87例ccRCC患者中，男24例，女63例，年齡26～78歲。所有患者術(shù)前均未接受任何治療，且排除轉(zhuǎn)移性RCC。收集患者性別、年齡、腫瘤大小、病理分級(jí)、分期(根據(jù)AJCC 2009標(biāo)準(zhǔn))情況等資料。

二、主要試劑

一抗為多克隆兔抗人DDR2抗體(H-108：sc-8989, 美國(guó)Santa Cruz Biotechnology), 二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗(美國(guó)DAKO公司)。RNA提取試劑Trizol購(gòu)自 Invitrogen 公司；RT試劑盒購(gòu)自Fermentas 公司；Premix Taq?Version 2.0 PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自TAKARA公司；引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

三、Real-time PCR

四、免疫組織化學(xué)染色

將收集到的腎癌組織蠟塊標(biāo)本制成4 μm切片，經(jīng)脫蠟、水化后置入檸檬酸緩沖液中高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)。過(guò)氧化物酶阻斷劑覆蓋樣品5～10 min，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS液漂洗3次×5 min；綿羊血清阻斷劑覆蓋樣品15 min后棄去，以卵白素阻斷試劑孵育樣品，持續(xù)15 min后PBS緩沖液沖洗樣品3次×5 min，加入生物素阻斷試劑孵化樣品，持續(xù)15 min后PBS緩沖液沖洗樣品3次×5 min。DDR2抗體(1∶500)濕盒中孵育樣品，4 °C冰箱過(guò)夜，次日生物素標(biāo)記的抗兔二抗(1∶5 000)37 ℃孵育20 min、SABC 37 ℃孵育 20 min ，最后滴加DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染后脫水封片。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

DDR2陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)及包膜內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色染色為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野(×200)進(jìn)行判斷。結(jié)果判定：染色強(qiáng)度陰性為0分，淡黃色染色計(jì)1分，中度黃色染色計(jì)2分，棕黃色強(qiáng)染色計(jì)3分；同時(shí)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分(0～100%)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，1%～30%計(jì)1分，31%～60%計(jì)2分，>60%計(jì)3分。上述兩項(xiàng)相乘，總分0～3為低表達(dá)，4～9分為高表達(dá)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、免疫組化染色法評(píng)估DDR2蛋白在ccRCC及癌旁正常腎組織中的表達(dá)情況

癌旁正常腎臟組織中均可見(jiàn) DDR2蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),而腎癌組織中DDR2蛋白染色為陰性。DDR2蛋白表達(dá)定位于近端腎小管細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而在ccRCC中正常的腎小管組織消失而代之以結(jié)構(gòu)紊亂的癌細(xì)胞組織，癌細(xì)胞核內(nèi)DDR2蛋白明顯降低(圖1)。

A:正常腎臟組織中DDR2呈陽(yáng)性表達(dá);B～D分別為FuhrmanⅠ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)ccRCC中DDR2的弱表達(dá)或陰性表達(dá)圖1 DDR2在癌旁組織及不同ccRCC Furhman分級(jí)中的表達(dá)情況

二、ccRCC及癌旁組織中DDR2 mRNA的表達(dá)

為了進(jìn)一步了解DDR2表達(dá)下降是否與其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控有關(guān),應(yīng)用 Real-time PCR方法,檢測(cè)12對(duì)ccRCC及相應(yīng)患者的正常腎組織標(biāo)本DDR2 mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果在腎癌組織中，DDR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.006±0.005 3)明顯低于相應(yīng)的正常腎組織的mRNA表達(dá)量(0.014 6±0.006 1)(P<0.05)，且ccRCC組織中DDR2 mRNA只有很微弱的表達(dá)(t=3.559,P=0.004 5)。表明ccRCC組織中DDR2 mRNA 的表達(dá)水平顯著降低(圖2),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示DDR2基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平可能受到了抑制。

圖2 ccRCC與正常腎組織 DDR2 mRNA 表達(dá)水平比較

三、DDR2表達(dá)情況與腎癌患者臨床特征的關(guān)系

DDR2表達(dá)情況與腎癌患者臨床特征的關(guān)系見(jiàn)表1。

討 論

RCC是泌尿系常見(jiàn)腫瘤，且其發(fā)病率逐年上升，因此積極尋找協(xié)助RCC早期診斷的分子標(biāo)志物顯得尤為重要。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)不少生物分子標(biāo)志物與腎腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后存在相關(guān)性，如缺氧誘導(dǎo)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、碳酸酐酶Ⅸ等[4]，但仍未能明確解釋RCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。

DDR2蛋白是一種受體型蛋白酪氨酸激酶，能被Ⅰ～Ⅲ、Ⅹ型膠原磷酸化而激活，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、粘附、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)重建，在人體多種病理生理過(guò)程中都發(fā)揮重要作用。上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是惡性實(shí)體瘤中細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要途徑，在多種腫瘤的原發(fā)性浸潤(rùn)和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中都起著舉足輕重的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在EMT進(jìn)程中，惡性腫瘤細(xì)胞可以獲得更大的侵襲力，更容易侵襲到周?chē)M織或發(fā)生血流轉(zhuǎn)移。而Walsh 等[5]發(fā)現(xiàn)DDR2及其配體Ⅰ型膠原通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)參與了EMT進(jìn)程。已有不少研究發(fā)現(xiàn)DDR2在不少腫瘤中差異性表達(dá)。在頭頸部鱗癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等一些惡性腫瘤中已發(fā)現(xiàn)DDR2的表達(dá)增高，且DDR2的高表達(dá)與這些惡性腫瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后是密切相關(guān)的[6-9]。Ren等[6]在乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境能增加DDR2的表達(dá)和磷酸化水平，體外乳腺癌腫瘤模型實(shí)驗(yàn)得出敲除DDR2后能顯著減少乳腺癌的肺和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)DDR2缺氧環(huán)境下通過(guò)激活ERK1/2 MAPK通路在誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲和EMT中發(fā)揮必不可少的作用。DDR2可能作為癌基因在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

表1 ccRCC中DDR2 蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

有不少關(guān)于DDR2在肺癌中表達(dá)情況的研究。Ford等[10]利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)研究了146例非小細(xì)胞肺癌患者標(biāo)本中DDR2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DDR2在肺癌中的表達(dá)低于正常肺組織。隨后日本學(xué)者Sasaki 等[11]對(duì)166例非小細(xì)胞肺癌患者中DDR2的突變及表達(dá)情況進(jìn)行了研究，他們亦得出DDR2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)是降低的，但是在某些晚期肺癌(8.4%)患者中DDR2的表達(dá)水平高于正常肺組織。然而，在RCC中還沒(méi)有關(guān)于DDR2表達(dá)情況的研究報(bào)道。

本研究首次從mRNA及蛋白質(zhì)水平檢測(cè)了DDR2在ccRCC及其癌旁正常腎臟組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)DDR2在ccRCC中的表達(dá)是降低的，而且DDR2的低表達(dá)與ccRCC的臨床進(jìn)展具有相關(guān)性，且ccRCC的Fuhrman分級(jí)和TNM分期越高，DDR2的表達(dá)越低。這些都提示DDR2的低表達(dá)與腎癌的發(fā)生、發(fā)展具有一定的關(guān)系，我們推測(cè)和肺癌中相似，DDR2可能在ccRCC中扮演抑癌基因的角色，但是具體的機(jī)制還不明確。

綜上所述，DDR2在ccRCC中的表達(dá)明顯低于癌旁正常腎臟組織，且其表達(dá)量與腎癌的臨床分期和病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，提示DDR2可能在ccRCC中扮演抑癌基因的角色。但是具體的分子機(jī)制還需行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。另外本實(shí)驗(yàn)樣本量也不大，仍需國(guó)內(nèi)外多中心、大樣本的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

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(本文編輯：徐漢玲)

Expression and clinical significance of DDR2 protein in clear cell renal cell cancer

WANGLei*,WANGYang,WUXiao-rong,SHAJian-jun,CHENYong-hui,XUEWei,BOJuan-jie,LIUDong-ming,HUANGYi-ran．*DepartmentofUrology,RenJiHospital,SchoolofMedicineShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200001,China

Correspondingauthor:LIUDong-ming,E-mail:liudm541@126.com

Objective To explore the expression of DDR2 in clear cell renal cell carcinoma(ccRCC) and normal renal tissues,and analysize its clinical significance. Methods The expression of DDR2 protein in specimens of ccRCC and adjacent normal renal tissues were detected by immunohistochemistry and qRT-PCR，their correlations of clinicopathologic features were analyzed． Results DDR2 protein and mRNA levels were abnormally decreased in ccRCC when compared with adjacent normal renal tissues(P<0.05),which showed negative correlation with ccRCC TNM stages and ccRCC clinic stages(P<0.05). Conclusions The expression of DDR2 were decreased in ccRCC and had relationship with clinical stage and histological grade,which indicated that DDR2 may play a role as tumor suppressor gene in ccRCC.However,further studies are needed to confirm these findings.

Clear cell renal cell carcinoma; DDR2; Tumor suppressor genes

200001 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科(王雷、吳小榮、沙建軍、陳勇輝、薛蔚、薄雋杰、劉東明、黃翼然)；江西省撫州市臨川區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科(王陽(yáng))

劉東明，E-mail：liudm541@126.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2015.06.010

2015-11-20)