孔有琴陳立僑丁志麗李二超葉金云杜震宇

(1. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200241; 2. 湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開(kāi)發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖州 313000)

日本沼蝦MT基因克隆、組織差異性表達(dá)及與飼料銅、鋅含量的相關(guān)性

孔有琴1, 2陳立僑1丁志麗1, 2李二超1葉金云2杜震宇1

(1. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200241; 2. 湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開(kāi)發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖州 313000)

為了更全面理解日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)的銅/鋅營(yíng)養(yǎng)生理作用, 研究利用RACE技術(shù)從日本沼蝦肝胰腺中克隆獲得一金屬硫蛋白基因cDNA全長(zhǎng)(mn-MT), 并對(duì)該基因分子特征、組織表達(dá)譜和飼料銅/鋅水平對(duì)其表達(dá)的影響進(jìn)行分析。結(jié)果顯示: (1)mn-MT cDNA全長(zhǎng)665 bp, 含編碼59個(gè)氨基酸的180 bp的開(kāi)放閱讀框, 預(yù)測(cè)該多肽的理論分子量為6.085 kD, 等電點(diǎn)為7.73。該蛋白中半胱氨酸含量最高(30.5%),其次是賴(lài)氨酸(16.95%)和絲氨酸(10.17%)。相似性分析顯示 mn-MT氨基酸序列與美洲海螯蝦、斑節(jié)對(duì)蝦和中華絨螯蟹MT的相似性分別達(dá)到78%、75%和75%。(2)qRT-PCR分析顯示, mn-MT mRNA在肝胰腺、血細(xì)胞、鰓、胃、卵巢、腸和肌肉中都有表達(dá), 其中肝胰腺中表達(dá)量最高。(3)用4組銅添加量分別為0、20、40及160 mg/kg的飼料和3組鋅添加水平分別為0、35和210 mg/kg的飼料飼喂初重為(0.101±0.002) g日本沼蝦56d后, 分析各組蝦肝胰腺的mn-MT mRNA表達(dá)。mn-MT mRNA表達(dá)隨飼料銅水平的提高而升高, 到40 mg/kg組達(dá)到最高(P＜0.05), 而后開(kāi)始下降; 飼料中高鋅(210 mg/kg)顯著提高mn-MT表達(dá)(P＜0.05), 0和35 mg/kg組間差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果表明飼料中銅/鋅均可影響mn-MT表達(dá), 且呈現(xiàn)不同的劑量依賴(lài)效應(yīng)。

日本沼蝦; 金屬硫蛋白; 銅; 鋅; mRNA表達(dá)

金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)是一類(lèi)低分子量、分布廣、保守的金屬結(jié)合蛋白, 其氨基酸組成中含有大量半胱氨酸, 對(duì)金屬離子具有高親和力,參與微量元素的吸收、代謝, 還具有清除自由基、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗應(yīng)激的作用[1, 2]。1957年, MT首次在馬(Equus caballus)腎中被發(fā)現(xiàn)[3]。MT作為一種可被誘導(dǎo)的蛋白質(zhì), 其表達(dá)受多種金屬暴露[4—6]、感染和輻射等其他物化處理[7, 8]的誘導(dǎo), 其中金屬離子是主要的誘導(dǎo)因子, 如水體鎘、銅或鋅暴露均可顯著提高朝鮮(Hemibarbus mylodon)肝臟和腎臟中MT表達(dá)水平[9]。

銅和鋅均是動(dòng)物體生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)所必需的微量元素, 具重要生理功能[10], 金屬硫蛋白對(duì)它們具有較強(qiáng)的結(jié)合力, 形成銅/鋅-金屬硫蛋白復(fù)合物[11]。迄今, 學(xué)者對(duì)水體中銅/鋅暴露對(duì)水生動(dòng)物MT表達(dá)影響研究較多, 且側(cè)重于探討 MT作為水環(huán)境污染生物標(biāo)記分子的篩選等[5]。銅/鋅是動(dòng)物體所必需的微量元素, 分析飼料中銅/鋅水平與MT表達(dá)間關(guān)系可以更全面、深入理解銅/鋅的營(yíng)養(yǎng)生理, 此類(lèi)研究多見(jiàn)于脊椎動(dòng)物[12]。

日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)又稱(chēng)河蝦、青蝦, 屬甲殼綱、十足目、長(zhǎng)臂蝦科, 是我國(guó)主要淡水養(yǎng)殖品種之一。近年來(lái), 我國(guó)日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展, 推動(dòng)對(duì)其生物學(xué)特性、營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)研究的需求, 但目前對(duì)日本沼蝦的基礎(chǔ)研究還較薄弱。關(guān)于微量元素銅/鋅只有飼料中適宜需求量確定、銅/鋅水平對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能、抗氧化力影響等的報(bào)道[13, 14]。為深入理解營(yíng)養(yǎng)素的功能和作用機(jī)制,探討分析營(yíng)養(yǎng)素對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響已成為水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究重點(diǎn)之一。本研究通過(guò)克隆日本沼蝦 MT基因, 并分析各組織中的表達(dá)變化, 旨在了解日本沼蝦MT基因的結(jié)構(gòu)、功能和組織表達(dá)特征;同時(shí)觀(guān)測(cè)飼料中銅/鋅水平變化對(duì)MT基因表達(dá)的影響, 以期為日本沼蝦 MT基因作用機(jī)制和微量元素代謝機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用日本沼蝦于2013年3—5月購(gòu)于上海市普陀區(qū)銅川路水產(chǎn)市場(chǎng), 先于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用曝氣自來(lái)水暫養(yǎng)一周, 而后選取健康活潑的個(gè)體, 活體解剖取肝胰腺、鰓、腸、肌肉、卵巢和胃等組織, –80℃保存, 用于總RNA提取。同時(shí)用1 mL無(wú)菌注射器從日本沼蝦第三步足基部采集血淋巴, 加入等量預(yù)冷的抗凝劑[15], 4℃、8000 ×g離心10min, 收集血細(xì)胞, –80℃保存, 用于總RNA提取。

1.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用組織/細(xì)胞 RNA快速提取試劑盒(Aidlab,北京)提取總RNA, 提取的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性, 與此同時(shí), RNA純度和濃度用Thermo NanoDrop 2000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)。用 Takara (大連)反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 并于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 mn-MT基因cDNA克隆

從本實(shí)驗(yàn)室的日本沼蝦cDNA文庫(kù)中獲得一條MT的EST序列。根據(jù)該EST序列設(shè)計(jì)引物mnMT-3′GSP和 mnMT-5′GSP(生工合成, 上海, 表 1)各一條用于3′和5′-RACE擴(kuò)增mn-MT cDNA全長(zhǎng)。運(yùn)用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clonch,美國(guó))將日本沼蝦肝胰腺總 RNA分別反轉(zhuǎn)錄合成3′-RACE cDNA和5′-RACE cDNA, 而后根據(jù)該試劑盒推薦的條件以這些cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用柱式DNA膠回收試劑盒(生工, 上海)回收純化后與pUCm-T載體(生工, 上海)連接, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α, 選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序(生工, 上海)。所得序列經(jīng)NCBI的BLAST比對(duì)確定屬于MT基因。

1.4 mn-MT序列分析

用 NCBI的 ORF Finder程序(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/)尋找 mn-MT序列的開(kāi)放閱讀框和預(yù)測(cè)編碼氨基酸序列; 用NCBI BLAST程序(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)比較 MT的序列相似性; 日本沼蝦MT基因的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中其他動(dòng)物 MT的氨基酸序列的多重比對(duì)分析使用ClustalX軟件, 而后使用MEGA 5.1程序(http://www. megasoftware.net/)中的Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。

1.5 mn-MT在不同組織中的表達(dá)

用熒光定量PCR (qRT-PCR)對(duì)MT在日本沼蝦肝胰腺、肌肉、鰓、腸、血細(xì)胞、卵巢和胃中表達(dá)進(jìn)行定量分析, β-actin作為qRT-PCR反應(yīng)中的內(nèi)參基因。qRT-PCR中, mn-MT和β-actin基因的特定引物分別是mnMT-s、mnMT-a、β-actin-s 和β-actin-a(表 1)。采用 Takara的實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒 SYBR Premix Ex Taq 進(jìn)行 PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體積為20 μL, 包括10 μL 2 × SYBR Green Premix Ex Taq、引物(10 μmol/L)各 0.2 μL、1 μL cDNA、8.6 μL ddH2O。qRT-PCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性30s; 94℃變性15s、58℃退火20s、72℃延伸 20s, 共40個(gè)循環(huán); PCR反應(yīng)后繪制融解曲線(xiàn)以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性, 溫度以0.5℃/5s的速度從60℃上升到95℃。使用2–ΔΔCt方法對(duì)mn-MT表達(dá)水平進(jìn)行分析[16]。

表1 引物序列Tab. 1 The primer sequence

1.6 飼料中銅/鋅水平對(duì)mn-MT mRNA表達(dá)的影響

以酪蛋白和魚(yú)粉作為蛋白源, 魚(yú)油和大豆油作為脂肪源配制半純化基礎(chǔ)飼料。根據(jù)日本沼蝦對(duì)飼料銅/鋅的需求量[13, 14], 添加相應(yīng)含量硫酸銅/硫酸鋅(分析純?cè)噭? 國(guó)藥集團(tuán), 上海)到基礎(chǔ)飼料中, 配制4組銅添加量分別為0、20、40和160 mg/kg飼料的實(shí)驗(yàn)飼料和 3組鋅添加量分別為 0、35和210 mg/kg飼料的實(shí)驗(yàn)飼料。實(shí)驗(yàn)飼料按照Li等[17]方法制作自然風(fēng)干后用自封袋密閉封裝于–20℃保存?zhèn)溆谩ｏ暳吓浞胶椭饕獱I(yíng)養(yǎng)成分分析見(jiàn)表 2。飼料中銅含量的實(shí)測(cè)值分別為 2.8、20.9、43.1和157.1 mg/kg, 鋅含量的實(shí)測(cè)值分別為 10.3、45.2和211.2 mg/kg。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)于2013年7—9月在上海市金山區(qū)漕涇名特優(yōu)水產(chǎn)品養(yǎng)殖示范基地進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用日本沼蝦購(gòu)自浙江省湖州市南潯區(qū)一養(yǎng)殖場(chǎng), 正式實(shí)驗(yàn)前先暫養(yǎng)1周。而后選擇健康活潑、平均初始體重為(0.101±0.002) g的蝦隨機(jī)放入到21只體積為300 L的塑料水箱中, 每只水箱中放入50尾蝦。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)共分為7組, 每組3個(gè)平行, 正式養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)時(shí)間共持續(xù) 56d。實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氧保持溶氧＞6.5 mg/L。養(yǎng)殖的水質(zhì)條件為: 水溫27—30℃, 總氨氮＜0.1 mg/L。養(yǎng)殖期間光照為自然光照。養(yǎng)殖水為自然河水, 水中銅含量為 1.2—1.6 μg/L、鋅含量為14—18 μg/L。在56d養(yǎng)殖結(jié)束后, 養(yǎng)殖蝦停止飼喂12h, 活體解剖蝦取肝胰腺–80℃保存用于總RNA提取。用 qRT-PCR分析飼料銅/鋅水平對(duì) mn-MT mRNA表達(dá)的影響。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的表示方式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD), 采用SPSS 16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA), 若處理組間存在顯著差異, 再進(jìn)行 Duncan’s多重比較, 顯著性差異設(shè)置水平為P＜0.05。

表2 實(shí)驗(yàn)飼料配方和營(yíng)養(yǎng)成分分析Tab. 2 Ingredients and approximate compositions of experimental diets (%)

2 結(jié)果

2.1 mn-MT序列特征

通過(guò)RACE技術(shù), 克隆獲得mn-MT cDNA全長(zhǎng)為665 bp(GenBank登錄號(hào)為KJ415090), 包括75 bp 的5′-非翻譯區(qū)、410 bp含polyA的3′-非翻譯區(qū)和180 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)。ORF編碼59個(gè)氨基酸的多肽, 其蛋白質(zhì)的理論分子量為6.085 kD、等電點(diǎn)為7.73。該蛋白中半胱氨酸含量最高, 達(dá)30.5%, 其次是賴(lài)氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸, 含量分別為16.95%、10.17%、8.47%和8.47%, 不含有芳香族氨基酸和組氨酸等, 含有無(wú)脊椎動(dòng)物金屬硫蛋白的特征序列Cys-X-Cys、Cys-X-X-Cys和Cys-X-X-X-Cys。

NCBI的BLAST比對(duì)分析結(jié)果顯示, 日本沼蝦MT的氨基酸序列與其他無(wú)脊椎動(dòng)物 MT氨基酸序列相似性較高, 其中與美洲海螯蝦(Homarus americanus)、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)和中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)的相似性分別達(dá)到78%、75%和75%。運(yùn)用Mega 5.1軟件中NJ法對(duì)24種MT氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。發(fā)育樹(shù)中脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物各分為一支, 在無(wú)脊椎動(dòng)物分支中, 日本沼蝦與斑節(jié)對(duì)蝦、羅氏沼蝦(M. rosenbergii)等歸為一分支。

2.2 mn-MT在日本沼蝦不同組織中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示 mn-MT在所檢測(cè)的日本沼蝦各組織中都有表達(dá), 其中肝胰腺中表達(dá)量最高并顯著高于所檢測(cè)的其他組織(P＜0.05), 其次是血細(xì)胞(P＜0.05), 鰓、胃、卵巢、腸和肌肉中表達(dá)量最低,有些組織甚至幾乎檢測(cè)不到(圖2)。

2.3 飼料銅/鋅水平對(duì)mn-MT mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示, 日本沼蝦幼蝦肝胰腺 MT mRNA的表達(dá)水平隨飼料銅水平升高而升高, 到40 mg/kg組達(dá)到最大(P＜0.05), 而后開(kāi)始下降, 0、20 和160 mg/kg組間的MT mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著差異(P＞0.05, 圖3)。飼料鋅水平也顯著影響日本沼蝦肝胰腺M(fèi)T mRNA表達(dá), 高鋅(210 mg/kg)顯著提高M(jìn)T表達(dá)(P＜0.05), 0和 35 mg/kg組間差異不顯著(P＞0.05, 圖4)

3 討論

3.1 mn-MT分子特征

圖1 基于MT氨基酸序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 The phylogenetic tree based on the sequences of metallothionein from different species

圖2 mn-MT基因在各組織的相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 The expression of mn-MT in different tissues shown by qRT-PCR

圖3 飼料銅水平對(duì)mn-MT mRNA表達(dá)的影響Fig. 3 The effect of dietary copper on the relative expression of mn-MT

圖4 飼料鋅水平對(duì)mn-MT mRNA表達(dá)的影響Fig. 4 The effect of dietary zinc on the relative expression of mn-MT

MT是一種富含半胱氨酸的小分子量蛋白質(zhì),主要生理功能是重金屬解毒、清除自由基和參與一些微量元素代謝等[18—20]。本研究克隆mn-MT cDNA全長(zhǎng)并分析其表達(dá)特征。mn-MT編碼的 59個(gè)氨基酸的多肽具有分子量小、半胱氨酸含量最高、賴(lài)氨酸和脯氨酸含量也相對(duì)較高等特征, 這與其他甲殼動(dòng)物研究結(jié)果類(lèi)似[21], 半胱氨酸殘基數(shù)與甲殼動(dòng)物特有的18個(gè)半胱氨酸殘基數(shù)一致[22, 23]。在多肽序列中, 賴(lài)氨酸殘基多數(shù)伴隨著半胱氨酸殘基出現(xiàn), 且含量?jī)H次于半胱氨酸, 這可能與穩(wěn)固金屬硫蛋白與金屬離子的相互作用有關(guān)[24]。mn-MT中的半胱氨酸分布也具有典型的無(wú)脊椎動(dòng)物金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)特征, 有5個(gè)Cys-X-Cys重復(fù)(CDC、CQC、CKC、CEC、CKC)、2個(gè)Cys-X-X-Cys重復(fù)(CTSC、CDPC)和3 個(gè)Cys-X-X-X-Cys重復(fù)(CKTGC、CASKC、CAKNC),這些結(jié)構(gòu)的重復(fù)數(shù)與中華絨螯蟹 MT完全一致[25],但與斑節(jié)對(duì)蝦稍有差異[21]。mn-MT特征序列(CEKCASKCECS)與已報(bào)道的無(wú)脊椎動(dòng)物 MT的特征序列(CKCXXXCXCX, X為除了半胱氨酸之外的其他氨基酸)只有一個(gè)氨基酸的差別。mn-MT中半胱氨酸的這些重復(fù)分布結(jié)構(gòu)可能與金屬離子的螯合有關(guān)[26, 27]。

基于 MT氨基酸序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中, 脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物分為兩個(gè)獨(dú)立的分支, 這與傳統(tǒng)的分類(lèi)學(xué)結(jié)果一致。mn-MT與其他甲殼動(dòng)物 MT的相似性很高, 如與美洲海螯蝦和斑節(jié)對(duì)蝦的相似性分別達(dá)到78%和75%, 說(shuō)明mn-MT很保守、同屬于甲殼動(dòng)物家族的MT具有類(lèi)似的特有序列、在進(jìn)化上也相關(guān)[28]。

3.2 mn-MT在各組織種的表達(dá)

MT參與機(jī)體的多種生物過(guò)程[29], 所以研究者發(fā)現(xiàn) MT在所檢測(cè)組織中基本都有表達(dá), 而且不同物種中其組織表達(dá)有一定的差異。在脊椎動(dòng)物中, MT在卵巢、睪丸、肝臟、腎臟、鰓、腸、大腦、眼中都有一定量的表達(dá)[4, 9]; 在無(wú)脊椎動(dòng)物中, MT在肝胰腺、心臟、生殖腺、腎臟、神經(jīng)組織和消化腺組織等表達(dá)量都較高[8, 24, 30—32]。在本研究中, mn-MT在所分析的蝦的肝胰腺、血細(xì)胞、胃、腸、卵巢、鰓和肌肉各組織中都有表達(dá), 肝胰腺中表達(dá)量最高, 這與石蟹(Charybdis japonica)[31]、龍蝦(Homarus americanus)[30]、眼斑龍蝦(Panulirus argus)[8]和中華絨螯蟹[25]等結(jié)果類(lèi)似, 可能是因?yàn)榧讱?dòng)物肝胰腺作為一種多功能器官, 在維持體內(nèi)金屬元素動(dòng)態(tài)平衡和解毒重金屬中毒方面所起的核心作用有關(guān)[33, 34]。mn-MT在卵巢中也有一定的表達(dá),說(shuō)明可能與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[35]、中華絨螯蟹[25]、斑節(jié)對(duì)蝦[21]類(lèi)似, mn-MT在蝦發(fā)育中也起著重要作用, 但具體機(jī)制需要深入研究。

3.3 飼料中銅/鋅水平對(duì)mn-MT mRNA表達(dá)的影響

MT氨基酸組成中含有大量半胱氨酸, 對(duì)金屬離子具有高親和力, 其表達(dá)量受多種重金屬暴露的誘導(dǎo)[36]。大量研究顯示動(dòng)物的金屬硫蛋白表達(dá)量受水體銅[8, 25]、鋅[8, 37]等金屬元素濃度的影響。如隨著水體暴露銅濃度的升高, 中華絨螯蟹MT mRNA表達(dá)表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)[25]; 按3 mg/kg體重的劑量給大鼠腹腔單獨(dú)注射銅也會(huì)顯著提高其肝臟MT含量, 但飼喂銅含量為1.8 g/kg的飼料并不能提高大鼠 MT的表達(dá), 作者認(rèn)為可能是因?yàn)殂~劑量太低或是時(shí)間太短不足以誘導(dǎo)MT的高表達(dá)[12]。據(jù)報(bào)道飼料中添加高鋅也可顯著提高大鼠肝臟[38]、斜紋夜蛾(Spodoptera litura)中腸[39]的MT水平。目前關(guān)于飼料中銅、鋅水平對(duì)甲殼動(dòng)物金屬硫蛋白表達(dá)影響的還鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示日本沼蝦肝胰腺M(fèi)T mRNA表達(dá)均受飼料銅、鋅水平的影響, 且都顯示出劑量依賴(lài)效應(yīng)。mn-MT mRNA表達(dá)隨著飼料銅水平的升高而升高, 在40 mg/kg組達(dá)到最大, 而后呈下降趨勢(shì), 與水體銅濃度對(duì)中華絨螯蟹 MT表達(dá)影響的變化趨勢(shì)類(lèi)似[25]。同樣mn-MT表達(dá)也隨著飼料鋅水平的升高而升高, 高鋅組達(dá)到最高。徐振華等[40]研究發(fā)現(xiàn)飼料鋅水平也顯著影響新西蘭肉兔肝臟 MT表達(dá)水平, 且表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)?？梢?jiàn), 飼料鋅水平對(duì)機(jī)體 MT表達(dá)的影響存在物種差性, 且mn-MT表達(dá)隨飼料銅、鋅水平變化對(duì)也表現(xiàn)出不同劑量依賴(lài)效應(yīng), 具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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MOLECULAR CLONING, TISSUE-SPECIFIC EXPRESSION AND RELEVANCE TO DIETARY COPPER AND ZINC OF GENE METALLOTHIONEIN IN MACROBRACHIUM NIPPONENSE

KONG You-Qin1, 2, CHEN Li-Qiao1, DING Zhi-Li1, 2, LI Er-Chao1, YE Jin-Yun2and DU Zhen-Yu1
(1. College of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China; 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Aquatic Resources Conservation and Development, College of Life Sciences, Huzhou University, Huzhou 313000, China)

Metallothionein (MT) is a metal binding protein with low molecular weight. The expression of MT can be induced by minerals such as copper or zinc, and it is involved in the metabolism of trace elements. To better understand the physiological and nutritional effects of copper and zinc on Macrobrachium nipponense, we cloned mn-MT from the oriental river prawn using rapid amplification of the cDNA ends (RACE), and evaluated the effects of dietary copper and zinc on the expression of MT. The full length of mn-MT cDNA was 665 bp, and it had a 180 bp open reading frame (ORF) encoding a 59aa peptide. The calculated molecular weight of the peptide was 6.085 kD and the predicted isoelectric point was 7.73. The most abundant amino acid in this protein was cysteine residues (30.5%), followed by lysine (16.95%) and serine (10.17%). The similarity analysis showed that mn-MT shared the similarities of 78%, 75% and 75% with the counterparts in the Homarus americanus, Penaeus monodon and Eriocheir sinensis respectively. Quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) analysis showed that the mn-MT mRNA was expressed in the hepatopancreas, gill, hemocytes, intestine, ovary, muscles and stomach, with the highest level in the hepatopancreas. M. nipponense were fed for 56 days with seven different diets supplemented with Cu at 0, 20, 40 and 160 mg/kg diet and Zn at 0, 35, 210 mg/kg diet, and then we analyzed the expression of mn-MT mRNA in the hepatopancreas. The expression of mn-MT mRNA was first elevated along with the increase in dietary Cu level, reached to the maximum at 40 mg/kg diet, and then dropped as the Cu concentration was further increased. The expression of mn-MT mRNA was higher in prawns fed with high Zn (210 mg/kg diet) than that in prawns fed with 35 mg Zn/kg diet or 0 mg Zn/kg diet (P＜0.05). There was no significant difference between the 0 mg Zn/kg group and the 35 mg Zn/kg group (P＞0.05). These results suggested that the expression of mn-MT mRNA could be affected by dietary copper and zinc with different dose-dependent response curves.

Macrobrachium nipponense; Metallothionein; Copper; Zinc; mRNA expression

S966.1

A

1000-3207(2015)06-1126-08

10.7541/2015.148

2014-11-20;

2015-03-10

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201003020, 201203065);“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD25B00); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172422); 上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目(10JC1404100); 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LQ14C190004)資助

孔有琴(1977—), 女, 浙江長(zhǎng)興人; 博士; 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究。E-mail: susankuq@hutc.zj.cn

陳立僑, 教授, 博士生導(dǎo)師; E-mail: lqchen@bio.ecnu.edu.cn