孫青山 賈原 張俊萍

·基礎(chǔ)研究·

穿膜肽介導(dǎo)p53抗原多肽致敏DC的體外抗瘤效應(yīng)

孫青山 賈原 張俊萍

目的探討細(xì)胞穿膜肽(cpps)介導(dǎo)p53致敏樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)獲得細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，檢測(cè)其體外對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的殺傷效果。方法抽取健康志愿者外周血50ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)，獲得DC細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。將Tat49－57－p53264－272致敏DC細(xì)胞，待DC細(xì)胞成熟后與T淋巴細(xì)胞混合誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL，并設(shè)PBS與P53為對(duì)照。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)致敏前后DC細(xì)胞的表型，并采用乳酸脫氫酶(LDH)法檢測(cè)抗原肽疫苗致敏DC后獲得CTL對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1的體外殺傷活性，同時(shí)與人白血病細(xì)胞株jurkat的殺傷作用進(jìn)行比較。結(jié)果致敏前DC中CD80、CD86表達(dá)率分別為(15．9±2．1)%、(19．1±2．3)%，而致敏后分別為(17．4±1．7)%、(18．7 ±1．1)%，致敏前后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0．05。實(shí)驗(yàn)組穿膜肽可延長(zhǎng)p53抗原多肽在DC細(xì)胞內(nèi)半衰期，從而增強(qiáng)與DC細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的MHC I類分子的結(jié)合率，并提呈到細(xì)胞表面。實(shí)驗(yàn)組CTL對(duì)結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞的殺傷能力顯著強(qiáng)于對(duì)照組，且隨著效靶比的增加，殺傷活性逐漸增強(qiáng)(P＜0．05)。Tat49－57－p53264－272多肽致敏DC活化CTL對(duì)DLD1細(xì)胞具有特異性殺傷作用，對(duì)DLD1的殺傷作用顯著強(qiáng)于jurkat細(xì)胞(P＜0．05)。結(jié)論穿膜肽可以增強(qiáng)p53抗原多肽的免疫原性，Tat49－57－p53264－272多肽致敏DC能有效誘導(dǎo)抗結(jié)腸癌DLD1細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。

結(jié)腸癌;樹(shù)突狀細(xì)胞;細(xì)胞穿膜肽;p53;腫瘤免疫治療

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:949～953)

p53基因作為抑癌基因，當(dāng)發(fā)生缺失或突變后可促使細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起重要作用。研究顯示p53蛋白在結(jié)腸癌中的突變率達(dá)到50%［1］，因此可為結(jié)腸癌的早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。突變的p53蛋白常常在腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定的過(guò)度表達(dá)，大量臨床研究證實(shí)過(guò)表達(dá)的p53蛋白具有免疫原性可誘導(dǎo)特異性的CTLs［2－3］。因此，p53蛋白理論上可作為腫瘤抗原成為腫瘤特異性免疫治療的靶標(biāo)。

細(xì)胞穿透肽(CPPs)，能夠穿透細(xì)胞膜攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入不同性質(zhì)的活細(xì)胞內(nèi)［4］。CPPs作為1種細(xì)胞滲透性多肽，可攜帶多種物質(zhì)，如DNA，RNA，多肽，蛋白，小分子化合物等，具有廣泛的組織相容性、穩(wěn)定性、低毒性和低免疫原性、可人工合成相對(duì)簡(jiǎn)便等［5］優(yōu)點(diǎn)。Wangrongfu等［6］報(bào)道顯示，利用CPPs可顯著提升HLA限制性多肽的DC細(xì)胞穿膜效率，且半衰期顯著延長(zhǎng)。一系列的研究顯示，由此引發(fā)的CTL免疫效應(yīng)能高表達(dá)CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)，同時(shí)IFN－y，GMCSF的表達(dá)水平都顯著提高。說(shuō)明該CPPs是有效的。

本研究擬采用細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPPs)攜帶p53抗原多肽致敏DC獲得抗原特異性CTL，檢測(cè)其體外對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的殺傷效果，探索1種療效更明顯、更安全、免疫反應(yīng)更具有特異性的p53疫苗提供新思路。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞和多肽

結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1和白血病細(xì)胞株Jurkat由本實(shí)驗(yàn)室保存。p53抗原多肽p53264－272LLGRNSFEV(L9 V)［7］，Tat49－57－p53264－272多肽(RKKRRQRRR－LLGRNSFEV)購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1．2 試劑和耗材

CD3 McAb(古巴分子免疫中心)，rhGM－CSF(遼寧衛(wèi)星生物制品研究所)，rhIL－4(peprotech公司)，rhIL－2 (北京四環(huán)生物制藥)，RPMI 1640(賽默飛世爾生物有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)，10%的胎牛血清(杭州四季青)，F(xiàn)icoll分離液(天津?yàn)?，F(xiàn)ITC標(biāo)記CD80mAb，PE標(biāo)記CD86 mAb，F(xiàn)ITC標(biāo)記Tat49－57－p53264－272，F(xiàn)ITC標(biāo)記p53264－272均自備，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯)，離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1．3 樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)

采集健康志愿者外周血50 ml，肝素鈉(10 ml)抗凝。加入等量淋巴細(xì)胞分離液于4℃、2 100 r/min、離心10 min。吸取單個(gè)核細(xì)胞層，加入0．9%氯化鈉50 ml混勻，離心去除淋巴細(xì)胞分離液。經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，懸浮于1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～6 h，貼壁細(xì)胞即為DC前體細(xì)胞，加入GM－CSF(800 U/ml)和IL－4(1 000 U/ml)繼續(xù)培養(yǎng)，隔天半量換液，第5 d加入TNF－α(20 ng/ml)誘導(dǎo)成熟DC;并收集成熟DC應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，于第7天收獲細(xì)胞備用。

1．4 淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)

取未貼壁的細(xì)胞加入175 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，加入含10 IU/mL IL－2的AIM－V培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，隔日半量換液，培養(yǎng)第7天收獲淋巴細(xì)胞備用。

1．5 熒光倒置顯微鏡觀察

熒光異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記。脫鹽柱純化收集多肽。

將制備的抗原多肽(p53264－272，CPP－p53264－272，濃度為1 mg/ml)，與用0．1 mol·L－1NaHCO3－NaOH pH 9．0配制的100 mmol·L－1Fluorescein－5－isothiocyanate (FITC)溶液混合標(biāo)記，4℃避光過(guò)夜反應(yīng)。反應(yīng)混合液再經(jīng)凝膠柱(P10)脫鹽去除多肽樣品中游離的FITC，用Hepes緩沖液(0．02 mol·L－1Hepes，pH7．4，0．1 mol·L－1NaCl，1 mmol·L－1DTT)洗脫，并根據(jù)公式［protein］=［A280－A494×0．3］/ε計(jì)算偶聯(lián)FITC的多肽濃度。實(shí)驗(yàn)組樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)和對(duì)照組DC，于培養(yǎng)的第7 d分別加入FITC－Tat49－57－p53264－272抗原多肽和FITC－p53264－272(終濃度為100 ng/ ml)，37℃、5%CO2環(huán)境中孵育2 h。經(jīng)洗滌后熒光鏡下觀察半衰期和熒光強(qiáng)度。

1．6 DC表型的檢測(cè)

棄上清培養(yǎng)液，加DC培養(yǎng)液(1640培養(yǎng)基+ 10%血清+1 000 U/ml IL－4，1 000 U/ml GM－CSF)，并加入TNF－a用于刺激DC細(xì)胞成熟。取培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至106個(gè)/mL，加入熒光抗體CD80－FITC和CD86－PE，避光放置30 min，洗滌3次上流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)。

1．7 DC－T細(xì)胞共同培養(yǎng)誘導(dǎo)特異性CTL

第9 d，將刺激成熟的DC細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)。同時(shí)計(jì)數(shù)。共培養(yǎng)5 d。隔天換液(1640培養(yǎng)基+10%血清+1 000 U/ml，120 IU IL－2)。第15 d時(shí)，計(jì)數(shù)細(xì)胞。同時(shí)對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行流失細(xì)胞檢測(cè)。

1．8 CTL在體外的殺傷實(shí)驗(yàn)及活性的檢測(cè)

效應(yīng)細(xì)胞CTL與靶細(xì)胞DLD1細(xì)胞混合放入U(xiǎn)型96孔酶標(biāo)板中，反應(yīng)體系為200 μl，設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，每孔加入1×105個(gè)靶細(xì)胞，效靶比分別為10∶1、20∶1、50∶1，然后以1 200 r/min離心2 min，37℃5%CO2分別孵育4 h，每孔加入6 μl置于冰浴5 min，洗滌3次，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)殺傷活性。

1．9 LDH法檢測(cè)CTL細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1的殺傷作用

以DC－CTL細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞DLD1為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按10∶1、20∶1、50∶1的比例加入96孔U型板中，每孔含靶細(xì)胞1×104個(gè)，終體積為200 ml，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37℃、5%CO2孵育箱中混合培養(yǎng)4 h后，用冷1 640培養(yǎng)液50 μl/孔，中止效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞反應(yīng)，1 500 r/min，離心5 min，收集上清，加入LDH反應(yīng)液，每孔100 μl，室溫避光孵育30 min后，每孔加1 mol/L HCl 50 μl終止酶促反應(yīng)，去除孔中含有的氣泡，1 h內(nèi)檢測(cè)吸收值(490 nm)，取3孔均值。計(jì)算CTL殺傷率，細(xì)胞殺傷率(%) =［(實(shí)驗(yàn)組釋放－效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放－靶細(xì)胞自發(fā)釋放)/(靶細(xì)胞最大釋放－靶細(xì)胞自發(fā)釋放)］×100%。

1．10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 cpp－p53致敏DC后形態(tài)及熒光強(qiáng)度

從培養(yǎng)第2～3 d后DC細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則改變，體積變大，周邊可見(jiàn)少量細(xì)小樹(shù)突狀突起。第5 d加入rhTNF－α后細(xì)胞體積增大，細(xì)胞表面出現(xiàn)大量毛刺狀突觸，部分細(xì)胞開(kāi)始懸浮，聚集成大小不等的細(xì)胞團(tuán)，呈典型的樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)，與正常DC相比，無(wú)明顯差異，提示Tat49－57－p53264－272致敏并不影響DC的生長(zhǎng)。第7 d將FITC－ccp－p53和FITC－p53分別與成熟的DC細(xì)胞共同培養(yǎng)2 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)cpp－p53穿膜進(jìn)入DC的效果要明顯強(qiáng)于單純p53。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組(FITCCPP－P53)熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于對(duì)照組(圖1A)，結(jié)果顯示，P53致敏的DC，其熒光猝滅速度快于CPP－P53、FITC－p53，其半衰期大約為2．5 h，而FITC－CPP－P53半衰期約為10 h(圖1B)。上述結(jié)果說(shuō)明，CPP－P53具有較高的穿膜效率，能長(zhǎng)時(shí)間滯留在DC細(xì)胞內(nèi)。

圖1 熒光圖

2．2 Tat49－57－p53264－272致敏DC后的表型

Tat49－57－p53264－272致敏DC后CD80 CD86表達(dá)率無(wú)顯著性增高［(15．9±2．1)%vs(17．4±1．7)%，(19．1±2．3)%vs(18．7±1．1)%，P＞0．05］，顯示CPP抗原肽的致敏對(duì)DC表型無(wú)顯著影響，說(shuō)明CPPP53致敏DC是通過(guò)其穿膜效應(yīng)促進(jìn)抗原肽進(jìn)入DC細(xì)胞膜，而不影響DC成熟(圖2)。

2．3 DC誘導(dǎo)CTL活化及表型分析

DC培養(yǎng)成熟后與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，定期觀察，倒置顯微鏡下顯示T淋巴細(xì)胞顯著擴(kuò)增，且隨著細(xì)胞數(shù)量的增加出現(xiàn)聚團(tuán)集落。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗原肽致敏DC后體外誘導(dǎo)CTL表型，結(jié)果顯示，CPP－P53組較單純P53組及空白組，CD3+CD8+細(xì)胞明顯增加［(73．4±9．18)%vs(58．1±8．43)%］(P＜0．05)，

有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，圖3)。

表1 CTL亞群表型分析/%

圖3 T細(xì)胞亞型分析

2．4 LDH測(cè)定CTL殺傷活性

效靶比相同時(shí)，經(jīng)Tat49－57－p53264－272致敏DC細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL對(duì)DLD1細(xì)胞的殺傷率高于實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照(P＜0．05)。且隨著效靶比的增加殺傷活性也隨之增強(qiáng)(表2，圖4)。在效靶比一定時(shí)，空白對(duì)照組對(duì)DLD1細(xì)胞和jurkat細(xì)胞的殺傷活性無(wú)明顯差異，而Tat49－57－p53264－272致敏DC和p53264－272致敏DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL對(duì)DLD1細(xì)胞的殺傷活性均強(qiáng)于對(duì)jurkat細(xì)胞的殺傷活性，且Tat49－57－p53264－272顯著高于p53264－272的殺傷活性，其差異有顯著性，P＜0．05(圖5)。

表2 CTL對(duì)DLD1細(xì)胞殺傷率比較(±s，%)

表2 CTL對(duì)DLD1細(xì)胞殺傷率比較(±s，%)

注:CPP－p53與p53組比較，P＜0．05;PBS與CPP－p53比較，P＜0．05。

10∶120∶150∶1 CPP－p53組組別效靶比4．1±1．36．9±2．79．7±3．4 14．4±8．622．2±7．936．9±8．2 p53組12．1±3．315．8±4．723．4±6．9 PBS組

圖4 CPP－p53和p53致敏后DC誘導(dǎo)的CTL及PBS對(duì)DLD1細(xì)胞的殺傷率

圖5 TCPP－p53和p53致敏后DC誘導(dǎo)的CTL及PBS對(duì)DLD1和Jurkat細(xì)胞的殺傷率

3 討論

p53蛋白1979年首次發(fā)現(xiàn)，是人類細(xì)胞中最重要的抑癌基因之一，野生型p53基因具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。研究資料表明野生型p53基因是一個(gè)重要的抑癌基因，在50%～70%的結(jié)腸癌中有突變［7－8］。且這些突變的p53蛋白往往在腫瘤細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定過(guò)度表達(dá)，而在正常細(xì)胞內(nèi)p53很少內(nèi)p53很少內(nèi)p53很少或檢測(cè)不到［9］。腫瘤細(xì)胞內(nèi)堆積的p53蛋白降解產(chǎn)物可以與MHCⅠ類和Ⅱ類分子結(jié)合，在腫瘤細(xì)胞表面呈遞，從而被特異性CTL識(shí)

別，使針對(duì)腫瘤細(xì)胞p53的機(jī)體免疫成為可能［10］。

DC細(xì)胞是已知體內(nèi)功能最強(qiáng)、唯一能活化靜息T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，是啟動(dòng)、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。通過(guò)大量體外活化培養(yǎng)負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。人類惡性腫瘤約50%有p53突變，因此其成為腫瘤免疫療法潛在的靶向抗原。在大多數(shù)試驗(yàn)中，以p53作為腫瘤特異性抗原疫苗誘導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)能觀察到，但不是很明顯［11］。其中的關(guān)鍵的原因就是與p53抗原肽的免疫原性低有關(guān)，p53蛋白穩(wěn)定性差在體內(nèi)易降解［12］，與DC的結(jié)合率較低。所以解決的關(guān)鍵就在于增強(qiáng)p53蛋白的穩(wěn)定性和提高p53與DC的結(jié)合率。

CPPs是1種由30個(gè)或者更少氨基酸組成的能夠穿透細(xì)胞膜的多肽，能夠運(yùn)載包括藥物在內(nèi)的許多物質(zhì)。CPPs是一類以非受體依賴方式，非經(jīng)典內(nèi)吞方式直接穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的多肽，能夠運(yùn)載多種生物學(xué)活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)活性和治療作用，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高且不會(huì)造成細(xì)胞損傷［13］。這一特性保證了CPPs攜帶各種大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的高效輸送。

本研究中，經(jīng)Cpp－p53致敏DC多肽疫苗活化的誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL對(duì)高表達(dá)p53的結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1的殺傷力顯著高于jurkat。表明所產(chǎn)生的p53特異性的CTL對(duì)p53高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞具有特異性的殺傷作用。在效靶比相同的情況下，Cpp－p53致敏DC多肽疫苗活化的誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL對(duì)DLD1細(xì)胞的殺傷活性明顯高于對(duì)照組，表明CPPs可以有效的攜帶p53抗原肽進(jìn)入DC細(xì)胞，延長(zhǎng)p53抗原肽在細(xì)胞內(nèi)的降解和延緩其半衰期從而增強(qiáng)其與DC細(xì)胞的結(jié)合，通過(guò)MHCⅠ類分子途徑有效地提呈腫瘤特異性抗原，并活化T細(xì)胞從而產(chǎn)生對(duì)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞具有特異性的CTL。以上結(jié)果表明Cpp－p53致敏DC細(xì)胞能誘導(dǎo)強(qiáng)大的抗結(jié)腸癌癌細(xì)胞株DLD1的免疫作用，為Cpp－p53致敏DC疫苗在結(jié)腸癌癌免疫治療的體內(nèi)試驗(yàn)和臨床應(yīng)用研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示實(shí)驗(yàn)組(FITC－CPP－p53)熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組，且p53致敏的DC熒光猝滅速度遠(yuǎn)快于CPP－p53，而FITC－CPP－p53半衰期約為FITC－p53 4倍。上述結(jié)果說(shuō)明，CPP－p53具有較好的穿膜效率，能長(zhǎng)時(shí)間滯留在DC細(xì)胞內(nèi)，且可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的MHC－Ⅰ類分子提呈抗原多肽分布于細(xì)胞膜表面上，發(fā)揮其穿膜效應(yīng)，而這與一般APC細(xì)胞提呈多肽類疫苗作用機(jī)制不同(APC細(xì)胞通過(guò)膜上MHC－Ⅱ類分子提呈抗原)，因此CPP－p53致敏DC實(shí)際上可能存在2種機(jī)制(MHC－Ⅰ，MHC－Ⅱ)共同作用的結(jié)果，①通過(guò)CPP穿膜提呈MHC－Ⅰ類分子;②P53與DC細(xì)胞膜上MHC－Ⅱ類分子直接結(jié)合提呈到TCR。而上述過(guò)程可能并不涉及DC細(xì)胞的成熟，而是通過(guò)2種機(jī)制致敏并提呈TCR。

總之，我們采用Tat49－57－p53264－272致敏DC疫苗的策略得到了很好的驗(yàn)證，說(shuō)明CPPs可以增強(qiáng)腫瘤抗原肽的免疫原性，在腫瘤疫苗的研究中具有巨大的潛在價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)將CPPs與腫瘤相關(guān)抗原向結(jié)合，以p53蛋白為例，刺激樹(shù)突狀細(xì)胞以獲得特異性CTL，進(jìn)而開(kāi)發(fā)1種有效的腫瘤疫苗。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谝泽w外實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，最終達(dá)到臨床應(yīng)用。而僅以p53單一對(duì)象涉及腫瘤疫苗具有一定的局限性。多抗原協(xié)同作用，多種CTL相互結(jié)合是我們的最終目的。因此在后續(xù)試驗(yàn)中，將CEA、HER2、MAGE3等抗原與CPP聯(lián)合應(yīng)用，形成一個(gè)更加有效的腫瘤DC疫苗。

［1］陳奇，曾照芳．p53基因突變與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的關(guān)聯(lián)〔J〕．激光雜志，2012，33(2):79－80．

［2］de Vries A，F(xiàn)lores ER，Miranda B，et al．Targeted point mutations of p53 lead to dominant－negative inhibition of wildtype p53 function〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，2002，99 (5):2948－53．

［3］Shan，SG，Bao YF，Chen XJ．Research progress in anticancer immunotherapy of wild－type p53 peptides〔J〕．J Chin Oncol，2011，17(8):630－632．

［4］M?ger I，Langel K，Lehto T，et al．The role of endocytosis on the uptake kinetics of luciferin－conjugated cell－penetrating peptides〔J〕．Biochim Biophys Acta，2012，1818(3):502－511．

［5］Matsuzaki K，Sugishita K，Miyajima K．Interactions of an antimicrobial peptide，magainin 2，with lipopolysaccharidecontaining liposomes as a model for outer membranes of gram－negative bacteria〔J〕．FEBS Lett，1999，449(2/3): 221－224．

［6］Wang RF，Wang HY．Enhancement of antitumor immunity by prolonging antigen presentation on dendritic cells〔J〕．Nat Biotechnol，2002，20(2):149－154．

［7］Dong SM，Traverso G，Johnson C，et al．Detecting colorectal cancer in stool with t he use of multiple genet ic targets〔J〕．J Natl Cancer Inst，2001，93(1):858－865．［8］Tagore K，Lawson M，Yucaitis J，et al．Sensitivity and specificity of a stool DNA multitarget assay panel for the detection of advanced colorectal neoplasia〔J〕．Clin Colorectal Cancer，2003，3(1):47－53．

［9］Roxburgh P，Hock AK，Dickens MP，et al．Small molecules that bind the Mdm2 RING stabilize and activate p53〔J〕．Carcinogenesis，2012，33(4):791－798．

［10］Bowne WB，Wolchok JD，Ha wkins WG，et al．Injection of DNA encoding granulocyte－macrophage colony－stimulating factor recruits dendritic cells for immune adjuvant effects〔J〕．Cytokines Cell Mol Ther，1999，5(4):217－225．

［11］Vermeij R，Leffers N，van der Burg S H，et al．Immunological and clinical effects of vaccines targeting p53－overexpressing malignancies〔J〕．J Biomed Biotechnol，2011，2011:702146．

［12］Tian J，Wang ZG，Ren JL，et al．Preparation of a new cellpenetrating peptides as gene vector〔J〕．Third Mil Med Univ，2011，33(24):2562－2566．

［13］任錦，欽傳光，徐春蘭，等．細(xì)胞穿膜肽作為藥物載體的研究進(jìn)展〔J〕．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(1):17－25．

Anti-tumor Effect of Penetrating Peptide-mediated p53 on Antigen Peptide Pulsed DC in vitro

SUN Qingshan，JIA Yuan，ZHANG Junping．Shanxi Academy of Medical Science，Shanxi Dayi Hospital，Taiyuan，030001

ObjectiveTo investigate the cell penetrating peptide to carry p53 antigen pulsed dendritic cells(DC)induced antigen specific cytotoxic T lymphocytes，and in vitro the killing effect on colon cancer cell lines．MethodsMononuclear cells were extracted form 50mL peripheral blood of healthy volunteers using lymphocyte separation liquid，using different cytokines induce cultured DC cells and T lymphocytes．Tat49－57－p53264－272antigen peptide were prepared，and poured into DC cells．DC was mixed with T lymphocyte to induce CTL，Phenotype were respectively detected in penetratin sensitized and unsensitized DC by flow cytometry，Lactate dehydrogenase detected the activity of DLD1 colon cancer cell lines that were killed by Tat49－57－p53264－272induced activation of CTL sensitive DC peptide vaccine，and compared with the killing effect on human leukemia cell line Jurkat．ResultsSensitization of former DC CD80，CD86 expression was respectively(15．9±2．1)%，(19．1±2．3)%，while after sensitization of DC CD80，CD86 expression was(17．4±1．7)%，respectively(18．7±1．1)%，the difference was not statistically significant，P＞0．05．The experimental group of cell penetrating peptide can prolong the half－life of P53 peptide antigen，enhanced binding and DC cell surface MHC class I molecules binding rate，and far higher than that in the control group(P＜0．05)．The experimental group cytotoxic lymphocyte on colon cancer DLD1 cell killing was significantly higher compared with the control group，and with the increase of effect or target ratio，killing activity increased gradually．The killing activity of Tat49－57－p53264－272was significantly higher than p53264－272(P＜0．05)．Cytotoxicity of Tat49－57－p53264－272sensitized DC polypeptide vaccine activated CTL with specific killing to DLD1 cells，the killing effect of DLD1 was significantly stronger than the killing effect on Jurkat cells(P＜0．05)．ConclusionMembrane penetrating peptides can enhance the immunogenicity of P53 peptide antigen，Tat49－57－p53264－272sensitized DC polypeptide vaccine can induce specific immune response against colon cancer DLD1 cells，and provide experimental basis for membrane penetrating peptides in further research and clinical application of tumor vaccine．

Colon cancer;Dendritic cells;Cell penetrating peptides;p53;Tumor immunotherapy

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．07．001

R73－36

:A

:1001－5930(2015)07－0949－05

2014－04－08

2015－06－11)

(編輯:吳小紅)

030001山西醫(yī)科大學(xué)研究生院(孫青山);030001山西大醫(yī)院腫瘤生物治療科(孫青山，賈原，張俊萍)

張俊萍