羅敏 張娟 薛軍

樹突狀細胞共培養(yǎng)因子誘導的殺傷細胞聯(lián)合化療治療中晚期非小細胞肺癌的臨床療效

羅敏 張娟 薛軍

目的探討樹突狀細胞與細胞因子誘導的殺傷細胞共培養(yǎng)對細胞因子誘導的殺傷細胞的作用及兩者共培養(yǎng)后聯(lián)合化療藥物奧沙利鉑對中晚期非小細胞肺癌的體外殺傷效果。方法取非小細胞癌患者的惡性胸腔積液并采取密度梯度離心法獲得樹突狀細胞，體外誘導獲得成熟的樹突狀細胞;分離健康人的單核細胞，體外培養(yǎng)獲取殺傷細胞;兩者共培養(yǎng)后流式細胞鑒定表型，采用MTT法檢測中晚期非小細胞肺癌的體外殺傷作用。結果惡性胸腔積液內樹突前體細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)之后獲得了成熟的樹突細胞，培養(yǎng)9天以后獲得樹突細胞表明標志物CD83、CD80、CD86和MHC-II相關分子HLA-DR比培養(yǎng)前顯著增高(P＜0．05);培養(yǎng)2周之后樹突細胞和殺傷細胞共培養(yǎng)與殺傷細胞單獨培養(yǎng)比較CD3+、CD4+、CD8+數(shù)量明顯增加，組間比較具有統(tǒng)計學差異(P＜0．05)。樹突細胞和殺傷細胞對中晚期非小細胞肺癌有著抑制作用，殺傷力大于單純使用殺傷細胞組，組間比較具有統(tǒng)計學差異(P＜0．05)。樹突細胞和殺傷細胞共培養(yǎng)聯(lián)合化療藥物奧沙利鉑對中晚期非小細胞肺癌的體外殺傷具有聯(lián)合增效的作用，組間比較具有統(tǒng)計學差異(P＜0．05)。結論惡性胸腔積液來源的樹突前體細胞可以誘導培養(yǎng)獲得成熟的樹突細胞，成熟的樹突細胞聯(lián)合殺傷細胞可以促進殺傷細胞的增殖及殺傷力，兩者共培養(yǎng)聯(lián)合化療藥物奧沙利鉑具有協(xié)同增強中晚期非小細胞肺癌的體外殺傷作用。

樹突細胞;細胞因子;殺傷細胞;化療藥物;非小細胞肺癌

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:1112～1115)

肺癌是致死率較高的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，非小細胞肺癌約占肺癌的70%以上，

且大多確診時已經(jīng)是中晚期，常并發(fā)惡性的胸腔積液。目前對并發(fā)惡性胸腔積液的非小細胞肺癌的臨床治療效果有限，生存率低［1］。腫瘤的生物治療是醫(yī)學生物學和免疫學相關學科，通過增強機體的免疫功能達到抑制惡性腫瘤的作用，近年來個體化綜合化治療已經(jīng)成為治療肺癌的治療模式，生物治療不僅具有副作用小，同時能夠起到協(xié)同殺傷腫瘤細胞的作用，給腫瘤治療帶來了新的治療希望，但目前生物治療和化療聯(lián)合應用模式還處于探討階段［2-3］。樹突狀細胞和殺傷細胞作為生物學治療的重要方式，研究已發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合治療取得了一定的治療效果，但是與化療藥物的聯(lián)合應用情況仍在探索階段［4］。本研究旨在探討通過惡性胸腔積液體外培養(yǎng)獲得成熟樹突細胞，并與外源性的殺傷細胞共培養(yǎng)后，聯(lián)合化療藥物奧沙利鉑對中晚期非小細胞肺癌的體外腫瘤細胞殺傷作用，為該疾病的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

納入我院2013年1月至2014年11月我院經(jīng)過纖支鏡、經(jīng)皮穿刺、痰液、淋巴穿刺等方法確診為中晚期非小細胞肺癌患者50例，收集每例患者的800 ml胸腔積液，同時收集我院體檢中心體檢的健康人群外周血200 ml。

1．2 儀器和試劑

培養(yǎng)基采用PRMI1640(美國GⅠBCO公司)，含血清的完全培養(yǎng)基(美國Santa Cruz公司)，重組人巨噬細胞集落刺激因子(美國靈葆雅公司)，白細胞介素-4、腫瘤壞死因子α(上海碩盟生物)，CD83、CD80、CD86和MHC-II相關分子HLA-DR(武漢博士德)，CD3+、CD4+、CD8+(美國Santa Cruz公司)，干擾素-γ、白細胞介素-2(上海碧云天生物)，淋巴細胞分離液(中國科學院血液研究所)，中晚期非小細胞肺癌細胞系(中國科學院細胞庫)，MTT試劑盒(美國GⅠBCO公司)，酶聯(lián)免疫儀(德國BiofugeStratos)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)，流式細胞儀(澳大利亞Rotorgene)。

1．3 研究方法

1．3．1 惡性胸腔積液獲取樹突前體細胞收集惡性胸腔積液，離心之后取上清，通過淋巴細胞分離液將細胞懸液分析，并將細胞懸液和淋巴細胞分離液混合離心20 min，2 000 r/min，對層間液進行收集，并重懸之后種于細胞培養(yǎng)6孔板中，在標準37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)10 min，取懸浮細胞，丟棄貼壁細胞，再在6孔板中培養(yǎng)2 h后，去除懸浮細胞，洗滌培養(yǎng)板，去除上清后，加入含有白細胞介素-4、重組人粒巨噬細胞集落刺激因子、含雙抗的10%以上的胎牛血清培養(yǎng)基，每3天進行一次換液，同時補充以上細胞因子繼續(xù)培養(yǎng)，9天的時候收集樹突細胞。

1．3．2 殺傷細胞的培養(yǎng)納入我院同一時期體檢科檢查的健康人群外周血，離心分離獲得外周血的單核細胞，6孔板中培養(yǎng)2 h，收集未貼壁細胞，繼續(xù)使用培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時加入干擾素-γ、第2天加入CD3，第3天加入白介素-2，同樣每3天進行一次細胞換液，加入細胞因子。

1．3．3 殺傷細胞聯(lián)合樹突細胞共培養(yǎng)樹突細胞和殺傷細胞培養(yǎng)，按照1∶5的比例混合，共培養(yǎng)2周，并進行每3天進行一次細胞換液，加入細胞因子。

1．4 檢測方法

1．4．1 細胞表型檢測應用流式細胞儀在培養(yǎng)前及培養(yǎng)9天時對樹突細胞的表面標記物CD83、CD80、CD86和MHC-II相關分子HLA-DR進行檢測，培養(yǎng)14天的時候對殺傷細胞和樹突細胞-殺傷細胞的表明標志物CD3+、CD4+、CD8+進行檢測。

1．4．2 樹突細胞-殺傷細胞共培養(yǎng)之后對其殺傷力檢測通過調整中晚期非小細胞癌的培養(yǎng)濃度，讓其成為研究的靶細胞，運用殺傷細胞和樹突細胞-殺傷細胞去干預其效應，干預的濃度調整為5∶1，10∶1和20∶1，培養(yǎng)24 h之后采用MTT法對其殺傷力進行檢測，統(tǒng)計殺傷率。

1．4．3 運用MTT法檢測殺傷細胞和樹突細胞-殺傷細胞聯(lián)合化療藥物奧沙利鉑對中晚期非小細胞癌體外的殺傷效果調整中晚期非小細胞癌的濃度至6孔板100 μl，24 h貼壁生長之后加入化療藥物奧沙利鉑，再24 h之后加入5∶1，10∶1和20∶1樹突細胞-殺傷細胞，同時設立對照組，共培養(yǎng)24 h之后采用MTT法對其聯(lián)合的殺傷活性進行檢測。

1．5 統(tǒng)計學方法

所有收集的數(shù)據(jù)資料均妥善存檔，采用SPSS 21．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。本研究中計量資料數(shù)據(jù)正態(tài)分布資料采用(±s)表示，非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)表示。遵循正態(tài)分布而且方差齊性，故組間的比較采用獨立樣本t檢驗，百分率的比較采用χ2檢驗，P＜0．05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 樹突細胞的表面標志物檢測

通過流式細胞儀的檢測方法對培養(yǎng)9天之后的成熟樹突細胞的表面標志物CD83、CD80、CD86和MHCII相關分子HLA-DR進行檢測，結果顯示，培養(yǎng)9天以后獲得樹突細胞表明標志物比培養(yǎng)前顯著增高，比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，見表1。

表1 樹突細胞的表面標志物檢測(±s，%)

表1 樹突細胞的表面標志物檢測(±s，%)

注:①為與培養(yǎng)前相比，P＜0．05。

CD83CD80CD86HLA-DR培養(yǎng)前14．87±5．38①18．85±9．35①20．32±6．25①41．82±8．38組別①培養(yǎng)9天56．87±17．3858．86±14．0960．12±13．0370．87±16．38 t 0．0000．0000．0000．000 12．12623．4588．0456．965 P

2．2 表面標志物CD3+、CD4+、CD8+的檢測

培養(yǎng)14天的時候對殺傷細胞和樹突細胞-殺傷細胞的表面標志物CD3+、CD4+、CD8+進行檢測，結果顯示，培養(yǎng)14天之后樹突細胞和殺傷細胞共培養(yǎng)與殺傷細胞單獨培養(yǎng)比較CD3+、CD4+、CD8+數(shù)量明顯增加，組間比較具有統(tǒng)計學差異(P＜0．05)，見表2。

表2 表面標志物檢測(±s，%)

表2 表面標志物檢測(±s，%)

78．87±12．3530．85±6．3567．38±16．25樹突細胞和殺傷細胞共培養(yǎng)83．85±12．5838．86±8．0973．15±18．03 t CD3+CD4+CD8+殺傷細胞組別8．8647．7826．237 P 0．0000．0000．000

2．3 樹突細胞-殺傷細胞共培養(yǎng)之后對中晚期非小細胞肺癌殺傷力

通過調整中晚期非小細胞肺癌的培養(yǎng)濃度，讓其成為研究的靶細胞，運用殺傷細胞和樹突細胞-殺傷細胞去干預其效應，結果顯示，樹突細胞-殺傷細胞對中晚期非小細胞癌有著抑制作用，殺傷力大于單純使用殺傷細胞組，組間比較具有統(tǒng)計學差異(P＜0．05)，見表3。

表3 樹突細胞-殺傷細胞共培養(yǎng)之后對中晚期非小細胞癌殺傷力(±s，%)

表3 樹突細胞-殺傷細胞共培養(yǎng)之后對中晚期非小細胞癌殺傷力(±s，%)

注:①為與殺傷細胞相比，P＜0．05。

14．58±2．3519．45±1．4529．72±1．25樹突細胞-殺傷細胞共培養(yǎng)26．85±2．10①34．86±2．59①49．53±3．03①t殺傷細胞干預濃度5∶110∶120∶1殺傷細胞組別樹突細胞-0．0000．0000．000 19．45315．35713．575 P

2．4 運用MTT法檢測殺傷細胞和樹突細胞-殺傷細胞聯(lián)合化療藥物奧沙利鉑對中晚期非小細胞癌體外的殺傷效果

加入不同劑量的化療藥物奧沙利鉑，再24 h之后加入5∶1，10∶1和20∶1樹突細胞-殺傷細胞，共培養(yǎng)24 h之后采用MTT法對其聯(lián)合的殺傷活性進行檢測，結果顯示，單獨使用奧沙利鉑對中晚期非小細胞肺癌的體外殺傷作用隨著濃度的增加而增加(P＜0．05)，樹突細胞-殺傷細胞對中晚期非小細胞肺癌的體外殺傷作用同樣隨著濃度的增加而增加(P＜0．05)，聯(lián)合使用奧沙利鉑及樹突細胞-殺傷細胞起到聯(lián)合增強的作用，見表4。

3 討論

肺癌已經(jīng)成為全球死亡率最高的腫瘤之一，發(fā)病率居所有的惡性腫瘤首位，據(jù)統(tǒng)計每年的新發(fā)死亡病例是惡性腫瘤之首，其中非小細胞肺癌占肺癌總數(shù)的75%以上，多數(shù)患者確診時已經(jīng)是中晚期［5-7］。隨著藥物的不斷發(fā)展，治療方法也不斷改善，但是其耐藥性問題一直存在，治療效果欠佳，5年的生存率不到15%，因此尋找新的治療方法具有重要的臨床意義［8］。生物反應調節(jié)的提出，給腫瘤的發(fā)展帶來了一定的希望，

其是通過激活體內的自然防御功能，調節(jié)機體的正常生物反應動態(tài)平衡，以激活機體的免疫功能，達到抑制腫瘤的作用。樹突細胞是目前為止在體內功能最強大的抗原提呈細胞，可以促進T細胞的免疫應答反應，調節(jié)機體的免疫應答［9］。殺傷細胞是由人體的外周血分離而來，通過體外的細胞因子誘導獲得，其具有增殖迅速、抗腫瘤等特點。樹突細胞和殺傷細胞是腫瘤免疫治療的重要組成部分，通過樹突細胞進行抗原的識別，激活免疫系統(tǒng)，通過殺傷細胞對自身分泌的毒性物質進行清除，已有研究發(fā)現(xiàn)兩者的共培養(yǎng)可以增強細胞的毒性，具有更強的增殖活性［10-11］。

本研究通過中晚期非小細胞癌患者的惡性胸腔積液來源的樹突細胞及體外誘導培養(yǎng)的殺傷細胞進行共同培養(yǎng)，通過細胞的表型鑒定發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液內樹突前體細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)之后獲得了成熟的樹突細胞，培養(yǎng)9天以后獲得樹突細胞表明標志物CD83、CD80、CD86和MHC-II相關分子HLA-DR比培養(yǎng)前顯著增高;培養(yǎng)2周之后樹突細胞和殺傷細胞共培養(yǎng)與殺傷細胞單獨培養(yǎng)比較CD3+、CD4+、CD8+數(shù)量明顯增加;樹突細胞-殺傷細胞對中晚期非小細胞癌有著抑制作用，殺傷力大于單純使用殺傷細胞組。結果表明了聯(lián)合使用對中晚期非小細胞癌具有更強的殺傷作用，有利于醋精兩者的作用的協(xié)同效應。

隨著腫瘤研究的不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)個體化的綜合治療方法運用是一種新的治療模式，已成為腫瘤治療的重要趨勢，化療藥物的應用在臨床中已取得了公認的治療效果，其細胞毒性對于殺傷機體活躍的細胞，對機體免疫力的調節(jié)具有動搖的作用，但是化療藥物又有其局限性，不利于抗腫瘤的免疫應答，不能有效的清除處于休眠期的腫瘤細胞，使患者病情反復，且使用后也容易出現(xiàn)耐藥的發(fā)生［12-13］。研究發(fā)現(xiàn)生物治療聯(lián)合化療的綜合治療方法在臨床實踐中具有較好的治療效果，可以誘發(fā)機體的多種免疫防疫體系，對于休眠期細胞具有徹底的殺傷作用，有效提高腫瘤化療藥物的敏感性，抵抗耐藥作用［14］。鉑類化療藥物作為非小細胞癌的治療主要藥物，其在藥動學和毒理學上與之前的化療藥物有一定改進，最為明顯的差別就是不產(chǎn)生交叉耐藥，其可以通過DNA為靶點，抑制其復制，可誘導腫瘤細胞的免疫原性反應，促進腫瘤細胞的凋亡，且這些免疫原物質可以通過樹突細胞的表明受體進行呈遞，激活機體對腫瘤細胞的免疫應答反應［15］。本研究結果顯示，樹突細胞和殺傷細胞共培養(yǎng)聯(lián)合化療藥物奧沙利鉑對中晚期非小細胞肺癌的體外殺傷作用明顯高于未聯(lián)合組，結果提示了化療藥物奧沙利鉑聯(lián)合樹突細胞和殺傷細胞對中晚期非小細胞肺癌具有更好的殺傷作用，這也給腫瘤化療及生物免疫資料的臨床應用提供了一定理論基礎。

綜上所述，通過本研究可以看出化療藥物奧沙利鉑聯(lián)合樹突細胞和殺傷細胞對中晚期非小細胞肺癌具有更好的治療效果，更重要的是聯(lián)合應用之后可以大大減少化療藥物的使用劑量，在一定程度上減輕了化療藥物對機體產(chǎn)生的不良反應，對患者的治療起積極的作用。由于體外研究與應用于臨床還有一段路要走，期待有更多的研究在此基礎上不斷完善。

表4 殺傷細胞和樹突細胞-殺傷細胞聯(lián)合化療藥物對中晚期非小細胞癌體外的殺傷效果［(±s)，%］

表4 殺傷細胞和樹突細胞-殺傷細胞聯(lián)合化療藥物對中晚期非小細胞癌體外的殺傷效果［(±s)，%］

=0．000樹突細胞-殺傷細胞組間比較F=89．210P=0．000奧沙利鉑-樹突細胞-殺傷細胞組間比較F=71．153P組別樹突細胞-殺傷細胞干預濃度26．88±1．8434．52±2．5549．53±2．98奧沙利鉑(12．5 μg/ml)2．86±1．1530．76±1．7540．52±2．6554．54±2．54奧沙利鉑(25．0 μg/ml)10．25±2．5839．87±2．9548．56±2．9562．86±4．55奧沙利鉑(50．0 μg/ml)29．65±2．4560．56±3．5570．56±3．1589．84±8．65奧沙利鉑組間比較F=52．153P 0∶05∶110∶120∶1奧沙利鉑(0．0 μg/ml)0 =0．000

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Clinical Efficacy of Dendritic Cells Co-cultured with Cytokine Induced Killer Cells Combined with Chemotherapy for Middle and Advanced Non-small Cell Lung Cancer

LUO Min，ZHANG Juan，XUE Jun．Daye Nonferrous Metals Corporation General Hospital，Huangshi，435005

ObjectiveTo investigate the effect of co-culture of dendritic cells and cytokine-induced killer cells on cytokine-induced killer cells，and the 2 co-cultured cells combined with oxaliplatin for advanced non-small cell lung cancer．MethodsPatients with non-small cell lung cancer and malignant pleural effusions take density gradient centrifugation dendritic cells in vitro to obtain mature dendritic cells;from healthy patients monocytes in vitro obtained killer cells;2 cells were identified by flow cytometry after co-culture phenotypes，in vitro cytotoxicity was analyzed by MTT assay in advanced non-small cell lung cancer．ResultsMalignant pleural effusion dendritic precursor cells were obtained after in vitro maturation of dendritic cells，dendritic cells cultured 9 days and showed markers CD83，CD80，CD86 and MHC-II related HLA-DR molecules than former culture were significantly higher(P＜0．05);after 2 weeks in dendritic cells co-cultured with killer cells and killer cells cultured alone，CD3+，CD4+，CD8+number increased significantly，there had statistically significant difference(P＜0．05)between groups．Dendritic cells-killer cells in patients with advanced non-small cell lung cancer had inhibited the use of lethal than simply killer cells，there had statistical difference(P＜0．05)．Dendritic cells co-cultured with killer cells in combination with oxaliplatin for advanced non-small cell lung cancer has the effect of killing in vitro，there had statistically difference(P＜0．05)．ConclusionMalignant pleural effusion derived dendritic cell precursors can induce mature dendritic cells cultured，mature dendritic cells combined with killer cells can promote the proliferation and lethal of killer cells，combined with oxaliplatin can enhancement killing effect of advanced non-small cell lung cancer．

Dendritic cells;Cytokines;Killer cells;Chemotherapeutic drug;Non-small cell lung cancer

10．3969/j．issn．1001-5930．2015．08．002

R734．2

A

1001-5930(2015)08-1112-04

2015-05-08

2015-07-09)

(編輯:甘艷)

湖北省自然科學基金面上項目(2012FFB02423)

435005湖北省大冶有色金屬集團公司總醫(yī)院(羅敏，張娟);430022華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院(薛軍)

薛軍