劉紅英

·論著·

一氧化碳釋放分子對病毒性心肌炎小鼠的保護作用及其作用機制研究

劉紅英

目的探討一氧化碳釋放分子(CORM)對病毒性心肌炎(VMC)小鼠的保護作用及其作用機制。方法將45只4周齡雄性純種BALB/C小鼠隨機分為正常對照組、空白對照組及CORM干預組，每組15只，制備VMC模型，CORM干預組小鼠予以3 mg/ml CORM溶液0．1 ml腹腔注射，正常對照組和空白對照組小鼠予以二甲基亞砜0．1 ml腹腔注射，記錄各組小鼠死亡數(shù)量，檢測各組小鼠血清心肌肌鈣蛋白I(cTnI)濃度及心肌勻漿液丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)、過氧化氫酶(CAT)、IL－1β、IL－6、IL－18、腫瘤壞死因子α(TNF－α)濃度，計算各組小鼠心肌病變積分。結(jié)果正常對照組、CORM干預組小鼠病死率均低于空白對照組(P＜0．05);空白對照組血清cTnI濃度、心肌病變積分高于正常對照組和CORM干預組，CORM干預組血清cTnI濃度、心肌病變積分高于正常對照組(P＜0．05)?？瞻讓φ战M心肌勻漿液MDA濃度高于正常對照組和CORM干預組，心肌勻漿液SOD、GSH－Px、CAT濃度低于正常對照組和CORM干預組，而CORM干預組心肌勻漿液MDA濃度高于正常對照組，心肌勻漿液SOD、GSH－Px、CAT濃度低于正常對照組(P＜0．05)?？瞻讓φ战M心肌勻漿液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α濃度高于正常對照組和CORM干預組，CORM干預組心肌勻漿液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α濃度高于正常對照組(P＜0．05)。結(jié)論CORM可降低VMC小鼠病死率及心肌損傷，具有一定的保護作用，其作用機制可能包括抑制脂質(zhì)過氧化、減輕炎性反應等。

心肌炎;病毒性疾病;一氧化碳釋放分子;氧化性應激;炎癥;小鼠，近交BALB C

病毒性心肌炎(VMC)是指由柯薩奇B組病毒(CVB)等親心肌病毒感染所致的彌漫性或局限性心肌炎性病變，是臨床常見的心血管疾病之一。近年研究證實，氧化應激及炎性反應在VMC的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［1］。一氧化碳(CO)是繼一氧化氮(NO)和硫化氫(H2S)之后發(fā)現(xiàn)的重要的氣體信號分子，其在體內(nèi)主要由血紅素氧合酶(HO)催化血紅素降解產(chǎn)生［2］。一氧化碳釋放分子(CORM)是一種由過渡金屬組成的羰基化合物，在生理條件下可持續(xù)地釋放CO，可作為較好的外源性CO供體［3］。研究發(fā)現(xiàn)，CORM對某些炎性疾病(如牙周炎等)具有保護作用［4］，但目前關于其對VMC保護作用的研究報道較少。本研究通過柯薩奇B3病毒(CVB3)Nancy株感染BALB/C小鼠而建立VMC動物模型，觀察CORM對VMC小鼠病死率、血清心肌肌鈣蛋白I(cTnI)濃度、心肌病變、氧化應激物質(zhì)及炎性遞質(zhì)的影響，探討CORM對VMC小鼠的保護作用及其作用機制，為VMC的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料實驗組動物為4周齡雄性純種BALB/C小鼠，共45只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，批號:SCXK京2002－0003，體質(zhì)量12～16 g，無特定病原體(SPF)環(huán)境飼養(yǎng)。CORM購于美國Sigma公司，實驗時需溶解于二甲基亞砜制成3 mg/ml溶液。CVB3 Nancy株Hela細胞感染率(TCID50)為1 ×107，實驗時用量為1×102TCID50。

1．2 模型制備將45只小鼠隨機分為正常對照組、空白對照組和CORM干預組，每組15只。正常對照組小鼠腹腔內(nèi)注射不含CVB3的Eagle's液0．1 ml，空白對照組、CORM干預組小鼠腹腔注射相同劑量的含1×102TCID50CVB3的Eagle's液0．1 ml，建立VMC動物模型。各組小鼠均造模成功，次日CORM干預組小鼠予以3 mg/ml CORM溶液0．1 ml腹腔注射，正常對照組和空白對照組小鼠予以二甲基亞砜0．1 ml腹腔注射，均為1次/d，連續(xù)注射2周，記錄各組小鼠死亡數(shù)量。2周后，采集各組存活小鼠外周血(用于分離血清)后全部處死，摘取心臟，以左心室中線為界將心臟切為兩半，其中一半固定于10%甲醛溶液，另一半保存于－70℃冰箱。

1．3 HE染色方法常規(guī)石蠟包埋心肌組織，5 μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，常規(guī)HE染色后梯度乙醇脫水、封片，在光鏡下觀察各組小鼠心肌改變。參考文獻［5］中的方法計算心肌病變(炎性浸潤與壞死)積分，即每張切片隨機選擇5個高倍視野，計算每個高倍視野中炎性細胞浸潤和壞死區(qū)域面積占整個視野面積的百分比，取平均值;無病變計0分，病變面積＜25%計1分，病變面積為25%～50%計2分，病變面積為50%～75%計3分，病變面積＞75%計4分。

1．4 血清cTnI濃度檢測方法取50 μl血清，采用化學發(fā)光法檢測各組小鼠血清cTnI濃度，檢測試劑盒購自Dade Behring Inc公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1．5 心肌勻漿液氧化應激物質(zhì)濃度檢測方法取各組小鼠適量心肌組織勻漿，離心、提取上清液，采用BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)檢測蛋白濃度，再采用商業(yè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測心肌勻漿液丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)、過氧化氫酶(CAT)濃度。

1．6 心肌勻漿液炎性遞質(zhì)濃度檢測方法取各組小鼠適量心肌組織勻漿，離心、提取上清液，采用BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)檢測蛋白濃度，再采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組小鼠心肌勻漿液IL－1β、IL－6、IL－18、腫瘤壞死因子α(TNF－α)濃度，試劑盒均由深圳晶美生物技術有限公司提供，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1．7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16．0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析;計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 病死率、血清cTnI濃度及心肌病變積分正常對照組小鼠死亡0只，空白對照組小鼠死亡7只(7/15)，CORM干預組小鼠死亡2只(2/15)，正常對照組、CORM干預組小鼠病死率均低于空白對照組(χ2值分別為0．00、0．05)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，但CORM干預組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0．14，P＞0．05)。3組小鼠血清cTnI濃度、心肌病變積分比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);其中空白對照組血清cTnI濃度、心肌病變積分高于正常對照組和CORM干預組，CORM干預組血清cTnI濃度、心肌病變積分高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，見表1)。

表1 3組小鼠血清cTnI濃度、心肌病變積分比較(±s)Table 1 Comparison of serum cTnI level，myocardial lesions score in the three groups of rats

表1 3組小鼠血清cTnI濃度、心肌病變積分比較(±s)Table 1 Comparison of serum cTnI level，myocardial lesions score in the three groups of rats

注:與正常對照組比較，*P＜0．05;與空白對照組比較，△P＜0．05;cTnI=心肌肌鈣蛋白I

組別只數(shù)cTnI(μg/L)心肌病變積分(分) 150．09±0．020空白對照組80．38±0．07*2．86±0．54*CORM干預組130．15±0．03＊△1．35±0．28＊△F正常對照組0．0000．000 147．31241．93 P值值

2．2 心肌勻漿液氧化應激物質(zhì)濃度3組小鼠心肌勻漿液MDA、SDA、GSH－Px、CAT濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);其中空白對照組心肌勻漿液MDA濃度高于正常對照組和CORM干預組，心肌勻漿液SOD、GSH－Px、CAT濃度低于正常對照組和CORM干預組，而CORM干預組心肌勻漿液MDA濃度高于正常對照組，心肌勻漿液SOD、GSH－Px、CAT濃度低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，見表2)。

表2 3組小鼠心肌勻漿液氧化應激物質(zhì)濃度比較(±s)Table 2 Comparison of oxidative stress index of myocardial serous in the three groups of rats

表2 3組小鼠心肌勻漿液氧化應激物質(zhì)濃度比較(±s)Table 2 Comparison of oxidative stress index of myocardial serous in the three groups of rats

注:與正常對照組比較，*P＜0．05;與空白對照組比較，△P＜0．05;MDA=丙二醛，SOD=超氧化物歧化酶，GSH－Px=谷胱甘肽過氧化物酶，CAT=過氧化氫酶

組別只數(shù)MDA (nmol/mg蛋白) SOD (U/mg蛋白) GSH－Px (U/mg蛋白) CAT (U/mg蛋白)．18空白對照組8138．46±16．31*27．39±3．76*9．56±1．43*16．25±2．83*CORM干預組1383．49±10．48＊△52．18±6．54＊△21．54±3．62＊△31．45±4．37＊△F正常對照組1571．89±9．3767．42±8．1725．71±4．2837．42±6 90．0789．3453．1347．38 P值值0．0000．0000．0000．000

2．3 心肌勻漿液炎性遞質(zhì)濃度3組小鼠心肌勻漿液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);其中空白對照組心肌勻漿液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α濃度高于正常對照組和CORM干預組，CORM干預組心肌勻漿液IL－1β、IL－ 6、IL－18、TNF－α濃度高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，見表3)。

表3 3組小鼠心肌勻漿液炎性遞質(zhì)濃度比較(±s，pg/mg蛋白)Table 3 Comparison of inflammatory mediators levels of myocardial serous in the three groups of rats

表3 3組小鼠心肌勻漿液炎性遞質(zhì)濃度比較(±s，pg/mg蛋白)Table 3 Comparison of inflammatory mediators levels of myocardial serous in the three groups of rats

注:與正常對照組比較，*P＜0．05;與空白對照組比較，△P＜0．05;TNF－α=腫瘤壞死因子α

組別只數(shù)IL－1βIL－6IL－18TNF－α 82空白對照組864．15±9．38*145．39±14．12*58．39±8．85*22．57±4．72*CORM干預組1336．39±5．24＊△83．46±9．58＊△34．47±5．12＊△11．34±1．45＊△F正常對照組1521．46±3．5953．17±8．4726．35±4．166．45±0．139．36209．2381．80117．74 P值值0．0000．0000．0000．000

3 討論

CO是一種氣體分子，與血紅蛋白結(jié)合后可形成碳氧血紅蛋白，導致血紅蛋白失去攜帶氧氣的能力，因此，長期以來CO一直被視為一種毒性氣體。近年研究表明，CO也是機體內(nèi)一種重要的化學氣體信使，具有較強的抗炎、抗凋亡和細胞保護作用［6］。CORM是近年來發(fā)現(xiàn)的一種CO復合物，可作為外源性CO供體，其經(jīng)適當溶劑溶解后能夠在生理條件下可控制地釋放CO。cTnI屬心肌結(jié)構蛋白，當心肌細胞遭破壞后可釋放入血，是目前已知的反映心肌損傷最為敏感和特異的標志物。本研究結(jié)果顯示，正常對照組、CORM干預組小鼠病死率低于空白對照組，空白對照組血清cTnI濃度、心肌病變積分高于正常對照組和CORM干預組，CORM干預組血清cTnI濃度、心肌病變積分高于正常對照組，提示CORM可降低VMC小鼠病死率，減輕心肌損傷，具有一定的保護作用。

氧化應激在VMC的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，病毒感染心肌細胞后可造成細胞膜脂質(zhì)微環(huán)境發(fā)生紊亂、自由基大量產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化反應增強，繼而造成心肌損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，可引起蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的交聯(lián)、聚合，具有細胞毒性，可反映機體脂質(zhì)過氧化程度，從而間接反映細胞損傷情況。SOD、GSH－Px及CAT均為內(nèi)源性抗氧化酶，是細胞內(nèi)一線防御系統(tǒng)，主要通過清除過量活性氧抑制自由基損傷［7］。眾多研究表明，CORM具有較強的抗脂質(zhì)過氧化損傷作用［8］。本研究結(jié)果顯示，空白對照組心肌勻漿液MDA濃度高于正常對照組和CORM干預組，心肌勻漿液SOD、GSH－Px、CAT濃度低于正常對照組和CORM干預組，CORM干預組心肌勻漿液MDA濃度高于正常對照組，心肌勻漿液SOD、GSH－Px、CAT濃度低于正常對照組，提示CORM可增強VMC小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性及其清除氧自由基作用，進而抑制脂質(zhì)過氧化引起的心肌損傷。

研究表明，機體免疫功能紊亂是VMC的主要發(fā)病機制，抗炎治療與免疫治療已成為近年來VMC防治研究的熱點，IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α等促炎性遞質(zhì)在VMC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［9］。近年研究發(fā)現(xiàn)，CORM具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，已用于多種炎性疾病的治療。本研究結(jié)果顯示，空白對照組心肌勻漿液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α濃度高于正常對照組和CORM干預組，CORM干預組心肌勻漿液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α濃度高于正常對照組，提示CORM可抑制IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α等的產(chǎn)生，繼而減輕炎性反應，改善VMC小鼠心功能。抑制炎性反應可能是CORM減輕VMC小鼠心肌損傷的重要作用機制。

綜上所述，CORM可降低VMC小鼠病死率及心肌損傷，具有一定的保護作用，其作用機制可能包括抑制脂質(zhì)過氧化、減輕炎性反應等。本研究為實驗研究，為臨床治療VMC提供了實驗依據(jù)，但其確切作用機制及臨床應用效果仍需進一步深入研究。

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ObjectiveTo investigate the protective effect of carbon monoxide releasing molecule(CORM)on viral myocarditis(VMC)mice，and explore its mechanisms．MethodsFifty－five 4－week old male BALB/C mice were randomly divided into normal control group，blank control group and CORM intervention group，each of 15 mice．VMC experimental models were made，and then CORM intervention group given CORM intraperitoneal injection(0．1 ml)，normal control group and blank control group given DMSO intraperitoneal injection(0．1 ml)．Incidence of death was recorded，serum of cardiac troponin I(cTnI)level and myocardial homogenate levels of malondialdehyde(MDA)，superoxide dismutase(SOD)，glutathione－peroxidase(GSH－Px)，catalase(CAT)，IL－1β，IL－6，IL－18，tumor necrosis factor－α(TNF－α) were detected，myocardial lesions score was calculated．ResultsThe mortality of normal control group and CORM intervention group was lower than that of blank control group，respectively(P＜0．05)．Serum cTnI level，myocardial lesions score of blank control group were higher than those of normal control group and CORM intervention group，and those of CORM intervention group were higher than those of normal control group(P＜0．05)．Myocardial homogenate MDA level of blank control group was higher than that of normal control group and CORM intervention group，respectively，while SOD，GSH－Px，CAT were lower (P＜0．05);myocardial homogenate MDA level of CORM intervention group was higher than that of normal control group，while SOD，GSH－Px，CAT were lower(P＜0．05)．Myocardial homogenate levels of IL－1β，IL－6，IL－18，TNF－α of blankcontrol group were higher than that of normal control group and CORM intervention group，respectively，and those index of CORM intervention group were higher than those of normal control group(P＜0．05)．ConclusionCORM can reduce the mortality and myocardial damage of VMC mice，has certain protective effect;its possible mechanisms including control lipid peroxidation and reduce inflammatory reaction．

Myocarditis;Virus diseases;Carbon monoxide releasing molecule;Oxidative stress;Inflammation; Mice，inbred BALB C

R 542．21

A

10．3969/j．issn．1008－5971．2015．01．013

2014－06－15;

2014－12－10)

(本文編輯:鹿飛飛)

衡陽市科技局科研課題(2011KJ42)

421001湖南省衡陽市，南華大學第一附屬醫(yī)院兒科

劉紅英．一氧化碳釋放分子對病毒性心肌炎小鼠的保護作用及其作用機制研究［J］．實用心腦肺血管病雜志，2015，23(1):41－44．［www．syxnf．net］

Liu HY．Protective effect of carbon monoxide releasing molecule on viral myocarditis mice and its mechanisms［J］．Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(1):41－44．

Protective Effect of Carbon Monoxide Releasing Molecule on Viral Myocarditis Mice and Its MechanismsLIU Hong－Ying．Department of Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421001，China