李華英黃 容杜富寬廖蘭杰李勇明汪亞平

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

草魚CD81基因的克隆及功能分析

李華英1,2黃 容1杜富寬1廖蘭杰1李勇明1汪亞平1

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

為研究白細(xì)胞表面分化抗原81(CD81)的功能, 對(duì)草魚CD81進(jìn)行了克隆, CD81全長共1376 bp, 其中5′非翻譯區(qū)87 bp, 3′非翻譯區(qū)581 bp, 開放閱讀框?yàn)?08 bp, 包括8個(gè)外顯子, 7個(gè)內(nèi)含子, 編碼235個(gè)氨基酸。實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)了CD81在健康草魚不同組織中的表達(dá)情況及草魚出血病病毒(GCRV)攻毒前后的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示草魚 CD81在所有被檢測(cè)組織中均有表達(dá), 在頭腎中表達(dá)量最高。在GCRV攻毒前后草魚鰓、脾、肝、腸及頭腎5個(gè)組織中的CD81表達(dá)量均有明顯變化。同時(shí), 采用綠色熒光蛋白(GFP)來示蹤C(jī)D81的亞細(xì)胞表達(dá)部位, 激光共聚焦顯微鏡顯示, 同人類一樣, 草魚CD81定位于細(xì)胞膜上。

草魚; CD81; 四跨膜蛋白家族; 基因克隆; 組織表達(dá); 亞細(xì)胞定位

白細(xì)胞表面分化抗原81(CD81)是四跨膜蛋白家族(TM4SF)的重要成員之一。TM4SF是一類包含四次跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白家族, 他們主要表達(dá)在細(xì)胞膜上, 其蛋白N端與C端均在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部, 包含兩個(gè)大小不同的胞外環(huán)[1]。研究表明TM4SF可以跟 MHC分子、整合素、CD4/CD8及B細(xì)胞受體復(fù)合物相互作用[2], 在細(xì)胞生長、分化、增殖、細(xì)胞間融合、黏附信號(hào)傳導(dǎo)等過程中均發(fā)揮作用[3—10]。TM4SF并沒有明顯的信號(hào)基序和模塊, 它們可以裝配形成多蛋白復(fù)合物以便形成廣泛的網(wǎng)絡(luò)參與細(xì)胞作用, 所有的TM4SF間均存在直接的相互作用, 并可與第三者CD81相互作用[11]。

CD81在包括免疫在內(nèi)的多種生理過程中發(fā)揮重要功能。研究證實(shí)CD81與T、B細(xì)胞分化有關(guān), 缺失CD81的小鼠, 其B細(xì)胞功能異常, 但增強(qiáng)了T細(xì)胞的增殖[12]。也有證據(jù)顯示缺失CD81的小鼠, T、B細(xì)胞數(shù)目正常, 但在抗原入侵時(shí), 抗體生成過程推遲[13]。CD81分子在不同病毒入侵過程中也發(fā)揮著重要作用。王全楚和聶青和[14]提到CD81與曼氏血吸蟲和日本血吸蟲的某些抗原, 如SM23和Sj2有結(jié)構(gòu)上的同源性。在人類的研究中, 也已證明CD81作為丙型肝炎病毒(HCV)的受體, 可以與HCV的E2區(qū)結(jié)合[15]。不同CD81分子表達(dá)水平的細(xì)胞系在低HCV數(shù)量感染細(xì)胞時(shí), 表現(xiàn)出不同的敏感性[16]。

到目前為止, CD81已經(jīng)在包括斑馬魚(Danio rerio)、斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus )、鱸(Lateolabrax japonicus)、大西洋鮭(Salmo salar)、七鰓鰻(Lampetra japonica)等魚類中得到克隆, 實(shí)驗(yàn)也證實(shí)同人類一樣CD81也參與了七鰓鰻的免疫過程, 而斑點(diǎn)叉尾在受到愛德華桿菌感染后CD81出現(xiàn)了相應(yīng)的上調(diào)表達(dá)[17—20]。草魚在我國是一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類, 但其養(yǎng)殖常因出血病等各種病毒感染受到影響, 因此本研究克隆了草魚中的CD81基因, 并對(duì)其進(jìn)行了初步的功能研究, 希望為草魚染病機(jī)制的研究提供一些線索。

本研究采用基因組搜索、ORF預(yù)測(cè)、同源擴(kuò)增及cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)等多種方法相結(jié)合克隆得到了CD81全長cDNA序列, 并對(duì)其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析探討; 采用實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測(cè)了CD81的表達(dá), 同時(shí)采用GFP融合蛋白的方法對(duì)CD81的表達(dá)部位進(jìn)行了亞細(xì)胞定位, 以期為草魚免疫相關(guān)基因的克隆研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚及草魚CIK細(xì)胞

在本實(shí)驗(yàn)中所有DNA及RNA提取材料均取自健康1齡草魚, 由中國科學(xué)院水生生物研究所官橋養(yǎng)殖基地提供, 剪尾鰭提取DNA, 取腮、腦、肝、脾、中腎、頭腎和后腸提取總RNA。實(shí)驗(yàn)中所用CIK細(xì)胞購自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心, 在28℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

1.2 病毒液制備及草魚攻毒

挑選感染GCRV病毒癥狀非常典型的草魚, 棄內(nèi)臟, 按照其體重的3倍加入0.7%的生理鹽水, 用攪拌機(jī)制備成組織勻漿液; 28 ℃, 140 r/min,搖床震蕩30min, 讓病毒盡量施放出來; 然后冷凍離心, 4000×g, 30min; 收集上清液即為病毒液。儲(chǔ)存于–70℃。

選取健康1齡草魚, 采用腹腔注射法進(jìn)行攻毒,每100 g魚注射2 mL病毒液, 分別于攻毒前、攻毒后2d、10d和18d各取3尾草魚, 每條魚取鰓、肝、脾、后腸、中腎和頭腎6個(gè)組織, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3尾魚的相同組織混合, 加入Trizol裂解液中。

1.3 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

將取自健康1齡草魚的組織加入Trizol (Invitrogen, USA), 充分研磨, 按照Trizol法提取總RNA。提取的RNA經(jīng)DnaseⅠ(Promega, USA)消化后用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)(Eppendorf, Germany)方法檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。使用 Revertra ace (TOYOBO, JAPAN)利用oligo dT (Invitrogen, USA)反轉(zhuǎn)得到3′RACE文庫, 使用SMARTer?RACE cDNA Rapid Amplification (Clontech, USA)的試劑盒由特異性引物合成5′RACE文庫, –20℃保存。

1.4 基因組DNA提取

剪取健康草魚的尾鰭, 加入抽提液(10 mmol/L Tris-Cl, pH 8.0; 1 mmol/L EDTA, pH 8.0; 0.5% SDS; 100 μg/mL蛋白酶K)勻漿后, 55℃消化2—3h, 然后采用酚-氯仿-異戊醇方法進(jìn)行抽提, 用乙醇沉淀純化, 最后將沉淀溶于ddH2O。用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度, –20℃保存。

1.5 基因組搜索及ORF的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

在NCBI上下載斑馬魚CD81序列, 利用putty軟件在本實(shí)驗(yàn)室草魚全基因組(未發(fā)表)序列中搜索包含CD81的草魚基因組Contig, 利用http://genes.mit. edu/GENSCAN.html外顯子從頭預(yù)測(cè)在線軟件對(duì)CD81ORF進(jìn)行預(yù)測(cè), 預(yù)測(cè)得到的CD81在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)驗(yàn)證其正確性。

1.6 引物設(shè)計(jì)及草魚CD81 cDNA序列和基因組序列的獲得和分析

在已經(jīng)預(yù)測(cè)到的CD81 cDNA序列部分設(shè)計(jì)特異性引物, 未預(yù)測(cè)到的cDNA部分根據(jù)NCBI其他物種的同源性設(shè)計(jì)兼并引物, PCR擴(kuò)增得到盡量長的CDS區(qū)。根據(jù)已經(jīng)得到的CDS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物用于3′RACE庫及5′RACE庫的制備, 設(shè)計(jì)時(shí)保證引物擴(kuò)增片段有重疊序列, 以便拼接。

以3′RACE庫及5′RACE庫為模板。反應(yīng)條件為: 94 ℃ 2min; 94 ℃ 30s; 59 ℃30s; 72 ℃ 1min; 35個(gè)循環(huán), 72 ℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 回收后與pMD18-T(Takara, Japan)載體連接, 并轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞中。涂平板, 挑取陽性克隆菌落送往華大基因公司測(cè)序, 將分別得到的CD81的3′端及5′端部分拼接并在NCBI中進(jìn)行Blast同源性分析驗(yàn)證其正確性。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的草魚CD81的cDNA序列和搜索到的包含草魚 CD81的 Contig比對(duì), 得到草魚CD81的基因組結(jié)構(gòu)。

1.7 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及進(jìn)化分析

使用NCBI在線軟件翻譯草魚CD81所編碼氨基酸序列, 運(yùn)用簡單模塊構(gòu)架搜索工具(Simple Modular Architecture Research Tool, SMART)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析, 利用http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/在線預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。用Mega 4.1對(duì)草魚及其他物種CD81全長cDNA序列BLAST比對(duì)并做系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.8 亞細(xì)胞定位

設(shè)計(jì)引物, 克隆CD81全長ORF, 用BamHⅠ和EcoRⅠ(Takara, Japan)對(duì)p-EGFP-N3質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物雙酶切, T4連接酶(Takara, Japan)連接, 構(gòu)建重組質(zhì)粒, 同時(shí)以未重組的p-EGFP-N3空質(zhì)粒做對(duì)照。將重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞, 陽性檢測(cè)后提取陽性質(zhì)粒, 送華大基因測(cè)序驗(yàn)證無誤后, 轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞。按照每10 μL Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA)加4 μg質(zhì)粒的比例轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 6h后更換培養(yǎng)基, 72h后用DAPI細(xì)胞核染色液(碧云天,中國)染色, 置于激光共聚焦顯微鏡(Leica, Germany)下觀察并拍照。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Tab. 1 Primers and their sequences

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)健康草魚不同組織中CD81的表達(dá)水平及GCRV攻毒前后表達(dá)水平變化。實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng)體系為 0.6 μL 10 μmol/L的引物, 1 μL模板, 10 μL 2×SYBR mix, 7.8 μL ddH2O。反應(yīng)條件為: 95 , 10s; 95 , 5s, 60 ,℃℃℃20s; 40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR 的反應(yīng)及信息收集均熒光定量PCR儀(BIO-RAD, USA)上進(jìn)行。程序運(yùn)行完成后進(jìn)行溶解曲線分析以確定 PCR 產(chǎn)物是否專一, 使用β-actin 作內(nèi)參對(duì)照, 據(jù)擴(kuò)增曲線得到的 Ct值(熒光信號(hào)達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))計(jì)算出目標(biāo)基因CD81和對(duì)照基因β-actin Ct值的差異ΔCt; 然后以表達(dá)量最小的樣本作為參照樣本, 計(jì)算出不同樣品相對(duì)于參照樣本基因的表達(dá)倍數(shù)2–ΔΔCt進(jìn)而制作出相對(duì)定量圖表。

2 結(jié)果

2.1 CD81cDNA全長序列及基因組結(jié)構(gòu)

CD81 cDNA全長共1376 bp, 其中5′ UTR 87 bp, 3′UTR 581 bp, CDS區(qū)為708 bp, 編碼235個(gè)氨基酸, 3′端具有典型的AATAAA 加尾信號(hào)。

CD81基因組共包括 8個(gè)外顯子, 7個(gè)內(nèi)含子,其中第一、二內(nèi)含子很大, 第一內(nèi)含子共 8422 bp,第二內(nèi)含子21601 bp(圖1)。

2.2 CD81蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及cDNA序列分析

運(yùn)用SMART對(duì)CD81 ORF所編碼蛋白質(zhì)序列進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析, 發(fā)現(xiàn) CD81基因所編碼蛋白具有明顯的TM4SF家族特征, 含有四跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域。利用信號(hào)肽在線預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè), 發(fā)現(xiàn)CD81并沒有明顯信號(hào)肽。利用NCBI在線軟件比對(duì)草魚 CD81氨基酸序列, 比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD81蛋白結(jié)構(gòu)在發(fā)現(xiàn)草魚CD81在跨膜區(qū)保守, 但在胞外區(qū)變異性較高。將草魚CD81cDNA序列與斑馬魚(Danio rerio CD81, NM_131518.2)、大西洋鮭(Salmo salar CD81, BT049555.1)、青斑河豚(Tetraodon nigroviridis CD81, CR686575.2)、人(Homo sapiens CD81, NM_004356.3)、小家鼠(Mus musculus CD81, NM_133655.2)、原雞(Gallus gallus CD81, NM_ 001030339.1)、牛(Bos taurus CD81, NM_001035099.1)、野豬(Sus scrofa CD81, NM_001078679.1)、黑猩猩(Pan troglodytes CD81, NM_001009023.1)、非洲爪蟾(Xenopus (Silurana) tropicalis CD81, NM_203940.1)序列使用 MEGA4.1軟件構(gòu)建 NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明草魚 CD81與斑馬魚及其他魚類聚為一類, 這與分類學(xué)結(jié)果是一致的(圖2)。

圖1 CD81基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1 Genomic structure of CD81 gene

2.3 草魚CD81亞細(xì)胞定位

細(xì)胞轉(zhuǎn)染融合質(zhì)粒72h后用DAPI細(xì)胞核染色液染色, 置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。圖3中藍(lán)色為細(xì)胞核, 綠色為 CD81與 GFP融合蛋白,圖A為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒染色結(jié)果, 結(jié)果顯示綠色熒光較為均勻的分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上, 而圖B為轉(zhuǎn)染融合質(zhì)粒結(jié)果, 結(jié)果顯示點(diǎn)狀綠色熒光顆粒分布于細(xì)胞周緣, 而胞質(zhì)內(nèi)僅有散在的零星發(fā)光為典型的細(xì)胞膜分布[21,22]。

圖2 基于草魚與其他物種的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Neighbor-Joining phylogenetic tree analysis of grass carp CD81 cDNA with other vertebrates

圖3 草魚腎細(xì)胞系CIK細(xì)胞中CD81的亞細(xì)胞定位Fig. 3 Distributing of CD81 in kidney cell line in grass carp

2.4 草魚CD81的組織表達(dá)分析及GCRV攻毒前后表達(dá)變化

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)草魚CD81在組織表達(dá)分析及 GCRV攻毒前后表達(dá)變化, 結(jié)果顯示:草魚 CD81基因在所有被檢測(cè)組織中均有表達(dá), 由低到高依次為:鰓＜腸道＜肝＜中腎＜腦＜脾臟＜頭腎(圖4A)。此外, 被檢測(cè)草魚的6個(gè)組織CD81基因在攻毒前后表達(dá)量均發(fā)生變化, 攻毒第 2天在鰓、頭腎即出現(xiàn)表達(dá)變化, 在鰓中第 2天表達(dá)明顯上調(diào), 隨攻毒時(shí)間延長又出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)情況; 而頭腎則在攻毒第 2天下調(diào)表達(dá), 至攻毒中期又出現(xiàn)上調(diào)反應(yīng),然后在攻毒后期表達(dá)量又開始下降; 在肝、脾和腸中均到攻毒中期才出現(xiàn)明顯上調(diào), 至攻毒后期表達(dá)量又開始下降。

圖4 CD81在不同組織表達(dá)情況及在GCRV攻毒前后表達(dá)變化Fig. 4 Expression of CD81 mRNA in grass carp in different tissues and in different periods after GCRV injection

3 討論

CD81在人類免疫過程中的作用研究已較為深入, 而在魚類研究中, CD81雖然在多個(gè)魚類物種中得到克隆, 并有提示 CD81可能與魚類的免疫過程相關(guān), 但尚未有詳細(xì)研究?；趯?duì)草魚出血病進(jìn)程表達(dá)譜的分析, 我們發(fā)現(xiàn) CD81發(fā)生了較為顯著的變化(未發(fā)表), 加之其在人類免疫過程中發(fā)揮的重要作用及其在各物種間的保守性, 我們希望探究CD81是否在草魚免疫過程中也發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)克隆了草魚CD81的全長cDNA, 并根據(jù)實(shí)驗(yàn)室草魚基因組序列得到了其基因組結(jié)構(gòu)。CD81比對(duì)分析表明草魚CD81是一個(gè)保守性很高的基因,與魚類相似度均達(dá)到 70%以上, 與斑馬魚相似度達(dá)88%, 與斑點(diǎn)叉尾響相似度達(dá) 87%, 與大西洋鮭相似度達(dá)83%, 與青鳉(Oryzias sinensis)相似度達(dá)78%, 與非洲爪蟾(Xenopus (Silurana) tropicalis)的相似度也達(dá)到了 78%, 這提示草魚 CD81很可能作為一種基礎(chǔ)分子在草魚的生物過程中發(fā)揮著重要作用。更值得關(guān)注的是 CD81分子的保守區(qū)域主要集中在跨膜區(qū), 而胞外區(qū)高度可變, 正是這個(gè)高度可變的胞外區(qū)在人類中可以與HCV結(jié)合, 介導(dǎo)HCV的入侵[23], 這提示具有種屬特異性的 CD81的大胞外區(qū)很有可能與不同物種的不同免疫過程相關(guān)。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)草魚CD81的基因組內(nèi)包含了2個(gè)很大的內(nèi)含子, 其中一個(gè)甚至達(dá)21601 bp。搜索其他物種CD81, 我們發(fā)現(xiàn)在人(Homo sapiens)、牛(Bos Taurus)和小耳大嬰猴(Otolemur garnettii)中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象, 如此大的內(nèi)含子到底在基因的功能或者基因的進(jìn)化中扮演了什么角色, 這或許是一個(gè)有意思的問題。

王鐵輝等[24,25]在研究感染出血病的稀有鯽的細(xì)胞病理中發(fā)現(xiàn), 鰓是GCRV 侵襲的主要組織。此外, 研究者在染病草魚肝、脾、腎、腸中均檢測(cè)到過病毒顆粒。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明草魚CD81基因在GCRV攻毒前后在鰓、肝、脾、腎、腸中表達(dá)量均發(fā)生了變化, 鰓中CD81在第2天即出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá),而肝、脾、腎、腸中則到攻毒中期才出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),這與鰓作為GCRV的感染器官, 而肝、脾、腎、腸作為效應(yīng)器官的推測(cè)是吻合的。值得一提的是, 本研究采用了腹腔注射的方法攻毒, 因此可以認(rèn)為GCRV在相同時(shí)間以相同的病毒量到達(dá)各個(gè)組織,可以排除由于不同組織接觸病毒的時(shí)間及由于病毒量差異而造成的影響。

細(xì)胞膜的遷移是病毒進(jìn)入細(xì)胞的一種重要方式,而病毒進(jìn)入細(xì)胞后其感染能引起細(xì)胞融合, 進(jìn)而導(dǎo)致病毒的釋放與擴(kuò)散[26—28]。在人類中的研究表明, CD81分子可與包含TM4SF在內(nèi)的其他蛋白形成復(fù)合體, 在細(xì)胞膜遷移和細(xì)胞融合中起作用[12], 本實(shí)驗(yàn)已證實(shí), 草魚中CD81在魚類細(xì)胞中也定位在細(xì)胞膜上, 因此我們猜測(cè)CD81是否有可能在GCRV的入侵中也起到重要作用。

基于以上研究結(jié)果, 為我們所提出的 CD81可能參與了草魚GCRV進(jìn)程的免疫應(yīng)答過程的推測(cè)提供了部分線索, 但相關(guān)研究仍需繼續(xù)深入。

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MOLECULAR CLONING AND PRIMARY FUNCTIONAL ANALYSIS OF CD81 IN GRASS CARP

LI Hua-Ying1,2, HUANG Rong1, DU Fu-Kuan1, LIAO Lan-Jie1, LI Yong-Ming1and WANG Ya-Ping1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Cluster of Differentiation 81 (CD81) is a transmembrane protein also known as tetraspanins that plays an important role in cell growth, differentiation, signal conduction and adhesion. In this study, we cloned the CD81 gene of grass carp. The length of the cDNA was 1376 bp containing an 87 bp 5′ untranslated region (UTR), a 581 bp 3′ untranslated region (UTR), and a 708 bp open reading flame (ORF). The ORF had 8 exons and 7 introns, and encoded 235 amino acid residues. We applied real-time RT-PCR analysis to determine the pattern of CD81 gene transcription in different tissues of grass carp, and to measure the change in the transcript level after GCRV infection. The results showed that CD81 was expressed in all the tested tissues and was highest in head kidney. The transcript level was altered in gill, spleen, liver, intestines and head kidney after GCRV infection. Moreover, we used green fluorescent protein (GFP) to trace the subcellular expression of CD81, and the laser confocal electron microscopy revealed that grass carp CD81 was located on the cell membrane, which was the same in human.

Grass carp; CD81; TM4SF; Gene cloning; Tissue expression; Subcellular localization

Q144+.2

A

1000-3207(2015)03-0468-07

10.7541/2015.62

2014-05-08;

2014-06-12

國家863項(xiàng)目(2011AA100403); 國家自然科學(xué)基金(31130055)資助

李華英(1988—), 女, 山東東平人; 碩士; 研究方向?yàn)轸~類功能基因組學(xué)。E-mail: lihuaying_1988@126.com

汪亞平(1963—), 男, 博士; 研究方向?yàn)轸~類功能基因組學(xué)。E-mail: wangyp@ihb.ac.cn