單金津， 李 偉， 李齊激， 楊小生*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550002； 2.貴州省中科院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室, 貴州 貴陽 550002)

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不同藥渣對平菇多糖含量及抗氧化活性的影響

單金津1,2， 李 偉1,2， 李齊激2， 楊小生1,2*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550002； 2.貴州省中科院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室, 貴州 貴陽 550002)

為開發(fā)利用中藥渣廢棄物，合理利用資源，選取藥渣廢棄物青岡子殼、刺梨果渣、淫羊藿(藥渣)、丹參(藥渣)、淫羊藿(藥渣)+刺梨果渣為不同基質(zhì)(菌糠)，探討其對平菇子實體中粗多糖得率、含量及其體外抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：以淫羊藿藥渣為基質(zhì)，平菇粗多糖得率與含量最高，分別為9.49%和60.47%；以淫羊藿+刺梨為基質(zhì)的抗氧化活性最強(qiáng)，當(dāng)平菇多糖濃度為10mg/mL時，其羥基自由基清除率達(dá)89.43%，DPPH自由基清除率達(dá)95.8%。

藥渣； 平菇； 粗多糖； 抗氧化活性

生物廢棄物的循環(huán)利用，對于環(huán)境保護(hù)、促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及生態(tài)文明建設(shè)均具有重要的意義。民族醫(yī)藥在貴州省得到蓬勃發(fā)展，為貴州的支柱產(chǎn)業(yè)，并成為貴州五張名片之一。但在生產(chǎn)中藥民族藥產(chǎn)品過程中，產(chǎn)生了大量的藥渣，如仙靈骨葆膠囊每天產(chǎn)生的廢藥渣有近10 t，至今仍未得到有效處理和利用。采用堆放自然發(fā)酵廢藥渣處理以獲得有機(jī)肥，對木質(zhì)纖維組成低的藥渣可行，但對于大多草本、木本等藥渣無效，總體經(jīng)濟(jì)效益不明顯。

目前，已有中藥材渣批量用于食用菌生產(chǎn)。如毛久庚[1]等發(fā)現(xiàn)，于培養(yǎng)基中加入藥渣可加快菌絲體生長，提高產(chǎn)量，且其微量元素，礦物質(zhì)也明顯上升；張振宇[2]等發(fā)現(xiàn)，于藥渣中培養(yǎng)的食用菌粗多糖對NK細(xì)胞活性均有顯著增強(qiáng)作用；陳今朝[3]等發(fā)現(xiàn)，用補(bǔ)腎益壽膠囊藥渣為基質(zhì)對鮑魚菇營養(yǎng)成分含量有顯著影響。但針對中藥渣對食用菌子實體多糖在含量和抗氧化活性方面的影響研究未見報道。

食用真菌平菇(Pleurotusostreatus)又名白平菇、側(cè)耳，屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，是廣泛栽培的食用菌之一[4]。常食平菇能起到改善人體新陳代謝，調(diào)節(jié)植物神經(jīng)的作用，對減少人體血清膽固醇，降低血壓和防治肝炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、高血壓等有較為明顯的效果[5]。平菇營養(yǎng)物質(zhì)豐富，除氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素等常規(guī)營養(yǎng)成分外，平菇多糖為其主要的生物活性成分之一[6]。

試驗采用廢棄量大的粗毛淫羊藿(EpimediuacuminatumFr. )和丹參(SalviamiltiorrhizaBunge.)藥渣(仙靈骨葆膠囊的兩種主要組成藥材)、刺梨果渣(RosaroxburghiiTratt.)(貴州特色大宗藥食兩用資源)、青岡子殼(Cyclobalanopsisglauca(Thunb.) Oerst.)(淀粉產(chǎn)品廢棄物量大)代替平菇栽培種培養(yǎng)基中的木屑作為平菇生長的基質(zhì)(菌糠)，考察不同藥渣對平菇粗多糖含量及其抗氧化活性的影響，以期從平菇功能物質(zhì)的角度闡述中藥藥渣和生物廢棄物的利用價值，為開發(fā)利用中藥渣廢棄物，合理利用資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、基質(zhì)與試劑

1.1.1 供試菌種 平菇(Pleurotusostreatus)菌種，貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室保藏。

1.1.2 供試基質(zhì) 藥材粗毛淫羊藿(全植株)和丹參由貴州同濟(jì)堂制藥有限公司提供，參照生產(chǎn)工藝，水提2次后，棄水液留殘渣備用；刺梨果渣和青岡子果殼由貴州奇昂生物科技有限公司提供，直接用于試驗。

1.1.3 試劑 二苯代苦味基肼自由基(DPPH，百靈威公司)，抗壞血酸(VC上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，20041101)，葡萄糖、正丁醇、氯仿、過磷酸鈣、蔗糖、硫酸亞鐵、濃硫酸、水楊酸、無水乙醇、H2O2、瓊脂、石灰均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HP-8453型紫外可見光光度計 (惠普公司)，F(xiàn)A114型電子天平(上海海康電子儀器廠)，EYELA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)，BCD-215TS Haier冰箱(青島海爾股份有限公司)，SW-CJ-IC超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造)，YX-18LM手提式壓力蒸汽滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)，DHA-C大容量恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設(shè)備廠)，101-21型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DZ-2A型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，QHX 250II人工氣候培養(yǎng)箱(上海樹立儀器儀表有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基配方及制作

1) 母種培養(yǎng)基(PDA斜面)。配方：土豆(去皮)200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH自然。方法：將馬鈴薯去皮后稱取，切碎，置于燒杯中加水煮沸，待馬鈴薯煮熟用4層紗布過濾于燒杯中，取濾液，再加入瓊脂，葡萄糖，加熱并不斷攪拌。待瓊脂完全融化后補(bǔ)足水，煮沸。趁熱將培養(yǎng)基按1/4試管體積分裝，加塞，成捆包裝，121℃，滅菌30 min，制成斜面。

2) 原種培養(yǎng)基。配方：新鮮、優(yōu)質(zhì)小麥，闊葉樹木屑20%，木屑∶水=1∶1左右，在此基礎(chǔ)上，加入總量0.5%過磷酸鈣，0.5%蔗糖、1%石灰，在麥粒煮好后連同木屑拌入。方法：稱取一定量麥粒，浸泡(夏季24 h，冬季24～48 h)吸水，再煮沸至飽脹無白心，撈出瀝干，再加入闊葉樹木屑、過磷酸鈣、蔗糖、石灰，用小麥水拌勻。裝1/2菌袋體積的培養(yǎng)料，封口膜封口，121℃，滅菌2 h。

3) 栽培種培養(yǎng)基。同原種培養(yǎng)基，只將優(yōu)質(zhì)小麥量改為10%，闊葉樹木屑改為考察藥渣或廢料(90%)作為基質(zhì)。

1.4 試驗設(shè)計

試驗始于2013年7月，于貴州省中科院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室完成。共設(shè)計5個處理，3個平行，分別以青岡子殼、刺梨果渣、淫羊藿(藥渣)、丹參(藥渣)、淫羊藿(藥渣)+刺梨果渣代替栽培種培養(yǎng)基中的木屑。

1.5 菌種活化和出菇培養(yǎng)[7-8]

1.5.1 菌種活化 將平菇菌種接于母種PDA培養(yǎng)基中，于28℃恒溫箱中培養(yǎng)10 d，待菌絲長滿試管，選擇外表菌絲濃白、粗壯、富有彈性的菌種作為母種培養(yǎng)基。

1.5.2 原種制備 刮取2 cm左右PDA斜面(長滿菌絲)接入原種培養(yǎng)基基質(zhì)中，于28℃，相對濕度70%～80%的人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)25 d，至其長滿菌袋。

1.5.3 栽培種制備 將5種藥渣按照栽培種制作方法分別設(shè)計3個菌袋，做平行對照。將平菇原種基質(zhì)(長滿菌絲)接入栽培種培養(yǎng)基中，于28℃，相對濕度70%～80%的人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)30 d，至其長滿菌袋。

1.5.4 出菇培養(yǎng) 待栽培種培養(yǎng)基菌絲長至菌袋2/3時，打開封口膜，置于18～24℃，相對濕度85%～95%，通風(fēng)良好且具有一定的散射光的人工氣候箱中培養(yǎng)出菇。

1.6 平菇子實體多糖含量測定

1.6.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配置[9]準(zhǔn)確稱取于105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品0.025 0 g，適量水溶解后定量轉(zhuǎn)入250 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度線，搖勻，即得質(zhì)量濃度為100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用時以水稀釋可得不同質(zhì)量濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.6.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確吸取葡萄糖儲備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL和8.0 mL，分別置于8個10 mL棕色容量瓶中，加水定容后搖勻，準(zhǔn)確吸取上述溶液各1.0 mL置于試管中，再分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，快速加濃硫酸5.0 mL，充分搖勻，室溫中靜置10 min；另吸取1.0 mL蒸餾水置于試管中，同上操作加苯酚和濃硫酸，作空白溶液。以空白溶液作對照，在490 nm處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3 平菇多糖的提取

1) 樣品處理。從3個平行菌袋中摘取新鮮平菇分別洗凈剪碎，放于托盤中，置于40℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，將烘干的平菇子實體用高速粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，制得平菇干粉3份，備用[6]。

2) 提取工藝。稱取一定量平菇粉→浸提→抽濾→濃縮→除蛋白→離心→80%乙醇沉淀過夜→離心得多糖沉淀[10-11]

稱取適量平菇干粉，按料液比1∶40加入蒸餾水，于恒溫水浴鍋中90℃浸提4 h。用8層紗布過濾2次，再將濾液 3 000 r/min離心20 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液，按多糖水溶液體積的1/4～1/3加入氯仿∶正丁醇=5∶1的混合液，劇烈振搖20～30 min，離心除去含有蛋白質(zhì)有機(jī)溶劑[12]。再按一定料液比加入95%的乙醇配置成80%的乙醇溶液，靜置過夜，離心，干燥沉淀，得平菇粗多糖[13]。

3) 樣品溶液的制備及粗多糖含量測定。準(zhǔn)確稱取平菇多糖0.500 0 g加適量水溶解后移至100 mL容量瓶中，加水至刻度線得質(zhì)量濃度5 mg/mL平菇多糖溶液。準(zhǔn)確移取此溶液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用水稀釋定容得待測樣品溶液。準(zhǔn)確吸取待測樣品溶液1.0 mL置于試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定吸光度，由回歸方程計算平菇粗多糖含量。

粗多糖得率=(粗多糖質(zhì)量/平菇干粉質(zhì)量)×100%;粗多糖含量=粗多糖質(zhì)量濃度×定容體積/供樣用粗多糖質(zhì)量×100%

1.7 平菇多糖抗氧化活性的測定

1.7.1 羥基自由基清除率[14]準(zhǔn)確稱取平菇多糖配成5.0 mg/mL，用蒸餾水稀釋，濃度分別為4.0 mg/mL、3.0 mg/mL、2.0 mg/mL和1.0 mg/mL。利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長510 nm處有吸收。如果在反應(yīng)體系中加入有清除羥基自由基能力的物質(zhì)，與水楊酸競爭羥基自由基，可使有色物質(zhì)生成量減少。反應(yīng)體系中含有8.8 mmol/L H2O21 mL、9 mmol/L FeSO41mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL、不同濃度的多糖溶液1 mL，最后加入 H2O2啟動反應(yīng)，以蒸餾水作為參比，在波長510 nm處測定各濃度的吸光度值，以9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇 1 mL、不同濃度的多糖溶液1 mL和1 mL蒸餾水作為多糖的本底吸收值。以VC作為對照組。每個濃度重復(fù)3次，取平均值。自由基清除率的計算公式為：

·OH清除率=[A0-(AX-AX0)]/A0×100%

式中，A0為空白對照液吸光度值，即只加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過氧化氫，不加入平菇多糖溶液的吸光度值；AX為加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過氧化氫、平菇多糖的吸光度值；AX0為加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、平菇多糖溶液，不加過氧化氫引發(fā)反應(yīng)的吸光度值。

1.7.2 DPPH·清除率[15]稱取一定量的平菇多糖，分別用蒸餾水配成濃度為1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，取1 mL樣品溶液，加入2 mL 0.2 mmol/mL的DPPH溶液，搖勻，于25℃水浴中加熱15 min，以蒸餾水調(diào)零，測定517 nm處的吸光值A(chǔ)i；以1 mL蒸餾水代替樣品溶液測得空白吸光度A0；以1 mL樣品溶液中加入2 mL蒸餾水，測得樣品本體吸光度Aj。同一測定重復(fù)3次，取平均值。按下式計算清除率：

清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

通過試驗，計算得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.008 73x+0.012 4，y為吸光度值A(chǔ)(490 nm)，x為葡萄糖質(zhì)量濃度(μg/mL)。該線性方程R2=0.998 1，說明葡萄糖在所取濃度范圍內(nèi)其濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同藥渣處理的平菇粗多糖得率及含量

由表可知，各處理樣品中的多糖含量可觀，且不同基質(zhì)對多糖含量有明顯影響。以淫羊藿為基質(zhì)粗多糖的得率與含量最高，分別為9.49%和60.47%。所有平菇多糖的含量均高于申培麗等[16]報道的多糖含量(26.9%)。

表 不同藥渣處理的平菇子實體粗多糖得率及含量

Table The yield and contents of crude polysaccharide ofP.ostreatusfruit body with different substrates

平菇栽培種培養(yǎng)基類型Substrate重量/gWeight粗多糖得率%Yield粗多糖含量%Content青岡子殼C.blakei10.0029.3345.71刺梨R.roxbunghii10.0025.8343.16淫羊藿E.acuminatum10.0019.4960.47丹參S.miltiorrhiza10.0028.0139.87淫羊藿+刺梨10.0005.8453.20 E.acuminatum+R.roxbunghii

2.3 不同藥渣處理平菇多糖的抗氧化活性

2.3.1 羥基自由基清除率 由圖2A可知，隨著多糖濃度的增加，清除羥基自由基的能力呈明顯的上升趨勢，有量效關(guān)系。不同基質(zhì)下平菇多糖的羥基自由基的抗氧化活性有明顯差別。其中，當(dāng)平菇多糖的濃度為10 mg/mL，基質(zhì)為淫羊藿+刺梨和丹參時，其清除率雖然低于陽性對照VC，但可達(dá)89%左右。

圖2 不同藥渣處理平菇多糖對羥基自由基和DPPH自由基的清除率

Fig.2 Scavenging rates of polysaccharide ofP.oysteratuson OH radical and DPPH radical

2.3.2 DPPH自由基清除率 由圖2B可知，隨著多糖濃度的增加，清除DPPH自由基的能力呈明顯上升趨勢，有量效關(guān)系。不同基質(zhì)下平菇多糖的DPPH抗氧化活性差異明顯，以淫羊藿+刺梨為基質(zhì)獲得的平菇粗多糖濃度為8 mg/mL時，清除率達(dá)95%左右；在平菇粗多糖濃度為10 mg/mL時，丹參為基質(zhì)的平菇粗多糖的清除率也可達(dá)95%左右。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

以5種不同的中藥材渣和生物廢棄物作為平菇生長的基質(zhì)，考察對平菇多糖含量及其抗氧化活性影響研究，發(fā)現(xiàn)以淫羊藿藥渣為基料，平菇粗多糖得率與含量最高，且不同基質(zhì)生產(chǎn)的平菇多糖的含量均較高于申培麗等[16]報道的多糖含量(26.9%)，具有研究意義。以淫羊藿+刺梨為基質(zhì)，平菇粗多糖的抗氧化活性最強(qiáng)。

試驗用的藥渣基質(zhì)生產(chǎn)平菇的產(chǎn)量均比用稻草、秸稈為基質(zhì)的高且口感好(研究結(jié)果暫未報道)。綜上所述，不同培養(yǎng)基質(zhì)對平菇子實體粗多糖的得率、含量及其體外抗氧化活性均有影響。本研究結(jié)果對中藥民族藥產(chǎn)業(yè)廢棄物的有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 討論

1) 食用真菌多糖在國際上被稱為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物(biological response modifier,簡稱BRM)[17]。目前研究證明，真菌多糖除了具有抗腫瘤[18]、提高免疫力[19]、抑菌[20]等多種生物活性外，其在抗氧化[21]方面也具有顯著效果。試驗針對不同基質(zhì)(中藥材渣和生物廢棄物)對平菇多糖的得率和多糖含量的研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)對平菇多糖的影響較大，這與木質(zhì)纖維化的程度高低有關(guān)聯(lián)，如青岡子殼和淫羊藿基質(zhì)的平菇多糖得率和多糖含量都是較高的，其物質(zhì)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2) 羥基自由基和脂基自由基是在生命活動過程中氧化代謝反應(yīng)產(chǎn)生的具有代表性的自由基。當(dāng)機(jī)體內(nèi)自由基過剩時，會引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA鏈斷裂、細(xì)胞解體等，可誘發(fā)癌癥、高血脂癥、急慢性炎癥、糖尿病、衰老、輻射損傷等疾病[22]。試驗針對不同基質(zhì)對平菇多糖抗氧化活性的研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的多糖清除自由基能力差異較大。其中，淫羊藿+刺梨渣和丹參基質(zhì)針對羥基自由基和DPPH自由的清除能力最強(qiáng)。與多糖含量的高低沒有線性關(guān)系，可能與多糖的組成相關(guān)聯(lián)。不同來源的多糖其單元類型和比例以及與自由基清除能力的關(guān)系，有待深入研究。

3) 通過趙爽[23]等研究發(fā)現(xiàn)不同平菇品種子實體的多糖含量存在較大差異，且大量文獻(xiàn)證明不同藥食用真菌抗氧化活性同樣存在差異，則藥渣對不同品種藥食用真菌子實體多糖的含量及抗氧化活性可能也存在差異，為本課題后續(xù)研究內(nèi)容提供思路。

4) 鑒于中藥材渣和生物廢棄物品種較多，試驗涉及只是貴州大量的部分廢棄物，研究材料種類有局限是本研究的不足。

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(責(zé)任編輯： 孫小嵐)

Effects of Different Dregs on Polysaccharides Content and Antioxidant Activity ofPleurotusostreatus

SHAN Jinjin1,2, LI Wei1,2, LI Qiji2, YANG Xiaosheng1,2*

(1.CollegeofPharmacy,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550002; 2.TheKeyLaboratoryofChemistryforNaturalProductsofGuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences,Guiyang,Guizhou550002,China)

In order to develop and utilize the wastes of Chinese medicine residue rationally, the industrial dregs and waste materials including shell ofCyclobalanopsisblakei, residue ofRosaroxbunghii,Epimediuacuminatum(dregs),Salviamiltiorrhiza(dregs),E.acuminatum(dregs) with residue ofR.roxbunghiiwere used as different substrates for cultivation ofP.ostreatus.The effects on yield and content of crude polysaccharide inP.ostreatustogether with antioxidant activity in vitro were investigated. The results showed that the yield (9.49%) and content (60.47%) of crude polysaccharide inP.ostreatuswhich were cultivated inE.acuminatum(dregs) were the highest and also the antioxidant activity of crude polysaccharide ofP.ostreatuswhich were cultivated inE.acuminatum(dregs)with residue ofR.roxbunghiiwas the strongest. When the concentration of polysaccharide inP.ostreatuswas 10 mg/mL,scavenging rate of polysaccharide on OH radical was 89.43% and on DPPH radical was 95.8%.

dregs;Pleurotusostreatus; crude polysaccharide; antioxidant activity

2014-11-20； 2015-06-24修回

貴州省科技計劃項目“藥渣高值化綜合利用關(guān)鍵技術(shù)研究與示范” [黔科合NY(2015)3005-1]；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊建設(shè)項目，“貴州省藥材品質(zhì)研究與評價科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊”[(2013)4006 ]

單金津(1989-)，女，在讀碩士,研究方向:藥物化學(xué)。E-mail:shanjinjin@yeah.net

*通訊作者:楊小生(1966-)，男，研究員,博士,從事活性天然產(chǎn)物的研究。E-mail:GZCNP@sina.cn

1001-3601(2015)07-0385-0151-04

S38; R914

A