左 斌， 任冰冰， 蔣小松， 熊應(yīng)龍， 王康環(huán)，蔣 利， 劉光偉 , 王 海， 徐亞歐*

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 四川 成都 610041； 2.四川省畜牧科學(xué)研究院， 四川 成都 610066； 3.涼山州原生農(nóng)業(yè)綜合開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司， 四川 冕寧 615600)

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瀘寧雞和米易雞MSTN基因多態(tài)性及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性

左 斌1， 任冰冰1， 蔣小松2， 熊應(yīng)龍3， 王康環(huán)1，蔣 利1， 劉光偉1, 王 海1， 徐亞歐1*

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 四川 成都 610041； 2.四川省畜牧科學(xué)研究院， 四川 成都 610066； 3.涼山州原生農(nóng)業(yè)綜合開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司， 四川 冕寧 615600)

為探明瀘寧雞、米易雞肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，采用PCR-SSCP法對(duì)MSTN基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)瀘寧雞、米易雞的主要生長(zhǎng)性狀進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)MSTN基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：MSTN基因外顯子1中有2 100 bp(C/T)和2 109 bp(C/T)2個(gè)SNPs位點(diǎn)，未引起氨基酸變異，為同義突變，表現(xiàn)出CT、TT(2 100 bp)和CC、CT、TT(2 109 bp)5種基因型，與心臟重、脛圍和屠宰率有相關(guān)性；瀘寧雞存在CC、CT和TT 3種單倍型，米易雞存在CC、TC和TT 3種單倍型。內(nèi)含子1中有4 295 bp(T/C)、4 359 bp(T/C)和4 404 bp(A/C)3個(gè)SNPs位點(diǎn)，表現(xiàn)出CT(4 295 bp)、CT(4 359 bp)、TT、CT和CC(4 404 bp)5種基因型，與腺胃重有顯著相關(guān)；瀘寧雞存在CCC和TTT 2種單倍型，米易雞存在CCC、TTC和TTT 3種單倍型。3’非編碼區(qū)有7 637 bp(A/G)和7 725 bp(A/G)2個(gè)SNPs位點(diǎn)，表現(xiàn)出AG(7 637 bp)、AA、AG和GG(7 725 bp)4種基因型，與腺胃重、腹脂重和半凈膛率具有相關(guān)性；瀘寧雞存在AG、GA和GG 3種單倍型。MSTN基因是影響瀘寧雞、米易雞主要生長(zhǎng)性狀的主效基因之一，可以作為地方雞品種選育的候選基因。

瀘寧雞； 米易雞； 肌肉生長(zhǎng)抑制素； PCR-SSCP； 生長(zhǎng)性狀； 單倍型

肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)基因是1997年MePherron等從小鼠骨骼肌cDNA文庫(kù)中克隆出的一個(gè)新基因，該基因轉(zhuǎn)錄合成的蛋白質(zhì)是一種生長(zhǎng)因子，被命名為生長(zhǎng)分化因子-8(Growth and Differential Factor-8，GDF-8)[1-2]。該基因的缺失和突變會(huì)使一些動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的雙肌現(xiàn)象[3]。在畜牧業(yè)上，篩選出MSTN基因突變個(gè)體，可通過(guò)育種培育出產(chǎn)率高的優(yōu)良畜禽品種。胡蘭等[4]研究表明，在大骨雞胸肌、腿肌、心肌、腎臟、腦、舌中均有MSTN基因表達(dá)，其中骨骼肌中表達(dá)水平較高。顧志良等[5]對(duì)明星肉雞和絲羽烏骨雞雜交產(chǎn)生的F2代群體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因核苷酸突變(G→A，A→G，C→T)導(dǎo)致其5′調(diào)控區(qū)呈現(xiàn)出多態(tài)性，G→A和A→T的突變?cè)斐蒑STN 3′調(diào)控區(qū)的多態(tài)性，MSTN基因多態(tài)性不僅影響骨骼肌和肌肉生長(zhǎng)發(fā)育，還可能與脂肪沉積有關(guān)。隱性白羽雞在MSTN基因5′調(diào)控區(qū)和3′調(diào)控區(qū)存在SNPs位點(diǎn)[6]。到目前為止，未見(jiàn)MSTN基因多態(tài)性在四川優(yōu)良地方雞品種瀘寧雞、米易雞上的研究報(bào)道。為探明四川優(yōu)良地方雞品種MSTN基因多態(tài)性及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，找出該基因與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，運(yùn)用PCR-SSCP技術(shù)篩選MSTN基因SNPs變異位點(diǎn)，分析其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)系，以期為培育出生長(zhǎng)速度快的優(yōu)良地方雞品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雞品種

瀘寧雞(64只)、米易雞(64只)取自涼山州冕寧縣瀘沽鎮(zhèn)秧草壩養(yǎng)殖場(chǎng)，由專(zhuān)人管理，單籠飼養(yǎng)，管理和營(yíng)養(yǎng)水平一致，自由采食、飲水。分別在81 d、119 d、154 d、210 d進(jìn)行屠宰性能測(cè)定，同時(shí)用真空采血管收集血樣EDTA.K2抗凝帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生長(zhǎng)性狀測(cè)定

屠宰前測(cè)定體斜長(zhǎng)、胸寬、胸深、胸骨長(zhǎng)、盆骨寬、脛圍和脛長(zhǎng)等指標(biāo)。屠宰性能測(cè)定參照楊寧[7]的方法進(jìn)行，指標(biāo)包括活重、屠體重、全凈膛重、半凈膛重、胸肌重、腿肌重、腹脂重、肝重、肌胃和腺胃重，半凈膛率、全凈膛率、腹脂率、胸肌率、腿肌率等。

1.3 引物設(shè)計(jì)及DNA池構(gòu)建

根據(jù)GenBank登錄的MSTN基因序列(登錄號(hào)：AF346599)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，并由上海Invitrogen公司合成，擴(kuò)增包含該基因3個(gè)外顯子序列及含有SNPs位點(diǎn)的特異性序列。用DNA試劑盒提取血液基因組DNA，經(jīng)TE溶解后，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)品種隨機(jī)抽取30個(gè)DNA樣品，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量每個(gè)DNA樣品濃度各3次，取平均值，將樣品稀釋到終濃度為100 ng/μL，從30個(gè)樣品中各取5 μL混合構(gòu)建成DNA池[8-10]。

表1 試驗(yàn)所用引物信息

1.4 PCR擴(kuò)增

以DNA池為模板擴(kuò)增MSTN基因3個(gè)外顯子片段。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：超純水9.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板(100 ng/μL)1 μL，Master Mix 12.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的亮度及純度。

1.5 SSCP分析及測(cè)序

取PCR產(chǎn)物1.5 μL與變性緩沖液(10%蔗糖，0.01%溴酚，0.01%二甲精)20 μL混合，97℃變性3 min后立即冰浴5 min，產(chǎn)物經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠[m(Arc)∶m(Bis)=29∶1]在200 V、400 mA條件下電泳3～4 h后銀染顯色。經(jīng)PCR-SSCP[11-13]分析后，挑選每個(gè)不同基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物送上海Invitrogen公司測(cè)序。用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank登陸的序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出突變位點(diǎn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)電泳結(jié)果不同帶型的差異，判斷個(gè)體的基因型，用EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和SPSS17.0軟件進(jìn)行差異顯著性比較，進(jìn)行基因型與生長(zhǎng)性狀間的關(guān)聯(lián)分析。利用POPGENE軟件計(jì)算各等位基因在各品種中的基因頻率和基因型頻率，用卡方值判斷雞群是否處于哈代-溫伯格平衡，用Nei氏計(jì)算法檢測(cè)MSTN基因雜合度、純合度和多態(tài)信息含量，用SHEsis對(duì)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行單倍型構(gòu)建并計(jì)算其頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增、SSCP檢測(cè)及測(cè)序

針對(duì)MSTN基因外顯子1，內(nèi)含子1及3’非編碼區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)引物的擴(kuò)增片段與預(yù)期大小一致，沒(méi)有非特異性條帶(圖1)，可以用于進(jìn)一步分析。經(jīng)SSCP分析(圖2)發(fā)現(xiàn)，MSTN基因外顯子1變異位點(diǎn)表現(xiàn)出5種帶型，分別命名為T(mén)T、CT(2 100 bp)和CC、CT、TT(2 109 bp)；內(nèi)含子1變異位點(diǎn)表現(xiàn)出CT(4 295 bp)，CT(4 359 bp)，TT、CT、CC(4 404 bp) 5種基因型；3′非編碼區(qū)變異位點(diǎn)表現(xiàn)出AG(7 637 bp)和AA、AG、GG(7 725 bp) 4種基因型。經(jīng)測(cè)序后序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，外顯子1有2個(gè)SNP位點(diǎn)，分別為2 100 bp(C/T)和2 109 bp(C/T)；內(nèi)含子1有3個(gè)SNP位點(diǎn)，分別為4 295 bp(T/C)、4 359 bp(T/C)和4 404 bp(A/C)；3′非編碼區(qū)有2個(gè)SNP位點(diǎn)，為7 637 bp(A/G)和7 725 bp(A/G)。

注：M為Marker D2000，1～3為外顯子1突變位點(diǎn)，4～6為內(nèi)含子1突變位點(diǎn)，7～9為3′非編碼區(qū)突變位點(diǎn)。

Note: M, Marker D2000; 1～3, Mutation loci of exon 1; 4～6, Mutaion loci of intron 1; 7～9, Mutation loci of 3′ noncoding region(A7637G and A7725G).

圖1MSTN基因的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

Fig.1 Electrophoretoesis pattern of PCR product ofMSTNgene

圖2MSTN基因的SNPs分析及基因型(從左到右是外顯子1，內(nèi)含子1，3′非編碼區(qū))

Fig.2 SNPs analysis and genotype ofMSTNgene (From left to right are exon 1, intron 1 and 3′ noncoding region)

2.2 基因型頻率和基因頻率

從表2可知，MSTN基因外顯子1中瀘寧雞的2個(gè)位點(diǎn)均是CC基因型頻率、C等位基因頻率最高；米易雞2 109 bp位點(diǎn)CT基因型、C等位基因頻率最高，2 100 bp位點(diǎn)T為優(yōu)勢(shì)等位基因。內(nèi)含子1中瀘寧雞的3個(gè)位點(diǎn)均是TT基因型頻率最高，T為優(yōu)勢(shì)等位基因；米易雞4 295 bp、4 359 bp位點(diǎn)是CT基因型頻率最高，4 404 bp位點(diǎn)CC基因型頻率最高，4 295 bp、4 359 bp位點(diǎn)T為優(yōu)勢(shì)等位基因，4 404 bp位點(diǎn)C為優(yōu)勢(shì)等位基因。3′非編碼區(qū)瀘寧雞7 637 bp位點(diǎn)GG基因型頻率最高，G為優(yōu)勢(shì)等位基因，米易雞在該位點(diǎn)未發(fā)生突變；7 725 bp位點(diǎn)GG基因型頻率均最高，G為瀘寧雞和米易雞的優(yōu)勢(shì)等位基因。經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)，瀘寧雞在各個(gè)變異位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡，米易雞在2 109 bp、4 295 bp和4 359 bp位點(diǎn)均極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。

表2 MSTN基因的基因型頻率和基因頻率及χ2 檢驗(yàn)

2.3 基因雜合度和多態(tài)信息含量

一般認(rèn)為，基因雜合度(Ho)和多態(tài)信息含量(PIC)是度量各群體在位點(diǎn)上遺傳變異的最適參數(shù)，其數(shù)值大小反映出遺傳結(jié)構(gòu)變異程度的高低，數(shù)值越低，表明群體的遺傳多樣性越低。從表3看出：各位點(diǎn)的Ho在0～0.496 7。在2 109 bp、4 359 bp和7 725 bp位點(diǎn)，瀘寧雞的PIC在0.25～0.5，表現(xiàn)出中度多態(tài)；在4 295 bp和7 637 bp位點(diǎn)瀘寧雞和7 725 bp位點(diǎn)米易雞的PIC<0.25，表現(xiàn)出低度多態(tài)；其他各位點(diǎn)均表現(xiàn)出高度多態(tài)。

2.4 多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀間的關(guān)聯(lián)性

經(jīng)多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀間的關(guān)聯(lián)性分析，外顯子1中2 100 bp位點(diǎn)CC基因型米易雞的心臟重顯著高于TT型，TT基因型的屠宰率顯著高于CC型，TT基因型的脛圍極顯著大于CC型；內(nèi)含子1中4 359 bp位點(diǎn)TT基因型瀘寧雞的腺胃重極顯著高于CT型； 3′非編碼區(qū)7 725 bp位點(diǎn)AG基因型瀘寧雞的腺胃重、米易雞的腹脂重顯著高于GG型，GG基因型的半凈膛率顯著高于AG型。表明，突變位點(diǎn)對(duì)瀘寧雞生長(zhǎng)性狀的影響較米易雞更為明顯。各位點(diǎn)其他性狀間差異不顯著。

表3 MSTN各位點(diǎn)基因的純合度、雜合度和多態(tài)信息含量

表4 瀘寧雞和米易雞MSTN基因的單倍型及頻率

2.5MSTN基因的單倍型

從表4看出:在外顯子1上瀘寧雞和米易雞分別檢測(cè)到3種單倍型，瀘寧雞CC單倍型頻率最大，CT頻率最?。幻滓纂u3種單倍型分布差距較小。內(nèi)含子1上瀘寧雞有2種單倍型，TTT單倍型明顯高于CCC單倍型；米易雞有CCC、TTC和TTT 3種單倍型，TTT單倍型的頻率最高。 3′非編碼區(qū)上只在瀘寧雞中發(fā)現(xiàn)AG、GA和GG 3種單倍型，GG單倍型的頻率明顯高于AG和GG型。若位點(diǎn)間無(wú)連鎖，n個(gè)突變位點(diǎn)應(yīng)產(chǎn)生2n種單倍型，而在本研究中利用軟件均未檢測(cè)到全部單倍型，說(shuō)明位點(diǎn)間可能處于緊密連鎖不平衡狀態(tài)[14]。

3 結(jié)論與討論

顏文錦等[15]對(duì)MSTN基因單核苷酸多態(tài)性與京海黃雞初生重和1、4、8、12周齡體重等性狀進(jìn)行方差分析表明，各多態(tài)位點(diǎn)對(duì)體重有顯著影響(P<0.05)。朱智等[16]對(duì)溫嶺雞外顯子1研究表明，不同基因型的活重、屠宰重、半凈膛重、全凈膛重、腿肌重、胸肌重、腹脂重和胸肌率、腹脂率、屠宰率有顯著或極顯著差異(P<0.05或P<0.01)。研究結(jié)果表明，瀘寧雞和米易雞MSTN基因共發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNPs位點(diǎn)，外顯子12 100 bp(C/T)位點(diǎn)對(duì)雞群心臟重、屠宰率和脛圍有顯著影響(P<0.05)；內(nèi)含子1中4 359 bp(T/C)位點(diǎn)雞群的腺胃重差異極顯著(P<0.01)；3′非編碼區(qū)7637(A/G)位點(diǎn)雞群的腹脂重差異顯著，7 725 bp(A/G)位點(diǎn)雞群的腺胃重和半凈膛率差異顯著。外顯子1的2個(gè)突變位點(diǎn)均未引起氨基酸變異，為同義突變，可能是由于MSTN基因DNA序列和結(jié)構(gòu)的高度保守性，密碼子的簡(jiǎn)并性使DNA分子上堿基組成有較大余地的變動(dòng)，堿基發(fā)生改變氨基酸并未產(chǎn)生變異；但對(duì)雞的生長(zhǎng)性狀產(chǎn)生了顯著影響，推測(cè)可能是核苷酸的變化導(dǎo)致一些順式作用元件的調(diào)控功能改變，影響MSTN基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)生長(zhǎng)性狀產(chǎn)生影響[17]。內(nèi)含子1上堿基發(fā)生突變可能會(huì)影響基因轉(zhuǎn)錄、剪接、mRNA的穩(wěn)定性，影響最終的翻譯；或是內(nèi)含子上SNPs與基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)[18]。3′非編碼區(qū)雖然不直接參與轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，但是堿基的突變可能導(dǎo)致某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位發(fā)生改變，從而導(dǎo)致基因的表達(dá)水平發(fā)生變化。3′末端發(fā)生變異可能影響DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性及翻譯效率等。

多數(shù)位點(diǎn)的基因雜合度(Ho)和多態(tài)信息含量(PIC)表現(xiàn)出米易雞高于瀘寧雞，說(shuō)明米易雞群體的遺傳多樣性較瀘寧雞群高。瀘寧雞在各個(gè)變異位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，米易雞在C2109T、C4295T和4359(C/T)位點(diǎn)都極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，這可能與人工選擇某種性狀有關(guān)。顧志良等[6]研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因SNPs位點(diǎn)對(duì)腹脂重、腹脂率、初生重、胸肌重和胸肌率有影響。本研究未檢測(cè)全部基因型，可能造成某些生長(zhǎng)性狀差異不顯著的結(jié)果。

由于SNP屬于二態(tài)性遺傳標(biāo)記，多態(tài)信息含量較低，對(duì)于復(fù)雜的多基因性狀，分析某一基因中單個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性往往不能準(zhǔn)確得出基因或等位基因與性狀真實(shí)的相關(guān)性，而需要同時(shí)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)組成的單倍型進(jìn)行分析，才能找出與某種表型相關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記[19]。研究結(jié)果表明，瀘寧雞在外顯子1上有優(yōu)勢(shì)單倍型CC，頻率為0.811；在內(nèi)含子1上和3′非編碼區(qū)都檢測(cè)到具有明顯優(yōu)勢(shì)的單倍型，分別為T(mén)TT(0.935)和GG(0.938)。米易雞在外顯子1和內(nèi)含子1各位點(diǎn)上單倍型頻率差異不大，因其在7 637 bp處未發(fā)生突變，所以沒(méi)有構(gòu)建單倍型。單倍型各位點(diǎn)處于連鎖不平衡狀態(tài)。

MSTN基因突變影響心臟重、腺胃重、腹脂重、脛圍、屠宰率和半凈膛率，單倍型分析各位點(diǎn)處于連鎖不平衡狀態(tài)。因此，可將MSTN基因作為地方雞生長(zhǎng)性狀的候選基因。

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(責(zé)任編輯： 馮 衛(wèi))

Polymorphism of Myostatin (MSTN) Gene and Correlation BetweenMSTNPolymorphism and Growth Traitss in Luning and Miyi Chicken

ZUO Bin1, REN Bingbing1, JIANG Xiaosong2, XIONG Yinglong3, WANG Kanghuan1,JIANG Li1, LIU Guangwei1, WANG Hai1, XU Ya’ou1*

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu,Sichuan610041, 2.SichuanAcademyofLivestockSciences,Chengdu,Sichuan610066; 3.YuanshengAgriculturalIntegratedDevelopmentLLC.,Mianning,Sichuan615600,China)

MSTN polymorphism of Luning Chicken and Miyi Chicken was detected by PCR-SSCP and main growth traits of Luning Chicken and Miyi Chicken were determined to analyze the correlation betweenMSTNpolymorphism and growth traits of Luning Chicken and Miyi Chicken. Results:There are two SNPs loci of 2 100 bp(C/T) and 2 109 bp(C/T)in exon 1 ofMSTNgene and there are 5 genotypes of CT, TT(2 100 bp), CC, CT and TT(2 109 bp) related to heart weight, shank girth and slaughter rate. Three haplotypes of CC，CT and TT are identified in Luning Chicken and Miyi Chicken. There are three SNPs loci of 4 295 bp(T/C), 4 359 bp(T/C) and 4 404 bp(A/C) in intron 1 and there are CT(4 295 bp), CT(4 359 bp), TT, CT and CC(4 404 bp)genotypes related to glandular stomach weight significantly. Luning Chicken has two haplotypes of CCC and TTT but Miyi Chicken has three haplotypes of CCC, TTC and TTT. There are two SNPs loci of 7 637 bp(A/G) and 7 725 bp(A/G) in 3’ non-coding region and there are AG(7 637 bp), AA, AG and GG(7 725 bp)genotypes related to glandular stomach weight, abdominal fat weight and half-eviscerated weight. Luning Chicken has three haplotypes of AG, GA and GG.MSTNgene is one of major genes influencing main growth traits of Luning and Miyi Chicken and should be used as a candidate gene for breeding of local chicken varieties.

Luning Chicken; Miyi Chicken; myostatin (MSTN); PCR-SSCP; growth trait; haplotype

2015-03-05； 2015-05-28修回

四川省畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目“肉雞配套系選育”(2011NZ0099-6)；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目“四川民族地區(qū)主要地方雞種遺傳資源及肉質(zhì)性狀的遺傳特性研究”(2013JY0044)；西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目(CX2014SZ105)

左 斌(1991-)，男，在讀碩士，研究方向：分子遺傳育種。E-mail:990363506@qq.com

*通訊作者：徐亞歐(1957-)，男，教授，從事動(dòng)物遺傳資源研究。E-mail:xuyaou@163.com

1001-3601(2015)07-0353-0026-05

S831

A