胡翼安， 張丹雁*， 馮小映， 陳慶奇

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006；2.廣州市正骨醫(yī)院，廣東廣州 510045；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山市婦幼保健院，廣東佛山 528000)

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續(xù)骨酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

胡翼安1， 張丹雁1*， 馮小映2， 陳慶奇3

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006；2.廣州市正骨醫(yī)院，廣東廣州 510045；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山市婦幼保健院，廣東佛山 528000)

[目的]建立續(xù)骨酒的定量定性檢測(cè)方法，為續(xù)骨酒質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。[方法]采用薄層色譜法(TLC)對(duì)續(xù)骨酒中的梔子、地黃定性鑒別；采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定梔子苷的含量。[結(jié)果]TLC鑒別分離度好、專屬性強(qiáng)；含量測(cè)定中梔子苷在0.151 1～2.518 0 mg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=925 558X- 11 386，r=0.999 9(n=7)，平均回收率為99.4%，RSD%為1.4。[結(jié)論]該試驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、精密度高、重復(fù)性好，可作為續(xù)骨酒的質(zhì)量控制方法。

續(xù)骨酒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；地黃；梔子苷

續(xù)骨酒是廣州市正骨醫(yī)院的一個(gè)常用制劑。續(xù)骨酒主要由鬧羊花、續(xù)斷、梔子、姜黃、生地黃、獨(dú)活等中藥組成，具有活血化瘀、消腫止痛、驅(qū)風(fēng)祛濕、舒筋通絡(luò)的功效，對(duì)各種骨折腫痛、跌打損傷、風(fēng)濕骨痛有確切的療效。續(xù)骨酒是一安全、有效、使用方便的外用噴霧劑，很受患者歡迎，卻至今缺乏一個(gè)全面、完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)行的續(xù)骨酒內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有2010年版中國(guó)藥典中有關(guān)噴霧劑通則項(xiàng)下的檢查，包括外觀、總固體、乙醇量、裝量、微生物限度等項(xiàng)目，這些檢查項(xiàng)既不能保證制劑的質(zhì)量，亦保障不了臨床用藥的有效性和安全性，因此很有必要對(duì)續(xù)骨酒中的藥材和有效成分進(jìn)行鑒別，并測(cè)定其有效成分的含量，以提高續(xù)骨酒的質(zhì)量和臨床用藥的有效性。筆者采用薄層色譜法對(duì)梔子、地黃進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜法對(duì)續(xù)骨酒中梔子苷進(jìn)行了含量測(cè)定，為續(xù)骨酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的科學(xué)依據(jù)，也為續(xù)骨酒后期在臨床上的發(fā)展應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器島津高效液相色譜儀(LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外檢測(cè)器、CTO-10ASvp柱溫箱、CBM-20A控制器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，LC solution化學(xué)工作站)；KQ-300型超聲波清洗器(功率300 W，頻率40 kHz，東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司)；AUW220D型萬(wàn)分之一分析天平(日本SHIMADZU公司)；Goodlook-1000型薄層色譜成像系統(tǒng)(上?？普苌萍加邢薰?；薄層層析硅膠G板(德國(guó)MACHEREY-NAGEL公司，批號(hào)006153)。

1.2 試藥梔子對(duì)照藥材(批號(hào)120986-201309，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，地黃對(duì)照藥材(批號(hào)121180-201005，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，梔子苷對(duì)照品(批號(hào)110749-201316，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；續(xù)骨酒(廣州市正骨醫(yī)院，批號(hào)20140101、20140201、20140301、20140401、20140501)和續(xù)骨酒梔子陰性溶液(廣州市正骨醫(yī)院)；甲醇為色譜純，其余為分析純。

1.3 方法

1.3.1梔子的TLC鑒別 。取本品20 ml，蒸干，加乙醇2 ml使溶解，作為供試品溶液；取缺梔子的陰性對(duì)照樣品20 ml，同法制成缺梔子陰性對(duì)照溶液；再取梔子對(duì)照藥材1 g，加50%甲醇10 ml，超聲40 min，濾過，取續(xù)濾液作為對(duì)照藥材溶液；另取梔子苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各4 ml、對(duì)照藥材溶液及對(duì)照品溶液各2 ml，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-氨水-甲醇-水(5∶5∶1∶0.5∶0.5)為展開劑[2]，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。在日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照應(yīng)無干擾。

1.3.2地黃的TLC鑒別。取續(xù)骨酒原液作為供試品溶液。取地黃對(duì)照藥材1 g，加80%甲醇50 ml，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀? ml使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次10 ml，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各5 ml，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水-甲醇(6∶3∶3∶2)為展開劑[3]，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。在日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，應(yīng)陰性對(duì)照無干擾。

1.3.3梔子苷的含量測(cè)定。

1.3.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。色譜柱為迪馬ODS色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(20∶80)，流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm。理論塔板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

1.3.3.2供試品溶液的制備。精密吸取續(xù)骨酒10 ml，置于25 ml容量瓶，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 mm孔徑微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.3.3對(duì)照品溶液的制備。取梔子苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含251.8 mg/ml的對(duì)照品溶液；精密吸取上述對(duì)照品溶液5 ml，置于20 ml容量瓶，加入甲醇至刻度，搖勻，制得含62.94 mg/ml的梔子苷對(duì)照品溶液。

1.3.3.4陰性對(duì)照溶液的制備。按缺梔子的陰性對(duì)照樣品，按“1.3.3.2”項(xiàng)下方法制備，即得缺梔子陰性對(duì)照溶液。

1.3.3.5測(cè)定方法。分別精密吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。

1.3.3.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性考察。精密吸取梔子苷對(duì)照品溶液(251.8 mg/ml)各0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，分別注入高效液相色譜儀，按“1.3.3.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn)。將按“1.3.3.2”項(xiàng)制備的供試品溶液(批號(hào)20140101)于0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣10 μl，按“1.3.3.1”色譜條件測(cè)定。

1.3.3.8精密度試驗(yàn)。精密取梔子苷對(duì)照品溶液10 μl，采用高效液相色譜法，連續(xù)測(cè)定6次。

1.3.3.9重復(fù)性試驗(yàn)。取供試品溶液(批號(hào)20140101)按“1.3.3.5”項(xiàng)下方法，連續(xù)測(cè)定6次。

1.3.3.10加樣回收試驗(yàn)。在已知含量的續(xù)骨酒加入一定量的梔子苷對(duì)照品溶液，按“1.3.3.5”項(xiàng)下方法測(cè)定，并計(jì)算回收率。

注：1、17為梔子對(duì)照藥材；18為梔子苷對(duì)照品；19為缺梔子的陰性對(duì)照溶液；2～16為續(xù)骨酒樣品(2～4批號(hào)20140101、5～7批號(hào)20140201、8～10批號(hào)20140301、11～13批號(hào)20140401、14～16批號(hào)20140501)。圖1 梔子薄層鑒別

1.3.3.11樣品測(cè)定。精密稱取續(xù)骨酒樣品，按“1.3.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μl，采用高效液相色譜法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子的TLC鑒別從圖1可以看出，供試品色譜中，在與梔子對(duì)照藥材色譜和梔子苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺梔子陰性對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上沒有干擾。

2.2 地黃的TLC鑒別從圖2可以看出，在與地黃對(duì)照藥材色譜顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺地黃陰性對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上沒有干擾。

注：2、18為地黃對(duì)照藥材；1、19為缺地黃的陰性對(duì)照液；2～16為續(xù)骨酒樣品(3、4、5批號(hào)為20140101；6、7、8批號(hào)為20140201；9、10、11批號(hào)為20140301；12、13、14批號(hào)為20140401；15、16、17批號(hào)為20140501)。圖2 生地黃薄層鑒別

注：a為續(xù)骨酒供試品；b為梔子苷對(duì)照品；c為缺梔子的陰性對(duì)照樣品。圖3 續(xù)骨酒梔子苷含量測(cè)定色譜圖

2.3 梔子苷的含量測(cè)定

2.3.1色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。在該色譜條件下檢測(cè)，繪制供試品、梔子苷對(duì)照品和缺梔子陰性對(duì)照品色譜圖(圖3)。由圖3可見，供試品和梔子苷對(duì)照品在相同的保留時(shí)間(32.5 min)，缺梔子陰性對(duì)照品在相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間沒有影響。供試品所測(cè)定主峰附近無明顯雜峰，經(jīng)計(jì)算，樣品主峰與其他組分峰的分離度>1.5。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性考察。通過“1.3.3.1”色譜條件測(cè)定梔子苷對(duì)照品，以梔子苷進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得出線性回歸方程為Y=925 558X- 11 386(r=0.999 9)，結(jié)果表明，梔子苷在0.151 1～2.518 0 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.3.3.7”項(xiàng)，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定續(xù)骨酒中的梔子苷。測(cè)得24 h內(nèi)平均峰面積為662 523，RSD=2.1%(n=6)，表明被測(cè)樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4精密度試驗(yàn)。按“1.3.3.8”項(xiàng)，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得平均峰面積為590 545，RSD=1.1%，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.3.5重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.3.3.9”項(xiàng)，連續(xù)測(cè)定6次。測(cè)得同一批號(hào)中，平均峰面積為660 066，梔子苷平均濃度為173.7 μg/ml，RSD=1.2%，結(jié)果顯示重復(fù)性良好。

2.3.6加樣回收試驗(yàn)。由表1可見，該試驗(yàn)方法中梔子苷的平均回收率達(dá)99.4%，RSD為1.4%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于續(xù)骨酒中梔子苷的含量測(cè)定。

表1 續(xù)骨酒中梔子苷加樣回收率試驗(yàn)

2.3.7樣品測(cè)定。由表2可知，3批續(xù)骨酒中梔子苷含量為155.1～176.6 μg/ml，平均含量為163.6 μg/ml，RSD為0.20%～0.49%。

表2 3批續(xù)骨酒中梔子苷含量測(cè)定

3 小結(jié)與討論

(1)梔子的薄層色譜鑒別中，按藥典方法的展開系統(tǒng)分離效果較差，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，改用乙酸乙酯-丙酮-氨水-甲

醇-水(5∶5∶1∶0.5∶0.5)為展開劑，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰、分離度好，可作為續(xù)骨酒的定性鑒別指標(biāo)。

(2)地黃的薄層色譜鑒別中，按藥典方法的展開系統(tǒng)分離效果較差，斑點(diǎn)模糊，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，改用正丁醇-冰醋酸-水-甲醇(6∶3∶3∶2)為展開劑，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰、分離度好，可作為續(xù)骨酒的定性鑒別指標(biāo)。

(3)該研究采用HPLC法測(cè)定了續(xù)骨酒中梔子苷的含量，樣品分離度高，測(cè)定方法重復(fù)性良好、回收率高、專屬性強(qiáng)，可作為該制劑質(zhì)量控制的含量測(cè)定指標(biāo)。

(4)該研究測(cè)得續(xù)骨酒中梔子苷的平均含量為163.6 μg/ml，考慮到藥材來源、制劑生產(chǎn)等因素，暫規(guī)定本品每毫升中含梔子以梔子苷(C17H24O10)計(jì)，不得少于90 μg/ml。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010：231, 附錄34-35．

[2] 方道碩, 鐘亞玲, 宋英.清熱瀉火膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J].中國(guó)藥師, 2008, 11(4): 406- 408.

[3] 馮文濤, 謝穎, 張榕.涼血顆粒所用藥材的薄層鑒別[J].華西藥學(xué)雜志, 2008, 23(4): 502.

Quality Standard Research forXugujiu

HU Yi’an1, ZHANG Dan-yan1*, FENG Xiao-ying2et al

(1.Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong 510006; 2.Guangzhou Orthopedic Hospital, Guangzhou, Guangdong 510045)

[Objective] To establish qualitative and quantitative detection method forXugujiu, and provide a theoretical basis for the quality control.[Method] Gardeniae Fructus and Rehmanniae Radix were identified by TLC, the content of Jasminoidin was determined by HPLC.[Result] The spots in TLC was clear, the negative control was no interference.Content determination of Jasminoidin had good linear relationship between 0.151 1 to 2.518 mg, the linear regression equation wasY=925 558X- 11 386，r=0.999 9(n=7), the average recovery was 99.4%, RSD 1.4%.[Conclusion] The method is simple, accurate, specified, high precision and good repeatability.It can be used for quality control ofXugujiu.

Xugujiu; Quality standard; Rehmanniae Radix; Jasminoidin

佛山市衛(wèi)生和計(jì)生局醫(yī)學(xué)科研課題(408239275162)。

胡翼安(1987- )，男，廣東廣州人，碩士研究生，研究方向：醫(yī)院制劑。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥鑒定研究。

2015-02-02

S 567

A

0517-6611(2015)08-047-03