邵衛(wèi)平，劉永立

(浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江杭州 310058)

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獼猴桃實生苗培育與砧木的工廠化生產(chǎn)

邵衛(wèi)平，劉永立*

(浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江杭州 310058)

[目的]研究獼猴桃實生苗培育與砧木的工廠化生產(chǎn)技術(shù)。[方法]獼猴桃種子通過GA3不同處理后進行組織培養(yǎng)。[結(jié)果]獼猴桃種子通過2.5 g/LGA3浸種12 h，用10%次氯酸鈉消毒10 min，播種于鋪有一層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中進行暗培養(yǎng)，以獲得較高的發(fā)芽率。將發(fā)芽的種子及時轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基(MS+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉，pH 5.8)中，在組培室內(nèi)進行培養(yǎng)，可迅速獲得獼猴桃實生苗。以帶芽莖段為外植體對獼猴桃實生苗進行單株擴繁，可得到基因型相同的株系。[結(jié)論]‘徐香’和‘布魯諾’實生苗可以作為獼猴桃的砧木使用，以實現(xiàn)獼猴桃砧木的工廠化生產(chǎn)。

獼猴桃；實生苗；砧木；培養(yǎng)基

實生苗可以用作培育優(yōu)良新品種以及提供大量砧木，因此培育實生苗對獼猴桃生產(chǎn)具有很大實用價值。獼猴桃種子具有休眠特性，因此萌發(fā)慢，對發(fā)芽環(huán)境條件要求高[1]。成熟獼猴桃種子需要低溫冷藏破除休眠后才能萌發(fā)，因此傳統(tǒng)上使用層積法、直播法、變溫處理、赤霉素浸種等方法來促進其萌發(fā)[2]。這些方法都在一定程度上提高了發(fā)芽率，縮短了萌芽時間，但仍不能滿足快速培育健壯苗木的需求。筆者通過對獼猴桃種子發(fā)芽率影響因子進行研究，探索獼猴桃種子的萌發(fā)特性，提高種子發(fā)芽率，并通過對實生苗的單株擴繁，建成‘徐香’、‘紅陽’和‘布魯諾’3個品種獼猴桃的株系，以期為獼猴桃育種和砧木的生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試材料為‘徐香’、‘布魯諾’和‘紅陽’獼猴桃種子。

1.2 試驗方法取出獼猴桃果實中的種子，用2.5 g/L GA3溶液浸泡處理，然后于超凈工作臺上用10%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，再用無菌水清洗3～5次，每次5 min。取出種子放到濾紙上吸去水，然后置于鋪有濕潤濾紙的一次性培養(yǎng)皿上，每板40粒種子，每個處理3板。將培養(yǎng)皿放到溫度(25±2)℃的組培室，在光周期16 h/8 h(光/暗)條件下培養(yǎng)。觀察種子發(fā)芽狀況，10 d后統(tǒng)計各個處理的發(fā)芽率。

將‘徐香’和‘布魯諾’發(fā)芽的種子接種到加50 ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，當長出5片葉片以后以帶芽莖段為外植體進行單株擴繁，培養(yǎng)基成分為MS培養(yǎng)基+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉，用10%HCl或1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至5.8，在121 ℃(1.2 kg/cm2)下高壓滅菌20 min。無菌苗在溫度(25±2)℃的組培室內(nèi)，在光周期16 h/8 h(光/暗)條件下培養(yǎng)。此后每28 d繼代一次。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素浸種時間對‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率的影響由圖1可知，GA3溶液浸種能夠顯著提高‘徐香’獼猴桃種子的發(fā)芽率。浸種6～24 h種子發(fā)芽率均達到65%以上，而不經(jīng)GA3溶液浸種發(fā)芽率僅為5%。浸種12 h和18 h 2個處理，獼猴桃種子發(fā)芽率相近，分別為75.83%和75.80%，且均高于浸種6 h時的發(fā)芽率65.83%，說明對‘徐香’獼猴桃而言，2.5 g/L GA3溶液浸種12 h能達到理想的打破休眠效果。且通過加長浸種時間至3 d，種子萌芽后接種到培養(yǎng)基上會出現(xiàn)污染，可能是因為種子浸泡時間過長，細菌等侵入到種皮內(nèi)部導致不能徹底消毒滅菌所致。故‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽浸種12 h即可。

圖1 赤霉素浸種時間對‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率的影響

2.2 消毒時間對‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率的影響10% 次氯酸鈉溶液消毒時間對‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率有一定影響，不同消毒時間處理發(fā)芽率均為75%以上，但總體上消毒時間短則發(fā)芽率較高。由圖2可知，消毒時間5 min時，發(fā)芽率最高，達到83.33%，但消毒5 min時培養(yǎng)皿中會出現(xiàn)污染，即使在培養(yǎng)皿中發(fā)芽時無污染出現(xiàn)，將發(fā)芽的種子接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)時也會出現(xiàn)污染現(xiàn)象，造成時間與物質(zhì)的浪費。故消毒時間以10 min為宜，在保證較高發(fā)芽率的同時，又能避免污染。

圖2 10%次氯酸鈉溶液消毒時間對‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率的影響

2.3 不同發(fā)芽方式對‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率的影響由圖3可知，培養(yǎng)皿上僅鋪一層濕潤濾紙時，‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率最高，為73.33%，而加入MS培養(yǎng)基和含1 mg/L GA3的MS培養(yǎng)基后，種子發(fā)芽率分別降為60.83%和64.17%。且僅在濕潤濾紙上培養(yǎng)的種子發(fā)芽較快，7 d時發(fā)芽率已達53%，而此時培養(yǎng)基上的種子才開始破芽萌發(fā)。在培養(yǎng)基中加入1 mg/L GA3對種子萌發(fā)的促進作用極小，說明在獼猴桃種子發(fā)芽階段，經(jīng)2.5 g/L GA3溶液浸種12 h后，已能夠滿足打破休眠和促進種子萌芽的作用，取得良好的發(fā)芽效果。

圖3 不同發(fā)芽方式對‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率的影響

2.4 暗處理對‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率的影響由圖4可知，全天暗培養(yǎng)時‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率為91.67%，明顯高于8 h暗培養(yǎng)時的種子發(fā)芽率。可能是因為獼猴桃種子萌發(fā)過程需要暗培養(yǎng)，但5 d后8 h暗培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中水分減少較多，10 d時濾紙表面已沒有明顯水漬，而全天暗培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中還保存少量水分，故16 h/8 h(光/暗)培養(yǎng)處理中發(fā)芽率較低，可能是因為發(fā)芽所需水分不足所致。種子在一次性培養(yǎng)皿中萌發(fā)過程中，不定時向內(nèi)加入無菌水，不僅操作更加繁瑣，且容易造成污染。而全天暗培養(yǎng)條件下已有較高的發(fā)芽率，且節(jié)省能源，故獼猴桃種子萌發(fā)過程中僅暗培養(yǎng)即可。

圖4 暗培養(yǎng)對‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率的影響

2.5 不同獼猴桃品種對種子發(fā)芽率的影響由圖5可知，獼猴桃不同品種間種子發(fā)芽率存在一定差異。‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率最高，為90.83%，而‘布魯諾’獼猴桃僅與之相差2.5%，但兩者均明顯高于‘紅陽’獼猴桃種子的發(fā)芽率?！煜恪汀剪斨Z’果實中種子明顯多于‘紅陽’獼猴桃果實中的種子，因此若需要‘紅陽’獼猴桃實生苗，則需要更多的‘紅陽’獼猴桃果實，加大接種量。

圖5 不同獼猴桃品種對種子發(fā)芽率的影響

2.6 獼猴桃實生苗株系的建立以帶芽莖段為外植體，接入MS基本培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+2 mg/L 6-BA+ 0.05 mg/L NAA+7 g/L瓊脂的培養(yǎng)基中，對‘徐香’和‘布魯諾’實生苗進行單株擴繁，共建成了‘徐香’實生苗13個株系，‘布魯諾’實生苗13個株系，每個株系包含40多株?？梢奙S基本培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/LNAA+7 g/L瓊脂粉適合兩者生長?！煜恪汀剪斨Z’實生苗可作為獼猴桃的砧木使用，以實現(xiàn)獼猴桃砧木的工廠化生產(chǎn)。

3 討論

獼猴桃種子具有休眠特性，國內(nèi)外很多學者在獼猴桃種子打破休眠方面作了很多研究。Lawes等[3]研究發(fā)現(xiàn)，沙藏或赤霉素處理24 h均能促進其萌發(fā)。Smith等[4]用沙藏加變溫的方法處理獼猴桃種子，其發(fā)芽率顯著增加。李從玉等[5]用CPPU對獼猴桃種子進行浸種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的CPPU能夠不同程度地打破獼猴桃種子休眠，促進種子萌發(fā)。安成立等[1]采用變溫處理和赤霉素處理種子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，變溫處理有利于種子萌發(fā)，5～20 ℃高變溫比0～15 ℃低變溫更有利于種子萌發(fā)；赤霉素處理可以有效促進獼猴桃發(fā)芽勢和發(fā)芽率的提高，且高濃度效果較好。錢亞明等[6]進行了不同產(chǎn)地‘紅陽’和‘徐香’獼猴桃種子的發(fā)芽試驗，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地、不同品種獼猴桃種子重量、萌芽率和發(fā)芽勢有明顯差異，但不同產(chǎn)地三者間并沒有相關性。由此可知，獼猴桃種子的萌發(fā)受很多條件的影響。

朱道圩等[7]研究表明，用2.5 g/LGA3處理5 h和24 h對打破休眠的效果相同，發(fā)芽率均達95%以上。而周艷玲等[8]研究結(jié)果是GA3浸種時間以8 h為最宜。GA3浸種12 h已能達到較高發(fā)芽率，且接種前浸種已能夠打破休眠，不必在萌芽過程中繼續(xù)加入GA3。對于以種子為材料進行組織培養(yǎng)而言，還需要考慮污染問題。獼猴桃種子常用的消毒劑為次氯酸鈉溶液，消毒劑濃度過高、消毒時間過長都易對種子造成損害。朱道圩等[7]以13%的次氯酸鈉溶液消毒20 min取得了良好效果，而在該試驗中使用10%的次氯酸鈉溶液，對消毒時間進行探索，發(fā)現(xiàn)10 min亦能達到消毒效果。在培養(yǎng)基上發(fā)芽并不能提高獼猴桃種子的發(fā)芽率，反而會使發(fā)芽率下降，這與周艷玲等[8]的研究結(jié)論相同，但在培養(yǎng)基上能夠及時檢測出是否出現(xiàn)污染，在消毒技術(shù)不熟練的情況下也可在培養(yǎng)基上進行發(fā)芽，且培養(yǎng)基上的小苗后期生長較快。暗處理對‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽率影響的試驗并不能說明全暗培養(yǎng)能夠提高獼猴桃種子發(fā)芽率，對比朱道圩等[7]采用暗箱培養(yǎng)試驗和周艷玲等[8]正常培養(yǎng)試驗，兩者均能夠得到90%以上的發(fā)芽率，說明暗培養(yǎng)可能不是影響獼猴桃種子發(fā)芽率的重要因子。在該試驗中24 h暗培養(yǎng)條件下發(fā)芽率高，更可能是由于其培養(yǎng)皿內(nèi)水分充足促進萌芽所致。不同獼猴桃品種種子發(fā)芽率有所差別，在‘徐香’、‘紅陽’和‘布魯諾’3個品種間，‘紅陽’獼猴桃種子發(fā)芽率低于‘徐香’和‘布魯諾’。‘徐香’、‘布魯諾’實生苗可以作為砧木加以利用。

4 結(jié)論

該研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃種子通過2.5 g/L GA3浸種12 h，用10%次氯酸鈉消毒10 min，在鋪有一層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中進行暗培養(yǎng)，可以獲得較高的發(fā)芽率，將發(fā)芽的種子及時轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+7 g/L瓊脂粉，pH 5.8)中，在組培室內(nèi)進行培養(yǎng)，可迅速獲得獼猴桃實生苗。以帶芽莖段為外植體對獼猴桃實生苗進行單株擴繁，可得到基因型相同的株系。‘徐香’和‘布魯諾’實生苗可以作為獼猴桃的砧木使用，以實現(xiàn)獼猴桃砧木的工廠化生產(chǎn)。

[1] 安成立，劉占德，劉旭峰，等.獼猴桃種子萌發(fā)特性研究[J].北方園藝，2011(5)：51-53.

[2] 魯松，李策宏.溫度及赤霉素對峨眉山野生獼猴桃種子萌發(fā)的影響[J].種子，2012，31(10)：89，92.

[3] LAWES G S，ANDERSON D R.Influence of temperature and gibberellic acid on kiwifruit (Actinidiachinensis)seed germination[J].N.Z.Journal of Experimental Agriculture，1980，8：277-280.

[4] SMITH R L，TOY S J.Effect of stratification and alternating temperatures on seed germination of the Chinese gooseberry：Actinidia chinensis planch[J].Proceedings-American Society for Horticultural Science，1967，90：409-412.

[5] 李從玉，張揚.CPPU對獼猴桃種子發(fā)芽的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38(4)：1802-1803.

[6] 錢亞明，趙密珍，龐夫花.不同產(chǎn)地紅陽和‘徐香’獼猴桃種子發(fā)芽試驗[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42(10)：154-155.

[7] 朱道圩，王靜毅，呂宗強.獼猴桃實生苗組織培養(yǎng)體系建立的研究[J].落葉果樹，2005，37(2)：5-7.

[8] 周艷玲，秦華明，賴幸韻，等.獼猴桃實生苗再生體系的建立[J].廣西植物，2009，29(4)：514-517.

Technique of Cultivating Seedling and Rootstock’s Factory Production of Kiwifruit

SHAO Wei-ping, LIU Yong-li*

(College of Agriculture & Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310058)

[Objective]To study the technique of cultivating seedling and rootstock’s factory production of kiwifruit.[Method] Kiwifruit seeds were used as materials in tissue culture after different treatments with GA3.[Result] To obtain a higher germination rate of seeds, the kiwifruit seeds were treated with GA3at 2.5 g/L for 12 hours, and sterilized with 10% of sodium hypochlorite for 10 minutes, then the seeds were sowed in culture utensil with moistened filter paper and dark cultured.The germinated seeds were inoculated timely on the medium(MS+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+30 g/L sucrose +7 g/L agar power, pH 5.8)and cultured in tissue culture room, then we can get lots of kiwifruit seedlings quickly in this way.Rapid propagation individually of kiwifruit seedling by using the bud-stem segments as explants can obtain lines with the same genotype.[Conclusion]‘Xuxiang’ and ‘Bruno’ seedlings can be used as kiwifruit rootstocks, thus rootstock’s factory production of kiwifruit can be realized.

Kiwifruit; Seedling; Rootstock; Culture medium

浙江省科技廳科技攻關重大農(nóng)業(yè)項目“獼猴桃分子標記輔助育種研究”(J31334)。

邵衛(wèi)平(1989- )，女，河南杞縣人，碩士研究生，研究方向：園藝植物生物技術(shù)。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事園藝植物生物技術(shù)研究。

2015-02-02

S 663.4

A

0517-6611(2015)08-017-03