朱佳杰，周 宇，譚 蕓，甘 西，沈夏霜，劉 溪，敖秋桅 (廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西南寧530021)

羅非魚原產(chǎn)于非洲，1956年首次引入中國大陸［1］，經(jīng)過幾十年的發(fā)展我國已成為羅非魚養(yǎng)殖和出口的第一大國，年均總產(chǎn)量和出口量約占世界總量的1/3。目前我國養(yǎng)殖的羅非魚品種主要有吉富羅非魚(GIFT Oreochromis niloticus)、尼羅羅非魚(Oreochromis aureus)、奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus×O.aureus)、奧利亞羅非魚(Oreochromis aureus)、紅羅非魚(Oreochromis sp.)等［2］。近來年，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的盲目擴大和水質(zhì)環(huán)境惡化等因素的影響，羅非魚的病害日趨嚴重，尤其是2009年至今羅非魚無乳鏈球菌病已成為羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的首要病害［3-5］，其中吉富羅非魚發(fā)病最為嚴重，發(fā)病死亡率達60%以上。因此，有必要對現(xiàn)有的主養(yǎng)羅非魚品種進行抗病性檢測，篩選出抗病力強的品種用于推廣養(yǎng)殖，減少疾病的危害，為羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展提供良種保證。

目前，國內(nèi)外對羅非魚鏈球菌病的研究主要集中在致病機理［6-9］、疫苗研發(fā)［10-11］、藥物防控［12］及抗病育種［13］等方面。在抗病育種方面，朱佳杰等［13］通過家系選育和人工感染方式篩選出1批吉富羅非魚高抗病家系和易感病家系;強俊等［14］分析了海豚鏈球菌感染對不同品系羅非魚血液生化指標和肝臟HSP70 mRNA表達的影響;柯劍［15］比較了奧利亞羅非魚、尼羅羅非魚、奧尼羅非魚、吉富羅非魚及莫荷羅非魚5個品系感染嗜水氣單胞菌后的抗病力差異。目前，國內(nèi)尚未見到關(guān)于不同品系羅非魚感染無乳鏈球菌的報道。在前期開展吉富羅非魚抗病選育的基礎(chǔ)上，筆者將選育出的P2代群體分別與未選育的P0代、尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及奧尼羅非魚進行抗無乳鏈球菌病性能比較，一方面對吉富羅非魚抗病育種的效果進行評價，另一個方面評估各個品系羅非魚的抗病性能，以期為羅非魚養(yǎng)殖提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚。試驗所用的羅非魚均由國家級廣西南寧羅非魚良種場提供。其中吉富羅非魚P0代為從國家級青島羅非魚良種場引種后群體選育的后代，而吉富羅非魚抗病P2代則是在P0代的基礎(chǔ)上開展抗無乳鏈球菌病針對性選育，目前已選育到第2代。奧利亞羅非魚、尼羅羅非魚及奧尼羅非魚魚苗均取自同一個家系的苗種。2013年將相同數(shù)量的這5種魚苗在網(wǎng)箱中單獨培育至規(guī)格50～60 g后進行人工感染無乳鏈球菌攻毒試驗。試驗前先對各品種魚隨機抽樣進行細菌分離及PCR鑒定(參考黎炯［16］的方法)是否已感染無乳鏈球菌，將未感染無乳鏈球菌的魚用于攻毒試驗。

1.1.2 試驗菌株。攻毒感染試驗用的無乳鏈球菌菌株(HN016)由廣西水產(chǎn)科學研究院魚病防治研究室饋贈，經(jīng)過基因型和血清型鑒定［17］，該菌株為我國羅非魚主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢菌株。菌株保存在-80℃冰箱內(nèi)，取出后接種于雞血平板，28℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進行革蘭氏染色，鑒定細菌是否被污染;隨機挑取單菌落于含有200 ml TSB培養(yǎng)基的1 000 ml錐形瓶中，28℃下振蕩培養(yǎng)48 h，測定菌液的OD值，確定菌液濃度。然后，對菌液進行不同濃度稀釋感染吉富羅非魚P0代篩選出半數(shù)致死濃度，并以此濃度作為評估各組羅非魚抗病力的標準。

1.2 試驗方法 每組隨機抽取同個家系的魚200尾，設(shè)3個重復，每個重復50尾，另設(shè)置1個對照組。先在容量1 m3的大桶中暫養(yǎng)10 d，水溫30～31℃，pH 6.7。每天早晚各投喂飼料1次，每隔2 d換水1次，正常充氣，試驗開始1 d前暫停投餌料。

經(jīng)半數(shù)致死濃度預試驗篩選，對每組魚進行腹腔注射無乳鏈球菌，菌液濃度為1.47×108CFU/ml，劑量為0.2 ml。對照組用等量無菌(0.85%NaCl)生理鹽水注射。注射完成后將魚放回原試驗大桶飼養(yǎng)，每隔3 h撈出死亡魚并記錄數(shù)量，待各組均停止死亡后統(tǒng)計死亡魚的數(shù)量和死亡時間。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品系羅非魚感染無乳鏈球菌后的抗病性能分析 試驗組各品種羅非魚感染無乳鏈球菌后均出現(xiàn)了不同程度的死亡。發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為:眼球突出，游動時出現(xiàn)側(cè)翻和打轉(zhuǎn)現(xiàn)象。解剖后發(fā)現(xiàn)鰓蓋充血，肝臟及膽囊腫大、腸壁明顯變薄等。對死魚隨機抽樣進行腦組織細菌分離及PCR鑒定，證實為無乳鏈球菌感染致死。由表1可知，無乳鏈球菌感染后各試驗組的死亡率大小依次為吉富羅非魚P0代＞美國尼羅羅非魚＞奧利亞羅非魚＞吉富羅非魚抗病P2代＞奧尼羅非魚。其中，吉富羅非魚抗病P2代的致死率為22.7%，比未經(jīng)選育的P0代降低了45.3%，比尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚的死亡率均低。結(jié)果表明，經(jīng)過2個世代針對性的開展抗病選育，吉富羅非魚抗病P2代的抗病性能與P0代相比獲得了顯著提高，已接近奧尼羅非魚的抗病力水平，選育效果顯著。

表1 不同品系羅非魚感染無乳鏈球菌的試驗結(jié)果

2.2 5種羅非魚人工感染無乳鏈球菌后死亡時間 從圖1可以看出，各試驗組羅非魚的死亡的變化趨勢呈先逐漸上升后趨向于平穩(wěn)。其中，吉富羅非魚P0代的發(fā)病死亡高峰期主要集中在12～72 h，而尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚、奧利亞羅非魚、奧尼羅非魚的發(fā)病死亡高峰期均集中24～96 h，而吉富羅非魚抗病P2代的死亡時間則主要集中在48～96 h，感染后120 h各組的死亡數(shù)量逐漸趨向穩(wěn)定。此試驗的死亡規(guī)律與朱佳杰等［13］相似，說明此次感染是比較成功的。

3 討論

無乳鏈球菌屬于人畜魚共患病原菌，可以在人類、奶牛、小鼠、蜥蜴之間交叉感染。Lau［18］及 Koh［19］等研究表明羅非魚鏈球菌也能夠傳染給人類。CHEN M等［20］研究發(fā)現(xiàn)2009～2012年我國羅非魚養(yǎng)殖的病害主要是無乳鏈球菌病，集中在每年6～10月，死亡率為30% ～80%。研究表明，魚類對疾病的抵抗力存在著物種間和個體的差異。因此，可以通過人工感染試驗來培育抗病力強的品系。大西洋鮭(Salmo salar)［17］及牙鲆(Paralichthys olivaceus)［21］是魚類抗病育種較成功的例子。該研究在2012年篩選出的11個吉富羅非魚抗病家系的基礎(chǔ)上，通過家系間雜交獲得抗病P2代，并選擇抗病力強的P2代家系與奧尼羅非魚、吉富羅非魚P0代、尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚進行抗病性能比對，發(fā)現(xiàn)奧尼羅非魚的抗病性能最強，這是種間雜交帶來的雜種優(yōu)勢的體現(xiàn)。其次是吉富羅非魚抗病P2代，主要表現(xiàn)在感染死亡率及死亡歷時2個方面。它感染無乳鏈球菌以后的死亡率比吉富羅非魚P0代、尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚均低，表明經(jīng)過針對性的選育能顯著提升吉富羅非魚的抗病水平;死亡歷時時間也比其他品系有所延長，這在養(yǎng)殖生產(chǎn)中為藥物防治或疫苗免疫贏得了寶貴的時間。該研究結(jié)果與王瑞［22］比較吉富羅非魚、尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚、奧尼羅非魚感染海豚鏈球菌的抗病力結(jié)果相似，但因菌株、感染劑量及試驗魚規(guī)格不同，各品系間的感染死亡率有所差異。

家系育種作為選擇育種的重要手段之一，已在魚類育種工作中得到廣泛應用。Bolivar等［23］通過家系選育對尼羅羅非魚16周時的體重進行連續(xù)10年選育，平均每個世代的體重增長12.4%，效果非常理想。該研究中的吉富羅非魚抗病P2代是在P0代的基礎(chǔ)上通過家系間雜交選育出來的，其感染后死亡率比P0代降低45.3%，表明家系選育在羅非魚抗病育種中確實有效。究其原因，是因為將抗病性能優(yōu)秀的家系進行多個世代系統(tǒng)定向選育，既避免了近親繁殖，又增加了群體內(nèi)抗病基因的富集，逐步穩(wěn)定性狀最終達到育成新品系的目的。

該研究對5個不同品系進行抗無乳鏈球菌病性能評估，一方面證實了家系選育確實能有效提高吉富羅非魚的抗病性能，另一方面也為廣大養(yǎng)殖戶在羅非魚苗種投放時品種的選擇提供參考依據(jù)。

［1］李家樂，李思發(fā).中國大陸尼羅羅非魚引進及其研究進展［J］.水產(chǎn)學報，2001，25(1):90-95.

［2］唐瞻楊.廣西羅非魚產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀的研究［D］.南寧:廣西大學:2011:8-12.

［3］朱佳杰，沈夏霜，付強，等.吉富羅非魚感染無乳鏈球菌后肝臟組織在不同時期蛋白質(zhì)組的表達差異［J］.水產(chǎn)學報，2013，37(12):1821-1828.

［4］李莉萍，王瑞，黃婷，等.廣西羅非魚鏈球菌病流行菌株P(guān)CR鑒定和PFGE 基因型分析［J］.水產(chǎn)學報，2013，37(6):927-935.

［5］李莉萍，王瑞，黃婷，等.海南、福建3省羅非魚鏈球菌流行菌株P(guān)CR鑒定和PFGE基因型分析［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，2013(5):2133-2140.

［6］EVANS J J，KLESIUS P H，GLIBERT P M，et al.Characterization of betahaemolytic Group B Streptococcus agalactiae in cultured seabream，Sparus auratus(L.)and wildmullet，Liza klunzingeri(Day)，in Kuwait［J］.Journal of Fish Diseases，2002，25:505-513.

［7］PEREIRA U P，MIAN G F，OLIVEIRA I C，et al.Genotyping of Streptococcus agalactiae strains isolated from fish，human and cattle and their virulence potential in Niletilapia［J］.Vet Microbiol，2010，140(1/2):186-192.

［8］盧邁新，黎炯，葉星，等.廣東與海南養(yǎng)殖羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定與特性分析［J］.微生物學通報，2010，37(5):766-774.

［9］田珂，賈愛卿，陳善真，等.羅非魚無乳鏈球菌生物學特性與致病力研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)雜志，2013，40(6):203-208.

［10］CHEN M，WANG R，LI L P，et al.Sequence and Evolution Differences of Oreochromis niloticus CXC Contribute to the Diversification of Cellular Immune Responses in Tilapias with Treatment of Streptococcus iniae［J］.Journal of Animal and Veterinary Advances，2013，12(3):303-311.

［11］陳賀.羅非魚源無乳鏈球菌滅活疫苗的研制及其免疫效果的研究［D］.湛江:廣東海洋大學:2012:8-13.

［12］李波，陳明，李莉萍，等.廣西羅非魚鏈球菌病病原的生化鑒定及藥敏試驗［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2008，35(10):93-95.

［13］朱佳杰，李莉萍，唐瞻楊，等.吉富羅非魚家系構(gòu)建及抗病力檢測［J］.南方水產(chǎn)科學，2012，8(6):22-27.

［14］強俊，楊弘，王輝，等.海豚鏈球菌感染對不同品系羅非魚血液生化指標和肝臟HSP70 mRNA表達的影響［J］.水產(chǎn)學報，2012，36(6):958-968.

［15］柯劍.羅非魚病原菌分離鑒定及不同品系間抗病力初步比較［D］.上海:上海海洋大學，2011:33-39.

［16］黎炯，葉星，盧邁新，等.雙重PCR快速鑒別無乳鏈球菌和海豚鏈球菌［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版，2010，36(4):449-452.

［17］KJφGLUM S，HENRYON M，AASMUNDSTAD T，et al.Selective breeding can increase resistance of Atlantic salmon to furunculosis，infectious salmon anaemia and infectious pancreatic necrosis［J］.Aquacult Res，2008，39(5):498-505.

［18］LAU S K，WOO P C，LUK W K，et al.Clinical isolates of Streptococcus iniae from Asia are more mucoid and beta-hemolytic than those from North America［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2006，54:177-181.

［19］KOH T H，KURUP A，CHEN J.Streptococcus iniae discitis in Singapore［J］.Emerg Infect Dis，2004，10:1694-1696.

［20］CHEN M，LI L P，WANG R，et al.PCR detection and PFGE genotype analyses of streptococcal clinical isolates from tilapia in China［J］.Veterinary Microbiology，2012，159:526-530.

［21］陳松林，田永勝，徐田軍，等.牙鲆抗病群體和家系的建立及其生長和抗病性能初步測定［J］.水產(chǎn)學報，2008，32(5):665-673.

［22］王瑞.羅非魚ICER和PGRN基因cDNA序列及表達分析［D］.南寧:廣西大學，2010:9-12.

［23］BOLIVAR R B，NEWKIRK G F.Response to within family selection for body weight in Nile tilapia(Oreochromis niloticus)using a single-trait animal model［J］.Aquaculture，2002，204(3/4):371-381.