羅 坤，胡利鋒，劉開林，劉祥英，柏連陽

(1.湖南農業(yè)大學植物保護學院，湖南長沙410128;2.湖南農業(yè)科學院，湖南長沙410125)

番茄青枯病是由番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)引起的，是一種典型的土傳病害，長期以來威脅著番茄的生產［1-2］。番茄青枯病的防治方法主要有抗病品種和化學防治，如農用硫酸鏈霉素、新植霉素等。番茄青枯病生物防治主要從土壤中或者植株中分離純化篩選拮抗菌［3-4］，與番茄青枯病菌有相同的生態(tài)位，用于防治青枯病前景廣闊［5-6］。筆者從番茄青枯病發(fā)病田塊中的無病植株根際土壤中篩選獲得拮抗細菌，鑒定了其分類地位，并通過盆栽試驗驗證了其防效，旨在為番茄青枯病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基。NA培養(yǎng)基:蛋白胨5.0 g，牛肉膏3.0 g，酵母粉1.0 g，蔗糖/葡萄糖15.0 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1 000ml，pH 7.0。

1.1.2 供試菌株。番茄青枯菌ND1由湖南農業(yè)大學農藥研究所提供。

1.1.3 供試土樣。土樣樣品采集于湖南省張家界市高峰鄉(xiāng)，采集病田塊中的健康植株的根圍土壤。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離、純化與保存。采用稀釋分離法。稱取10 g土樣，加入90 ml無菌水中，從濃度為1×10-5g/ml的菌液中吸取150 μl放入培養(yǎng)基中，涂板。涂布后的平板以30℃培養(yǎng)24 h后觀察，挑取單菌落進行劃線純化，并編號［7］。

1.2.2 拮抗菌的篩選。采用抑菌圈法。以番茄青枯菌ND1為指示菌，檢測細菌的拮抗效果。將待測菌接在含有青枯菌的NA平板中心，30℃下培養(yǎng)48 h后，觀察有無抑菌圈形成。

1.2.3 拮抗菌的鑒定。

1.2.3.1 細菌的培養(yǎng)性狀的觀察。按《細菌分類學》的細菌培養(yǎng)性狀方法進行培養(yǎng)性狀的觀察。

1.2.3.2 生理生化反應的測定。主要包括對拮抗菌進行氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、V-P試驗、產H2S等試驗。

1.2.3.3 細菌16S rDNA引物測序及分析。將篩選得到的拮抗細菌用通用引物16S rDNA進行測序。引物采用細菌16S rDNA通用引物27F和1492R，即27F:AGA GTT TGATCCTGG CTCAG和1492R:TACGGCTACCTTGTTACGACTT。反應程序:95℃變性5 min;94℃變性40 s，56℃復性40 s，72℃延伸90 s，32次循環(huán);72℃延伸7min，4℃保存。再將PCR產物送交廣東深圳華大基因有限公司進行測序，將序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，應用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中已有的細菌16S rDNA序列進行同源性比較分析。序列的比較及系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA4.0軟件進行［8］。

1.2.4 拮抗菌88號菌株溫室防效測定。接種病原菌3 d后，采用接抗菌88菌株發(fā)酵液灌根處理，設發(fā)病對照(CK)及鏈霉素對照，每處理4次重復，每重復5株番茄苗。記錄14 d的發(fā)病情況，計算病情指數(shù)及相對防治效果。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌篩選結果 以番茄青枯菌ND1為供試菌，從高華鄉(xiāng)番茄土樣中分離純化得到的104株細菌。將各類菌株分別進行拮抗作用測定，篩選到對番茄青枯病菌拮抗活性菌株有6株，占總數(shù)的5.7%。其中，菌株24號、菌株88號的抑菌半徑分別達6.3和7.2 mm，菌株38號、菌株39號、菌株54號和菌株102號的抑菌半徑相對較小，分別為2.5、2.7、1.2和2.3 mm(圖1)。

2.2 細菌種類初步鑒定 菌株88號的形態(tài)學特征、培養(yǎng)性狀在NA培養(yǎng)基上菌落生長慢，圓形、隆起、光滑、灰白色。在PDA培養(yǎng)基上菌落小，黃乳白色。在KB培養(yǎng)基上不產生熒光。G-，桿狀，極生鞭毛，未見芽孢。形成菌膜陰性，甲基紅陰性，VP試驗陰性，石蕊牛乳產堿，明膠液化陽性，產生H2S陰性，產生吲哚陽性，硝酸鹽還原陽性。根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》(第九版，1994)所列的有關伯克氏屬形態(tài)學與生理生化形狀的描述初步認定拮抗細菌菌株88號屬于伯克氏屬(Burkholderia sp.)。

2.3 拮抗菌測序結果及分析 用16S rDNA通用引物，以菌株88的DNA為模板，經PCR反應擴增出1條約1 600 bp特異性片段，并同GenBank中16S rDNA序列進行比對，序列與越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis)FJ577505.1序列同源性高達100%。運用MEGA3.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，從菌株88所構建的系統(tǒng)進化樹來看，它與許多越南伯克氏菌之間的進化距離相隔較近，與菌株88號的形態(tài)特征和生理生化指標測定的結果一致。

2.4 拮抗菌溫室防控效果 結果表明，菌株88號對番茄青枯病菌14 d的防治效果為96.4%，極顯著高于鏈霉素對照(表1)，拮抗菌88號具有較大的生防應用潛力。

3 討論

番茄青枯病作為番茄生產上的一種頑固的土傳性病害，不易防治［9］。而拮抗菌具有和病原菌相同生態(tài)位等顯著特點，利用生物防治青枯病前景廣闊。該試驗在利用前人研究的方法篩選出1株細菌88號，對番茄青枯菌有很強的拮抗作用。經研究鑒定，該細菌均屬于伯克氏屬，與通常研究發(fā)現(xiàn)的青枯菌拮抗菌多屬于芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬不同。分子鑒定結果顯示，88號菌株為越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis)。此外發(fā)現(xiàn)，菌株88號對番茄晚疫病也有很強的拮抗作用，因此在防治番茄土傳病害上具有很好的應用前景［10-11］。

［1］易有金，劉如石，尹華群.番茄青枯病拮抗菌的分離、鑒定及田間防效應用［J］.生態(tài)學報，2007，18(3):554-558.

［2］易有金，羅坤，羅寬.拮抗菌B-001抗菌蛋白產生的最佳發(fā)酵條件和特性及其室內防效［J］.湖南農業(yè)大學學報:自然科學版，2007，33(1):345-347.

［3］熊仕俊，孫成龍，施闖，等.番茄青枯病菌拮抗放線菌的篩選及鑒定［J］.北方園藝，2014(5):114-117.

［4］肖燁，洪艷云，易圖永，等.番茄青枯病生物防治研究進展［J］.植物保護，2007，33(2):15-19.

［5］李鵬，毛自朝，李琪彬，等.青枯勞爾氏菌潛在新寄主鑒定與青枯病防治策略的思考［J］.中國農學通報，2013，29(6):199-202.

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［7］方中達.植病研究方法［M］.3版.北京:中國農業(yè)出版社，1998.

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［9］龍良鯤，肖崇剛，竇彥霞.防治番茄青枯病內生細菌的分離與篩選［J］.中國蔬菜，2003(2):19-21.

［10］LI L C，F(xiàn)ENG X J，TANG M，et al.Antibacterial activity of Lansiumamide B to tobacco bacterial wilt(Ralstonia solanacearum)［J］.Microbiological Research，2014，169:522-526.

［11］韋中，胡潔，董月，等.基于菜粕有機肥篩選番茄青枯病高效生防菌的研究［J/OL］.南京農業(yè)大學學報，2015(2).http://www.cnki.net/kcms/detail/32.1148.S.20150112.1012.002.html.