姚 嵐，李萬(wàn)水，胡 蘭， 徐 珍，*

（1.公安部物證鑒定中心 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 10 0038；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016）

線粒體全基因組測(cè)序在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

姚 嵐1，2，李萬(wàn)水1，胡 蘭1， 徐 珍1，*

（1.公安部物證鑒定中心 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 10 0038；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016）

線粒體DNA檢測(cè)是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的重要手段之一。隨著分子生物學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使得線粒體DNA檢測(cè)從傳統(tǒng)的部分測(cè)序進(jìn)入到全基因組測(cè)序時(shí)代。相對(duì)于部分測(cè)序，線粒體全基因組測(cè)序能夠提供更全面的序列信息，提高線粒體DNA檢測(cè)的識(shí)別率；同時(shí)也能夠通過(guò)對(duì)全基因組信息的深入分析，獲得樣本來(lái)源信息。本文介紹了經(jīng)典以及新出現(xiàn)的線粒體DNA測(cè)序策略，簡(jiǎn)述了各種測(cè)序策略的優(yōu)缺點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上重點(diǎn)介紹了線粒體全基因組測(cè)序在法醫(yī)遺傳學(xué)、線粒體相關(guān)疾病、衰老機(jī)制等方面的研究和應(yīng)用，最后探討了線粒體全基因組序列分析在法醫(yī)遺傳學(xué)實(shí)踐中應(yīng)用的可能性以及可能面臨的一些問(wèn)題。

法醫(yī)遺傳學(xué)； 線粒體DNA；二代測(cè)序

人類線粒體DNA（mitochondrial DNA，mt DNA）位于細(xì)胞質(zhì)中，是一套獨(dú)立于核染色體之外的完整的遺傳物質(zhì)。線粒體DNA是一個(gè)雙鏈閉合環(huán)狀分子，其全長(zhǎng)16569 bp的序列可分為編碼區(qū)和控制區(qū)兩個(gè)部分。其中，編碼區(qū)較為保守，共37個(gè)基因編碼多種RNA和蛋白質(zhì)?？刂茀^(qū)變異率較高，根據(jù)其在基因組上的位置，通常將其分為三個(gè)區(qū)域：位于線粒體DNA鏈16024～16365 bp的高變1區(qū) （hypervariable regionⅠ， HVⅠ），位于73～340 bp的高變2區(qū)（hypervariable regionⅡ， HVⅡ），以及位于340～576 bp的高變3區(qū) （hypervariable region Ⅲ， HVⅢ）。線粒體DNA具有許多獨(dú)特的特點(diǎn)和不可替代的作用。相對(duì)于核DNA，線粒體DNA的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）在細(xì)胞中具有更高的拷貝數(shù)，在降解檢材中特別是當(dāng)核DNA無(wú)法得到完整分型時(shí)，線粒體DNA信息便顯示出重要的利用價(jià)值；（2）由于經(jīng)常暴露于各種氧化反應(yīng)中［1］，線粒體DNA的變異率比核DNA更高，由此產(chǎn)生的多態(tài)性能夠?yàn)槟赶礑NA比對(duì)提供依據(jù)，且部分多態(tài)性位點(diǎn)亦與地域人群進(jìn)化相關(guān)；（3）線粒體DNA完全由母系遺傳，不存在基因重組，故在母系親屬關(guān)系鑒定中發(fā)揮著無(wú)可替代的作用。過(guò)去，由于測(cè)序技術(shù)以及樣本量有限等原因的限制，線粒體DNA在法醫(yī)遺傳學(xué)中的應(yīng)用主要是對(duì)其高變1區(qū)和2區(qū)的DNA序列進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，但僅對(duì)線粒體整個(gè)基因組的一部分進(jìn)行分析會(huì)因信息不完整導(dǎo)致線粒體DNA鑒定結(jié)果無(wú)法判斷甚至出現(xiàn)錯(cuò)誤，從而削弱線粒體檢測(cè)的識(shí)別能力［2， 3］，限制了其在法醫(yī)DNA鑒定中的應(yīng)用。

在分子生物學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)等相關(guān)技術(shù)飛速發(fā)展的今天，多種高新技術(shù)如多重PCR、高通量測(cè)序等技術(shù)的出現(xiàn)，使得在短時(shí)間內(nèi)快速準(zhǔn)確地測(cè)定線粒體全基因組序列成為可能，而且隨著高通量測(cè)序成本的不斷降低，線粒體全基因組序列分析已逐漸成為線粒體DNA檢測(cè)的主要手段。尤其是二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使得法醫(yī)工作者能夠方便地獲得更全面的線粒體基因組信息，在提高線粒體DNA檢測(cè)識(shí)別率的同時(shí)，能夠獲得更多樣品來(lái)源信息。二代測(cè)序通過(guò)一個(gè)檢測(cè)過(guò)程就能得到目前所需的所有信息，非常適用于微量檢材的檢驗(yàn)。有實(shí)驗(yàn)室對(duì)線粒體全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其能夠提供除高變區(qū)外的單倍體類型，從而獲得更全面的樣本mtDNA單倍群信息。更全面的單倍群信息的應(yīng)用可明顯降低線粒體DNA異質(zhì)性的假陽(yáng)性率［4］，同時(shí)還能夠?qū)M織特異性進(jìn)行檢測(cè)［5，6］。Parsons、Coble等［7， 8］提出，相對(duì)于僅對(duì)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，對(duì)線粒體的全基因組測(cè)序比對(duì)能夠明顯提高線粒體DNA在人群中的分辨力。除此之外，線粒體DNA本身還包含有許多其它的信息。線粒體在體內(nèi)作為能量供給站，其編碼的基因包括呼吸鏈的相關(guān)蛋白、氧化磷酸化相關(guān)蛋白、部分rRNA和tRNA等。相對(duì)于控制區(qū)，編碼區(qū)的變異率較低［9］，編碼區(qū)的序列能夠提供樣本來(lái)源有關(guān)的疾病信息，如有研究發(fā)現(xiàn)心肌?。?0］、腫瘤或動(dòng)脈粥樣硬化［11］等疾病與線粒體DNA序列突變有關(guān)。

1 線粒體測(cè)序

線粒體DNA測(cè)序，主要有傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序法，以及以DNA合成為基礎(chǔ)的二代測(cè)序方法。Sanger測(cè)序法是以雙脫氧核苷三磷酸（dideoxynucleotide triphosphate， ddNTP）終止反應(yīng)為基礎(chǔ)的測(cè)序方法。近年來(lái)由于硬件的不斷更新，亦能用于線粒體的全長(zhǎng)測(cè)序，但由于其時(shí)間和成本均較高，該方法的推廣和應(yīng)用受到很大限制。目前，Sanger測(cè)序法仍是唯一符合法醫(yī)學(xué)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序法［12］。二代測(cè)序，又稱新一代測(cè)序（next generation sequencing， NGS），它以DNA合成為基礎(chǔ)，在多個(gè)片段同時(shí)復(fù)制時(shí)，通過(guò)檢測(cè)每條DNA鏈復(fù)制過(guò)程中釋放的離子轉(zhuǎn)化成的電信號(hào)或者DNA新鏈摻入時(shí)釋放的熒光信號(hào)而實(shí)現(xiàn)高通量并行測(cè)序。二代測(cè)序法能在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)線粒體基因組的高深度測(cè)序，相對(duì)經(jīng)典Sanger測(cè)序法靈敏度更高。

1.1 測(cè)序策略

測(cè)序的策略根據(jù)測(cè)序目的以及測(cè)序平臺(tái)的不同而有不同選擇。根據(jù)獲得線粒體DNA方法的不同可將測(cè)序分為直接測(cè)序和間接測(cè)序。直接測(cè)序是指先通過(guò)DNA提取或擴(kuò)增獲得足夠的線粒體DNA后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序［13］。由于檢材量的限制，直接提取得到的DNA量往往非常有限，通常需對(duì)線粒體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增或探針捕獲［14］進(jìn)行富集后測(cè)序。對(duì)于線粒體DNA 16569 bp全基因組的擴(kuò)增，需使用多對(duì)引物進(jìn)行分段擴(kuò)增。有文獻(xiàn)推薦使用65對(duì)引物［15］或34個(gè)擴(kuò)增片段［16］對(duì)線粒體全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增，也有報(bào)道僅使用12對(duì)相互重疊的引物也能獲得良好的線粒體全基因組擴(kuò)增效果［7，8］。由于法醫(yī)鑒定中的檢材大部分為降解檢材，為了提高DNA的檢出率，測(cè)序的策略應(yīng)盡量采用較小的擴(kuò)增片段，并且為避免擴(kuò)增片段間的相互干擾，還應(yīng)該減少不必要的擴(kuò)增子數(shù)目。對(duì)于線粒體DNA而言，因其序列包含較多高變位點(diǎn)，且存在與核染色體高度同源的序列，使得線粒體測(cè)序策略的選擇有一定難度。Fendt等［17］先將16 kb長(zhǎng)的線粒體DNA擴(kuò)增為A、B兩個(gè)約8.5 kb長(zhǎng)的片段，然后用48對(duì)測(cè)序引物對(duì)上述兩個(gè)長(zhǎng)片段進(jìn)行測(cè)序。此方法適合于DNA質(zhì)量較好的線粒體樣本。Lyons等［18］利用Sanger法對(duì)人群的線粒體全基因組進(jìn)行測(cè)序，采用的是將16 kb的線粒體全基因組序列在96孔板中分成8個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增，然后再利用多個(gè)測(cè)序引物進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，共將其分為135個(gè)片段來(lái)進(jìn)行測(cè)序。此方法大大降低了核線粒體DNA（nuclear mitochondrial DNA， NUMT）的干擾，使得測(cè)序DNA起始用量降至50 pg～1 ng。間接測(cè)序是指先通過(guò)測(cè)序得到樣品所有的DNA序列信息后，通過(guò)生物信息學(xué)的方法將線粒體DNA序列篩選出來(lái)。此方法很難進(jìn)行質(zhì)量控制，也極易受假陽(yáng)性和核DNA的干擾。在二代測(cè)序方面，Mikkelsen等［19］用二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)10個(gè)無(wú)關(guān)個(gè)體的線粒體全基因組進(jìn)行了檢測(cè)，采用的是將整個(gè)線粒體DNA片段分為2個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序。Schonberg［20］和Templeton［21］等也是先將線粒體DNA分成2個(gè)片段進(jìn)行特異擴(kuò)增后，再用物理方法將其打斷為適當(dāng)大小的片段進(jìn)行測(cè)序。此方法雖然可以減少其它非線粒體DNA的污染，但是如此大的擴(kuò)增子在法醫(yī)降解檢材中很難擴(kuò)增得到，而Templeton等在擴(kuò)增片段前還利用探針捕獲的方法對(duì)線粒體DNA進(jìn)行富集，能夠明顯提高二代測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

1.2 線粒體DNA異質(zhì)性

線粒體DNA的異質(zhì)性，是指在同一個(gè)來(lái)源的線粒體基因組中，同一位置上出現(xiàn)兩種或兩種以上的分子類型?，F(xiàn)在的研究多認(rèn)為異質(zhì)性的產(chǎn)生跟瓶頸理論［22］有關(guān)，且多發(fā)生在高代謝的組織上，如毛發(fā)等。線粒體的異質(zhì)性可分為兩種，一種是長(zhǎng)度異質(zhì)性（length heteroplasmy， LHP），另一種為點(diǎn)異質(zhì)性（point heterolasmy， PHP）［4］。異質(zhì)性的發(fā)生類型多種多樣，包括：同一組織來(lái)源，不同細(xì)胞間；同一細(xì)胞，不同線粒體拷貝間；同一線粒體中，不同線粒體DNA分子間［23］。異質(zhì)性的出現(xiàn)，為法醫(yī)線粒體DNA鑒定帶來(lái)一定挑戰(zhàn)。但需要注意的是，異質(zhì)性并非出現(xiàn)于線粒體基因組的必然之物。傳統(tǒng)異質(zhì)性的研究是通過(guò)Sanger法測(cè)序獲得的，但通過(guò)Sanger法判斷點(diǎn)異質(zhì)性易受到引物或者異質(zhì)點(diǎn)位置的干擾，且沒(méi)有一個(gè)確定的異質(zhì)性標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度也較低；而利用二代測(cè)序的方法，能夠得到整個(gè)線粒體DNA序列的異質(zhì)性位點(diǎn)信息，并且由于是通過(guò)雙向測(cè)序獲得，其結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。通過(guò)目前二代測(cè)序?qū)€粒體DNA異質(zhì)性的研究表明，線粒體DNA異質(zhì)性的發(fā)生率要高于以往的研究結(jié)果［4］，但到底是由于檢測(cè)方法敏感度的增加導(dǎo)致的假陽(yáng)性還是由于異質(zhì)性的確比之前認(rèn)為的更易發(fā)生，以及如何將此方面研究應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)際案例，尚需進(jìn)一步深入研究。除此之外，為了避免不完整測(cè)序造成的將可能的單倍型誤認(rèn)為變異，現(xiàn)在一些線粒體DNA數(shù)據(jù)庫(kù)以全基因組范圍的單倍群為基礎(chǔ)［24］。

2 線粒體全基因組測(cè)序應(yīng)用研究

目前，已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)線粒體全基因組進(jìn)行深入研究，由此線粒體全基因組數(shù)據(jù)近年飛速增長(zhǎng)，僅2014年增加約15%［25］，其應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣泛，包括法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親屬關(guān)系鑒定以及嫌疑的排除，臨床醫(yī)學(xué)上相關(guān)疾病的診斷、治療及危險(xiǎn)因素的判斷等。在衰老的機(jī)制研究中，人們也普遍認(rèn)為線粒體基因組變異與衰老有關(guān)。

2.1 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

早在新的測(cè)序方法出現(xiàn)前便有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)線粒體的全基因組測(cè)序相較于高變區(qū)的測(cè)序有更高的識(shí)別能力［8］，但由于種種限制使得通過(guò)將編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)聯(lián)合高變區(qū)測(cè)序成為全基因測(cè)序的替代［8］，但這始終無(wú)法達(dá)到全基因組測(cè)序的高分辨率。新的技術(shù)出現(xiàn)后，許多學(xué)者便嘗試將其用于法醫(yī)學(xué)的研究，包括Loreille等［26］利用二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)高度降解的未知名骨骼樣本進(jìn)行了線粒體全基因組測(cè)序。King等［27］對(duì)2014年英國(guó)出土的懷疑為理查三世的尸骨進(jìn)行了鑒定，通過(guò)Y染色體、線粒體和表觀遺傳SNP相關(guān)位點(diǎn)的聯(lián)合應(yīng)用確認(rèn)該遺骨確為理查三世。其中線粒體就是采用DNA雜交捕獲后的長(zhǎng)片段擴(kuò)增，在二代測(cè)序平臺(tái)上獲得全基因組數(shù)據(jù)，并得到了完美比對(duì)結(jié)果。另外，因?yàn)閷?duì)于一些稀有的疑似單倍型的判斷依賴于準(zhǔn)確的人群調(diào)查，已有的數(shù)據(jù)大多僅基于非編碼區(qū)的數(shù)據(jù)，而隨著越來(lái)越多的認(rèn)識(shí)發(fā)現(xiàn)線粒體全基因組的分析更全面和準(zhǔn)確，Just等［28］便用高通量的Sanger測(cè)序法對(duì)3個(gè)民族588個(gè)美國(guó)個(gè)體進(jìn)行全基因組測(cè)序，為將來(lái)的全基因組比對(duì)提供了更好的基礎(chǔ)支持。除此之外，Bouhlal等［29］通過(guò)二代測(cè)序的方法輔以一代驗(yàn)證對(duì)一對(duì)同卵雙胞胎進(jìn)行了線粒體全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了低頻率的不同的異質(zhì)性位點(diǎn)，但考慮到核DNA的干擾，且該實(shí)驗(yàn)也缺乏不同年齡段的參考數(shù)據(jù)，因此有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.2 線粒體相關(guān)疾病

由于線粒體在體內(nèi)的主要功能是氧化供能，其變異極有可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。將線粒體單倍群與一些相關(guān)疾病，如白血病、Ⅱ型糖尿?。?0］、老年癡呆癥［31］等進(jìn)行相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)線粒體全基因組的單倍型類型是疾病發(fā)生的相關(guān)因素。由于全基因組檢測(cè)技術(shù)的普及，使得線粒體基因的功能研究能夠進(jìn)一步深入。Atilano等［32］使用了分子克隆和線粒體全基因測(cè)序的方法，確認(rèn)了不同單倍群對(duì)甲基化的差別調(diào)控影響了炎癥反應(yīng)。另外，Zaragoza等［10］利用全測(cè)序分析的方法對(duì)母系遺傳的心肌病病人進(jìn)行線粒體測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了更多與疾病相關(guān)的變異位點(diǎn)。

2.3 衰老機(jī)制

氧化應(yīng)激是人體衰老的分子機(jī)制之一，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)氧化劑和抗氧化劑的不平衡時(shí)便會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的累積。現(xiàn)在認(rèn)為在氧化磷酸化過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧作為強(qiáng)氧化劑對(duì)細(xì)胞的老化有重要的作用，線粒體作為細(xì)胞內(nèi)重要的產(chǎn)生活性氧的器官便在衰老的過(guò)程中起著重要的作用［33，34］。隨著年齡增長(zhǎng)，線粒體發(fā)生的變異也明顯增多，目前也尚未明確是由于衰老導(dǎo)致的變異還是由變異造成的衰老，許多實(shí)驗(yàn)也能明顯觀察到隨著年齡增長(zhǎng)線粒體基因組的變異也隨之增加［35］。新的技術(shù)為線粒體全基因的變異檢測(cè)提供了新的解決方案，為線粒體和核DNA的聯(lián)合分析提供了可能［36］。能否將線粒體全基因的變異與死亡年齡推斷聯(lián)系起來(lái)應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)際應(yīng)用中［37］，有待進(jìn)一步的研究。

3 展 望

線粒體全基因組測(cè)序分析能夠?yàn)榉ㄡt(yī)學(xué)線粒體DNA鑒定帶來(lái)許多極具吸引力的新應(yīng)用。雖然已有不少關(guān)于基于二代測(cè)序的線粒體全基因組分析應(yīng)用的嘗試，目前還沒(méi)有能夠廣泛適用于法醫(yī)學(xué)微量DNA檢驗(yàn)的解決方案，既保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)兼具高度靈敏性。另外，線粒體的全基因組分析要求對(duì)線粒體DNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步補(bǔ)充和完善，目前一些線粒體單倍型相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)，如PhyloTree build 16［24］，已經(jīng)進(jìn)行了全基因組范圍的單倍型的補(bǔ)充，仍有許多相關(guān)的工作需進(jìn)一步探索和累積。

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引用本文格式：姚嵐， 李萬(wàn)水， 胡蘭， 等.線粒體全基因組測(cè)序在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 ［J］.刑事技術(shù)， 2015，40（5）:368-372.

Whole Genome Sequencing of Mitochondria and Its Application in Forensic Science

YAO Lan1，2， LI Wanshui1， HU Lan1， XU Zhen1，*
（1.Key Laboratory of Forensic Genetics of Ministry of Public Security， Institute of Forensic Science of Ministry of Public Security， Beijing 100038， China； 2.Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

Compared to nuclear DNA， mitochondrial DNA （mtDNA） has many unique characters， and plays an important role in some specifi c cases.Traditional analysis of mitochondrial DNA is to partially sequence the high variant regions of mitochondrial genome.Presently， with the development of techniques in molecular biology and bioinformatics， the next generation sequencing （NGS） enables the mitochondrial DNA analysis into whole g enome sequencing which provides more comprehensive information and raises the power of discrimination.Furthermore， whole genome analysis of mitochondrial DNA will give extra information assisting in sample source inferring， haplogroup detecting， diseases testing and among others.In this paper， we will review the classic and the newly emerging mitochondrial sequencing strategies including their advantages and disadvantages.Besides， we will give a brief introduction to the new applications of mitochondrial genome sequencing in forensic genetics， mitochondria diseases and aging research， and show the novel findings along with these practices.Finally， we will discuss the prospect of forensic application of mitochondrial whole genome sequencing， as well as the benefi ts and potential problems it may bring together.

forensic genetics； mitochondrial DNA； next generation sequencing

DF795.2

A

1008-3650（2015）05-0368-06

10.16467/j.1008-3650.2015.05.005

公安部科技強(qiáng)警基礎(chǔ)工作專項(xiàng)項(xiàng)目（No.2013GABJC033）

姚 嵐（1985—），女，重慶人，博士研究生，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)遺傳學(xué)。 Email: 14312423@qq.com

徐 珍，女，主檢法醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)遺傳學(xué)。 E-mail: xuzhen@cifs.cifs.gov.cn

2015-07-13