毛小元，李秋琪，周宏灝，劉昭前

（1．中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所，湖南長沙 410008；2．中南大學(xué)臨床藥理研究所湖南省遺傳藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410078；3．湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南衡陽 421001）

大黃酚對糖尿病腦病大鼠海馬中BDNF、iNOS和氧化應(yīng)激的影響

毛小元1，2，3，李秋琪1，2，3，周宏灝1，2，3，劉昭前1，2，3

（1．中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所，湖南長沙 410008；2．中南大學(xué)臨床藥理研究所
湖南省遺傳藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410078；3．湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南衡陽 421001）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R322．81；R338.64；R587.2；R977.3；R977.6

摘要：目的 探討大黃酚對糖尿病腦病的神經(jīng)保護(hù)作用及其分子機(jī)制。方法 應(yīng)用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大黃酚對糖尿病大鼠模型學(xué)習(xí)記憶的影響；應(yīng)用試劑盒法檢測不同實(shí)驗(yàn)組海馬中膽堿酯酶（AChE），膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶（ChAT），腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF），誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（CAT、SOD、GSH）的活性。結(jié)果 大黃酚改善了糖尿病大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力，增強(qiáng)了糖尿病大鼠模型組海馬中AChE和BDNF的活性，抑制了模型組海馬中ChAT、iNOS、CAT、SOD和GSH的活性。結(jié)論 大黃酚可能通過增強(qiáng)BDNF的活性，下調(diào)iNOS的功能及抗氧化途徑從而對糖尿病腦病產(chǎn)生保護(hù)作用，其可能成為臨床上治療糖尿病腦病的新型藥物。

關(guān)鍵詞：大黃酚；糖尿病腦?。簧窠?jīng)保護(hù)；海馬；BDNF；iNOS；氧化應(yīng)激

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．007．html

糖尿病是一種非常常見的代謝型疾病，具有多種并發(fā)癥，其中糖尿病腦病是糖尿病發(fā)生過程中一種主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，包含認(rèn)知障礙和大腦的神經(jīng)生理及結(jié)構(gòu)的改變［1－2］，嚴(yán)重危害人民的身心健康。其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，近年來發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic fac-tor，BDNF）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和氧化應(yīng)激可能與糖尿病腦病的發(fā)生密切相關(guān)［3－5］。此外，膽堿能神經(jīng)元中乙酰膽堿含量的降低能夠促使糖尿病腦病的發(fā)生［6］。

大黃酚（chrysophanol，CHR）是蓼科植物掌葉大黃中的主要有效成分。以往的研究發(fā)現(xiàn)，它對Aβ25－35誘導(dǎo)的阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用［7］。同時(shí)，大黃酚對大鼠全腦缺血／再灌注損傷引起的學(xué)習(xí)記憶障礙也具有保護(hù)作用［8］。然而，大黃酚對糖尿病腦病是否具有神經(jīng)保護(hù)作用以及其具體的分子機(jī)制，目前尚未見報(bào)道。因此，本研究通過探討大黃酚對糖尿病腦病的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制，為臨床上治療糖尿病腦病提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1．1動物、主要試劑和儀器 成年3月齡♂Wistar大鼠（n＝48，300～350 g），由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供。STZ（美國Sigma公司）。大黃酚（南京清澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，實(shí)驗(yàn)前用N，N-二甲基甲酰胺，吐溫-80和生理鹽水按照1∶1∶1的比例溶解）。鹽酸多奈哌齊片（中國衛(wèi)材藥業(yè)）。糖過氧化物酶診斷試劑盒（印度Span Diagnostic）。膽堿酯酶（AChE）和膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性檢測試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所）。iNOS活性檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。BDNF活性檢測試劑盒（美國Promega）。Centrifuge 5810R低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf），酶標(biāo)儀（南京德鐵）。

1．2糖尿病大鼠模型制作及藥物干預(yù) 隨機(jī)選取48只Wistar大鼠，單次腹腔注射鏈脲霉素（STZ，劑量65 mg·kg－1，溶劑0.1 mol·L－1檸檬酸鈉緩沖

液），其余8只大鼠給予等劑量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射作為對照組。給予STZ 72 h之后，使用糖過氧化物酶診斷試劑盒檢測血糖，快速血糖濃度大于2 500 mg·L－1認(rèn)為糖尿病模型制作成功，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)分為如下6組，每組8只：（1）對照組（Con）；（2）模型組（DM）；（3）低劑量治療組（CHR 0.014）；（4）中劑量治療組（CHR 0.07）；（5）高劑量治療組（CHR 0.35）；（6）陽性對照組（Don）。其中模型組中給予等量的生理鹽水作為對照，大黃酚以腹腔注射方式分別按照0.014、0.07和0.35 mg· kg－1給藥，多奈哌齊也是腹腔注射給藥（1 mg· kg－1），1d 1次，連續(xù)給藥21 d。各組實(shí)驗(yàn)動物每周測體重和血糖。給藥結(jié)束后，進(jìn)行后續(xù)的水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1．3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 各實(shí)驗(yàn)組給藥21 d后，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)考察各組實(shí)驗(yàn)動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力，參照以前實(shí)驗(yàn)方法，并作修改［8］。實(shí)驗(yàn)d 1將大鼠放入水中自由游泳2 min，水迷宮里未放平臺。d 2～4為定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄各組實(shí)驗(yàn)動物的逃逸潛伏期（找到平臺所需的時(shí)間）。d 5為空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄各組實(shí)驗(yàn)動物在60s內(nèi)穿梭平臺的次數(shù)和位于平臺所在象限內(nèi)（目標(biāo)象限）探索時(shí)間。

1．4AChE、ChAT、iNOS、CAT、SOD和GSH-PX活性及BDNF濃度測定 各實(shí)驗(yàn)組動物在麻醉狀態(tài)下斷頭迅速剝離海馬，按照試劑盒說明書測定海馬組織中AChE、ChAT、iNOS、CAT、SOD和GSH-PX活性及BDNF濃度。

2　結(jié)果

2．1大黃酚改善了糖尿病大鼠模型的體重和血糖給予大黃酚治療21 d后，我們首先探索大黃酚對糖尿病大鼠模型體重和血糖的影響。Tab 1的研究結(jié)果表明，與正常對照組比較，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型的體重明顯減少（P＜0.01）。而大黃酚治療21 d后，糖尿病大鼠模型中體重減少的現(xiàn)象得到明顯地逆轉(zhuǎn)（P＜0.01），且呈現(xiàn)劑量依賴性。與此同時(shí)，相比于正常對照組，糖尿病大鼠模型的血糖明顯升高（P＜0.01）。而不同劑量的大黃酚明顯降低了糖尿病大鼠的血糖濃度（P＜0.01）。大黃酚改善糖尿病大鼠模型的體重和血糖的作用與陽性對照藥多奈哌齊的作用非常相似（P＞0.05）。

2．2大黃酚改善了糖尿病大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力 為了闡明大黃酚對糖尿病大鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能的影響，我們使用了Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察。Fig 1結(jié)果表明，糖尿病大鼠模型在d 1～4的實(shí)驗(yàn)中，逃逸潛伏期均比正常對照組明顯增加（P＜0.01）。同時(shí)，在d 5的空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)，模型組中穿梭平臺的次數(shù)和在目標(biāo)象限中探索的時(shí)間均比正常對照組明顯縮短（P＜0.01）。而大黃酚干預(yù)后，明顯減少了逃逸潛伏期，增加了穿梭次數(shù)和在目標(biāo)象限中探索的時(shí)間（P＜0.01），且呈現(xiàn)劑量依賴性。其中0.35 mg·kg－1大黃酚改善糖尿病大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶作用與陽性對照藥多奈哌齊的作用非常相似（P＞0.05）。

Tab 1 Body weight and blood glucose levels from different groups（±s，n＝8）

Tab 1 Body weight and blood glucose levels from different groups（±s，n＝8）

**P＜0.01 vs Con group；＃＃P＜0.01 vs DM group．Con，control group；DM，diabetes group；CHR（0．014），chrysophanol（0.014 mg· kg－1）-treated group；CHR（0．07），chrysophanol（0．07 mg·kg－1）-treated group；CHR（0．35），CHR（0．35 mg·kg－1）-treated group．

Treatment Dose／mg·kg－1Body weight／g　Plasma glucose／10 mg·L－1Con　331．25±3．66　119．25±2．25 DM　116．25±2．98　589．15±2．19**CHR　0．014　236．36±3．66＃＃　299．12±2．55＃＃CHR　0．07　259．43±4．66＃?！?65．60±4．12＃＃CHR　0．35　269．36±4．88＃＃　231．25±2．78＃＃

2．3大黃酚提高了糖尿病大鼠模型海馬中AChE 和ChAT的活性 AChE和ChAT是學(xué)習(xí)記憶功能調(diào)節(jié)中的兩種關(guān)鍵酶，因此我們檢測了不同實(shí)驗(yàn)組海馬中AChE和ChAT的活性。Fig 2的結(jié)果表明，糖尿病大鼠模型海馬中AChE的活性明顯高于正常對照組（P＜0.01），而ChAT的活性卻明顯低于正常組（P＜0.01）。不同劑量（0.014、0.07和0.35 mg·kg－1）大黃酚治療后，海馬中AChE的活性明顯降低（P＜0.01），同時(shí)ChAT的活性明顯增高（P＜0.01）。且0.35 mg·kg－1大黃酚改變糖尿病大鼠模型海馬中AChE和ChAT活性的作用與陽性對照藥多奈哌齊的作用非常相似（P＞0.05）。

2．4大黃酚提高了糖尿病大鼠模型海馬中BDNF的濃度 為了探索大黃酚對糖尿病大鼠模型海馬中BDNF濃度的影響，我們使用ELISA法檢測了不同實(shí)驗(yàn)組海馬中BDNF的濃度。從Fig 3可以看出，不同劑量（0.014、0.07和0.35 mg·kg－1）大黃酚干預(yù)后，海馬中BDNF的濃度明顯提高（P＜0.01）。且0.35 mg·kg－1大黃酚改變糖尿病大鼠模型海馬中BDNF濃度的作用與陽性對照藥多奈哌齊的作用非常相似（P＞0.05）。

2．5大黃酚抑制了糖尿病大鼠模型海馬中iNOS的活性 我們還探索了大黃酚對糖尿病大鼠模型海馬中iNOS活性的影響。Fig 4的結(jié)果表明，糖尿病大鼠模型海馬中iNOS的活性明顯高于正常對照組

（P＜0.01）。而使用不同劑量（0.014、0.07和0.35 mg·kg－1）的大黃酚能夠明顯抑制模型組海馬中iNOS的活性（P＜0.01）。且這種抑制作用與陽性對照藥多奈哌齊的作用非常相似（P＞0.05）。

Fig 1 Effects of chrysophanol on escape latency（A），number of crossing platform（B）and percentage of time spent in targetquadrant（C）on diabetic rats（±s，n＝8）

2．6大黃酚抑制了糖尿病大鼠模型海馬中的氧化應(yīng)激 Fig5的結(jié)果表明，糖尿病腦病大鼠模型海馬中抗氧化指標(biāo)（包括CAT，SOD和GSH）活性均明顯低于正常對照組（P＜0.01）。而不同劑量（0.014、0.07和0.35 mg·kg－1）的大黃酚明顯提高了CAT，SOD和GSH的活性（P＜0.01）。且0.35 mg·kg－1大黃酚的抗氧化作用與陽性對照藥多奈哌齊的作用非常相似（P＞0.05）。

Fig 2 Effects of chrysophanol on AChE（A）and ChAT（B）in the hippocampus of diabetic rats（±s，n＝8）

Fig 3 Effects of chrysophanol on BDNF content in the hippocampus of diabetic rats（±s，n＝8）

Fig 4 Effects of chrysophanol on iNOS activity in the hippocampus of diabetic rats（±s，n＝8）

3　討論

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子中的重要成員。以往許多研究表明，BDNF不僅對胚胎神經(jīng)元的發(fā)生、發(fā)育和存活具有重要的調(diào)節(jié)作用，而且對發(fā)育成熟的神經(jīng)元功能的維持以及神經(jīng)退行性疾病中細(xì)胞損傷具有重要的保護(hù)作用［3］。糖尿病腦病是一種以認(rèn)知功能障礙為主要特點(diǎn)的神經(jīng)退行性疾病，BDNF的減少與糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。事實(shí)上，Nitta等［9］研究證實(shí)，4周齡使用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠皮層和海馬中BDNF的表達(dá)均明顯減少。這可能證實(shí)BDNF與糖尿病誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。與以往的研究結(jié)果一致，我們當(dāng)前的研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠模型海馬中BDNF的濃度明顯低于正常對照組。而且不同劑量的大黃酚明顯提高了糖尿病大鼠海馬中BDNF的濃度，提示大黃酚對糖尿病腦病的神經(jīng)保護(hù)作用可能與上調(diào)BDNF有關(guān)。

氧化應(yīng)激在糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。而活性氮在氧化應(yīng)激的參與中扮演著重要角色。據(jù)報(bào)道，一氧化氮（NO）中過氧亞硝酸鹽陰離子（OONO－）對細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損害作用［10］。OONO－主要是NO與超氧陰離子（O－2）反應(yīng)生成的。而合成NO的一種重要的酶是iNOS。Ce-lik等［11］研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠大腦iNOS活性增加，使NO增加，同時(shí)抗氧化酶SOD和CAT的活性明顯降低，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損害明顯加重。以往的研究也表明，通過下調(diào)iNOS表達(dá)和抑制氧化應(yīng)激能夠?qū)μ悄虿∧X病產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用［11］。與以往的研究報(bào)道一致，我們當(dāng)前的研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠海馬中iNOS的活性明顯增加，同時(shí)抗氧化物酶（CAT、SOD和GSH-PX）的活性均明顯低于正常大鼠。而大黃酚干預(yù)后，明顯抑制了糖尿病大鼠海馬內(nèi)iNOS的活性，同時(shí)增強(qiáng)了抗氧化物酶（CAT、SOD和GSH-PX）的活性。

Fig 5 Effects of chrysophanol on the activities of CAT（A），SOD（B）and GSH-PX（C）in the hippocampus of diabetic rats（±s，n＝8）

綜上，我們的研究結(jié)果表明，大黃酚對糖尿病腦病大鼠模型具有神經(jīng)保護(hù)作用，并且這種保護(hù)作用可能是通過增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)元功能，上調(diào)BDNF，抑制iNOS的活性及抑制氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)的。我們的研究結(jié)果將提示大黃酚可能作為治療糖尿病腦病患者的新型藥物。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Somfai G M，Knippel B，Ruzicska E，et al．Soluble semicarbaz-ide-sensitive amine oxidase（SSAO）activity is related to oxidative stress and subchronic inflammation in streptozotocin-induced dia-betic rats［J］．Neurochem Int，2006，48（8）：746－52．

［2］ Sehirli O，Tozan A，Omurtag G Z，et al．Protective effect of res-veratrol against naphthalene-induced oxidative stress in mice［J］．Ecotoxicol Environ Saf，2008，71（1）：301－8．

［3］ 尹國平，陳 麗．神經(jīng)營養(yǎng)因子與糖尿病腦?。跩］．國際內(nèi)分泌代謝雜志，2006，26（2）：119－44．

［3］ Yin G P，Chen L．Neurotrophic factors and diabetic neuropathies in brain［J］．Intern J Endocrinol Metab，2006，26（2）：119－44．

［4］ 陳艷瑜，魏倩萍，胡義平．姜黃素對糖尿病腦病大鼠氧化應(yīng)激及海馬iNOS表達(dá)的影響［J］．第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31 （12）：1300－4

［4］ Chen Y Y，Wei Q P，Hu Y P．Effect of curcumin on oxidative stress and hippocampus iNOS expression in diabetic encephalopa-thy rats［J］．Acad J Sec Mil Med Univ，2010，31（12）：1300－4．

［5］ 馬冬影，劉繼平，吉薇薇，等．小檗堿對糖尿病腦病大鼠海馬組織氧化應(yīng)激及BDNF表達(dá)的影響［J］．中藥藥理與臨床，2012，28（5）：39－41．

［5］ Ma D Y，Liu J P，Ji W W，et al．Effect of berberine on hipp-ocampal tissue oxidative stress levels and BDNF expression in dia-betic encephalopathy rats［J］．Pharmacol Clin Chin Mater Med，2012，28（5）：39－41．

［6］ Wang C Y，Zheng W，Wang T，et al．Huperzine A activates Wnt／β-catenin signaling and enhances the nonamyloidogenic path-way in an Alzheimer transgenic mouse model［J］．Neuropsycho-pharmacology，2011，36（5）：1073－89．

［7］ 董曉華，張丹參．大黃酚對Aβ25－35所致AD大鼠學(xué)習(xí)記憶及LTP的影響［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（5）：682－5

［7］ Dong X H，Zhang D S．Effects of chrysophanol on memory impair-ment and LTP in AD rats induced by Aβ25－35［J］．Chin Pharma-col Bull，2009，25（5）：682－5．

［8］ 李 超，張丹參，趙曉倩，等．三種大黃酚制劑改善腦缺血／再灌注小鼠記憶功能的實(shí)驗(yàn)篩選研究［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（12）：1607－12．

［8］ Li C，Zhang D S，Zhao X Q，et al．Experimental screening study of three chrysophanol formulations on learning and memory function of mice with cerebral ischemia reperfusion［J］．Chin Pharmacol Bull，2010，26（12）：1607－12．

［9］ Nitta A，Murai R，Suzuki N，et al．Diabetic neuropathies in brain are induced by deficiency of BDNF［J］．Neurotoxicol Teratol，2002，24（5）：695－701．

［10］Hink U，Li H，Mollnau H，et al．Mechanisms underlying endo-thelial dysfunction in diabetes mellitus［J］．Cir Res，2001，88 （2）：E14－22．

［11］Celik S，Erdogan S．Caffeic acid phenethyl ester（CAPE）protects brain against oxidative stress and inflammation induced by diabetes in rats［J］．Mol Cell Biochem，2008，312（1－2）：39－46．

Effects of chrysophanol on BDNF and iNOS together with oxidative stress in rats with diabetes-associated cognitive decline

MAO Xiao-yuan1，2，3，LI Qiu-qi1，2，3，ZHOU Hong-hao1，2，3，LIU Zhao-qian1，2，3
（1．Institute of Clinical Pharmacology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410008，China；2．Institute of Clinical Pharmacology，Hunan Key Laboratory of Pharmacogenetics，Central South University，Changsha 410078，China；3．Hunan Province Cooperation Innovation Center for Molecular Target New Drug Study，Hengyang Hunan 421001，China）

Abstract：Aim To assess the protective role of chry-sophanol in rats with diabetes-associated cognitive de-cline（DACD）and explore the potential molecular mechanisms．Methods The learning and memory performance was assessed by Morris water maze test；the activities of AChE，ChAT，iNOS and oxidative stress markers including CAT，SOD and GSH-PX in the hippocampus were detected using respective com-mercial kits．The level of BDNF was also measured with commercial ELISA kit．Results Chrysophanol significantly improved learning and memory functions in the diabetic groups．Additionally，the activities of AChE，BDNF also found to be evidently increased，while decreased activities of ChAT，iNOS，CAT，SOD and GSH-PX were observed in the hippocampus of dia-betic rats．Conclusions Collectively，chrysophanol has a protective role against DACD and this neuropro-tection is associated with increasing BDNF level．Chry-sophanol can also suppress the activities of iNOS，CAT，SOD and GSH-PX in diabetic rats．It is likely to be a novel therapeutic drug for the treatment of diabetic patients with cognitive deficits in clinical practice．

Key words：chrysophanol；diabetes-associated cogni-tive decline；neuroprotection；hippocampus；BDNF；iNOS；oxidative stress

作者簡介：毛小元（1984－），男，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)、臨床藥理學(xué)，

通訊作者，Tel：0731-84805380，E-mail：maoxiaoyuan2011＠163．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81302750）

收稿日期：2015－05－20，修回日期：2015－06－25

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1211－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．007