王志強，張秀英，李文廣，黃雙盛，劉圓圓，胡臘梅，侯翠蘭，張小郁

（1．蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2．甘肅省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心；3．甘肅省人民醫(yī)院急診科；4．西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000）

異甘草素抗腫瘤活性及初步機制研究

王志強1，2，張秀英3*，李文廣1*，黃雙盛4，劉圓圓1，胡臘梅1，侯翠蘭1，張小郁1

（1．蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2．甘肅省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心；
3．甘肅省人民醫(yī)院急診科；4．西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000）

中國圖書分類號：R284．1；R329．24；R364.3；R979.1

摘要：目的 探討異甘草素（isoliquiritigenin，ISL）抗腫瘤活性及初步機制。方法 采用SRB法檢測ISL對A549、SW620和HMEC-1細胞增殖的抑制作用；Transwell小室檢測ISL對HMEC-1細胞遷移能力的影響；明膠酶譜法檢測ISL 對HMEC-1細胞MMP-2和MMP-9的表達；管樣結(jié)構(gòu)形成實驗測定ISL對HMEC-1細胞管樣結(jié)構(gòu)形成能力；細胞內(nèi)活性氧（ROS）通過熒光探針DCFH-DA進行測定；流式細胞術(shù)檢測ISL對HMEC-1的細胞周期。雞胚絨毛尿囊膜血管生成實驗檢測ISL體內(nèi)抗血管生成作用。結(jié)果 ISL可明顯抑制A549、SW620和HMEC-1細胞的增殖、HMEC-1細胞的遷移、管樣結(jié)構(gòu)形成以及細胞內(nèi)MMP-2和MMP-9的表達，且均呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。同時，ISL還可抑制HMEC-1細胞內(nèi)由VEGF誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS量，且存在濃度依賴關(guān)系。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)高濃度ISL可將HMEC-1細胞阻滯于S期，而低濃度ISL通過誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制HMEC-1細胞的增殖。ISL能明顯抑制雞胚尿囊膜新生毛細血管的生成。結(jié)論

ISL具有明顯的抗腫瘤活性，能抑制血管生成，其機制可能與清除HMEC-1細胞內(nèi)ROS生成，誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：異甘草素；抗腫瘤；血管生成；人微血管內(nèi)皮細胞；血管內(nèi)皮生長因子；細胞凋亡

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．029．html

血管生成（angiogenesis）在腫瘤的生長和發(fā)展過程中起著十分重要的作用［1－3］，血管生成過程是一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程，且受多種因子的調(diào)節(jié)，通過血管生成過程形成的新生毛細血管為腫瘤細胞提供生長所需的氧氣和其他營養(yǎng)物質(zhì)，是腫瘤生長和代謝的有力保障。因此，通過阻斷腫瘤的血管生成過程來抑制腫瘤的生長成為抗腫瘤藥物開發(fā)的一條有效的途徑。

異甘草素（isoliquiritigenin，ISL）為甘草中異黃酮類化合物，主要存在于甘草及許多植物的根部，已被證明具有廣泛的生物學(xué)活性，尤其在抗炎、抗氧化、抗腫瘤等方面具有良好的效果［2，4－5］。研究表明［6－10］，ISL發(fā)揮其抗腫瘤作用是通過抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，以及通過阻斷與腫瘤進展密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來抑制腫瘤的生長。但尚未見有關(guān)ISL對腫瘤血管生成方面的研究。因此，本實驗將在前期研究的基礎(chǔ)上，通過人微血管內(nèi)皮細胞HMEC-1，研究ISL對腫瘤血管生成的作用及其機制。

1　材料

1．1試劑 異甘草素購自江西中草藥天工科技有限公司，純度＞98%，溶解于二甲基亞砜（DMSO），DMSO在各實驗組與陰性對照組中終濃度均為0.5%（V∶V）。重組人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF165）購自Peprotech公司；MCDB 131培養(yǎng)基、表皮生長因子（EGF）、氫化可的松、SRB和DCFH-DA均購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和L-15培養(yǎng)基為Invitrogen公司生產(chǎn)；Matrigel購自BD Biosci-ence公司。

1．2細胞株 人微血管內(nèi)皮細胞（human microvas-cular endothelial cell-1，HMEC-1）、肺癌細胞A549和結(jié)腸癌細胞SW620均購自中國科學(xué)院上海細胞研究所。

2　方法

2．1細胞培養(yǎng) HMEC-1細胞培養(yǎng)用含有20%胎牛血清的MCDB 131完全培養(yǎng)基；A549細胞用10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基；SW620細胞用10%胎牛血清的L-15完全培養(yǎng)基。各細胞的培養(yǎng)均在37℃、5%CO2的條件下進行。

2．2細胞增殖活性 細胞增殖活性實驗采用SRB法。將細胞消化處理，吹打成單細胞懸液并稀釋到所需密度后，接種到96孔板，每孔100 μL。放至CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁，再分別加入各濃度的ISL處理，待藥物作用24、48、72 h之后，分別取出96孔板，用預(yù)冷的10%三氯乙酸固定，1 ～2 h后用蒸餾水洗3～4次，自然晾干后SRB染色30 min，1%醋酸洗滌，室溫干燥，再每孔加入10 mmol·L－1Tris堿溶液150 μL溶解，酶標儀570 nm波長測定其吸光度值。

2．3遷移實驗 使用改良的博伊登Transwell小室測定ISL對HMEC-1細胞遷移能力的影響。取對數(shù)生長期的細胞消化、計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)至5×108· L－1，將Transwell小室裝配到24孔板中，分別在上室中加入360 μL細胞懸液和40 μL不同濃度的ISL，下室則均為20%血清的MCDB 131培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后取出小室，PBS緩沖液洗滌3次，棉棒輕輕擦去上室細胞，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色6 min，最后再用PBS洗去結(jié)合的結(jié)晶紫，鏡下觀察遷移情況并記錄結(jié)果。

2．4管樣結(jié)構(gòu)形成實驗 將預(yù)先放入4℃冰箱的Matrigel取出置于冰浴，用MCDB 131培養(yǎng)基稀釋Matrigel至所需濃度后，每孔60 μL鋪到96孔板中，37℃凝固30 min。取對數(shù)生長期細胞消化、計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)至大約8×108·L－1，取出已凝固的Matri-gel，每孔加HMEC-1細胞懸液90 μL，待細胞沉降后，各孔分別加入相應(yīng)濃度ISL，然后將96孔板在37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，8 h后照相記錄。

2．5明膠酶譜檢測 HMEC-1細胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達采用明膠酶譜法進行。取對數(shù)生長期細胞，D-hanks洗滌3次，加入已配制好的各濃度ISL無血清培養(yǎng)。24 h后收集各濃度下細胞培養(yǎng)液，離心（4℃、2 000 r·min－1、10 min）、分裝。實驗時，取上述樣品，37℃處理30 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，電泳結(jié)束后，洗滌緩沖液洗滌2 h，37℃水浴孵育至少24 h，考馬斯亮藍R-250染色，脫色液適當(dāng)脫色，照相記錄。

2．6VEGF誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS的生成檢測 取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)至鋪滿6孔板底面40%～60%時，各孔加入各濃度ISL，無血清處理4 h。處理完畢后，6孔板各孔（除外溶媒對照）分別加入50 μg·L－1的VEGF作用10 min，再用DCFH-DA染色30 min，PBS洗滌3 ～5次，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并照相記錄。

2．7細胞周期測定 HMEC-1細胞周期的測定是經(jīng)PI染色后流式細胞儀檢測，取對數(shù)生長期細胞并用各濃度ISL處理24 h后，收集細胞并用PBS洗3次，無水乙醇固定，上機測定并記錄數(shù)據(jù)，分析ISL對細胞周期的影響。

2．8雞胚絨毛尿囊膜檢測血管生成 取7日齡雞胚，在相應(yīng)位置開窗（1 cm×1 cm），制備雞胚絨毛尿囊膜模型。再用已制備好的無菌硝酸纖維素膜吸附各濃度ISL并放置到相對無小血管區(qū)域繼續(xù)孵化，每隔24 h更換纖維素膜并重新加藥，72 h后取出雞胚，鏡下觀察ISL對雞胚尿囊膜血管生成的影響，并照相記錄。

2．9統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用Excel建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)值資料用±s表示，多組之間的比較采用單因素方差分析（ANOVA）。圖片資料的處理使用Image pro plus 6.0軟件。

3　結(jié)果

3．1ISL對細胞增殖活性的影響 SRB結(jié)果顯示（Fig 1），ISL可明顯抑制A549、SW620和HMEC-1細胞的增殖活性，且呈現(xiàn)明顯的濃度、時間依賴關(guān)系（P＜0.05）。ISL對A549在24、48、72 h的IC50分別為123.05、60.46、39.09 μmol·L－1；對SW620在24、48、72 h的IC50分別為41.73、27.78、26.98 μmol ·L－1；對HMEC-1細胞在24、48、72 h的IC50分別為161.36、54.30、39.40 μmol·L－1。

Fig 1 Inhibitory effects of ISL on proliferation viability of SW620，A549 and HMEC-1 cells for 24，48 and 72 h by SRB assay

3．2ISL對HMEC-1細胞遷移活性的影響 遷移實驗結(jié)果表明（Fig 2），ISL可明顯抑制HMEC-1細胞的遷移能力，溶媒對照組HMEC-1細胞遷移數(shù)目最多，而ISL處理組中，隨著濃度的不斷增加，發(fā)生遷移的細胞數(shù)越來越少，且呈明顯的濃度依賴關(guān)系（P＜0.05）。ISL在6.25～100 μmol·L－1范圍內(nèi)對HMEC-1細胞的遷移抑制率在不斷增加，分別為21.35%、40.38%、49.72%、64.38%和75.80%。

Fig 2 Effects of ISL on HMEC-1 cell migration activity

3．3ISL對細胞管樣結(jié)構(gòu)的影響 通過3次實驗，結(jié)果如Fig 3顯示，對照組中HMEC-1細胞所形成管腔樣結(jié)構(gòu)較多且管壁比較完整，而ISL處理組中隨著ISL濃度的增加，管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量不斷減少，且管壁越來越不完整，當(dāng)濃度達到100 μmol·L－1時，基本沒有管樣結(jié)構(gòu)形成，說明ISL能夠明顯抑制管樣結(jié)構(gòu)的形成（P＜0.05）。在ISL濃度為25、50、100 μmol·L－1時，其抑制率分別為20.96%、51.85%、80.91%。

Fig 3 Inhibitory effects of ISL on tube formation of HMEC-1 cells

3．4ISL對HMEC-1細胞表達MMP-2和MMP-9的影響 明膠酶譜法檢測結(jié)果顯示，ISL對MMP-2和MMP-9的表達產(chǎn)生明顯的抑制作用（Fig 4）。

Fig 4 Effects of ISL on MMP-2 and MMP-9 expression in HMEC-1 cells for 24 h by gelatin zymographic detection

3．5ISL對HMEC-1細胞內(nèi)ROS生成的影響VEGF可明顯刺激細胞內(nèi)ROS的生成，而ISL可明顯抑制VEGF誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS的生成，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系（P＜0.05）。ISL為12.5～100 μmol·L－1時，其抑制率分別為34.00%、58.27%、75.74%、87.94%（Fig 5）。

Fig 5 Inhibitory effects of ISL on VEGF-induced ROS generation in HMEC-1 cells under a contrast fluorescence microscope（200×）

3．6ISL對細胞周期的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示（Fig 6），給藥組隨著藥物濃度的增加，其處于S期的細胞明顯增多，而ISL為12.5 μmol·L－1時，則出現(xiàn)凋亡峰，說明ISL在高濃度（＞25 μmol·L－1）時，主要將HMEC-1細胞阻滯在S期，而低濃度ISL則是通過誘導(dǎo)細胞凋亡來實現(xiàn)其抑制作用的。

Fig 6 Effects of ISL on HMEC-1 cell cycle for 24 h by flow cytometry

3．7ISL對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響 如Fig 7所示，對照組給藥區(qū)域周圍可見大量豐富的新生毛細血管，而ISL給藥組隨著ISL濃度的增大，其新生毛細血管密度明顯減少，當(dāng)ISL為2 μg·egg－1時，給藥區(qū)域基本無新生毛細血管生成。

4　討論

血管生成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密不可分，新生血管可為腫瘤細胞的增殖、代謝和浸潤提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的保障［11］。腫瘤為了獲得快速生長所需的各種養(yǎng)分，必須建立強大的血管網(wǎng)系統(tǒng)，這就要求腫瘤本身具有一套特殊、完整的血管形成機制來調(diào)節(jié)其血管生成。因此，近年來，與腫瘤血管生成有關(guān)的調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)因子以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為抗腫瘤藥物研究的焦點。國內(nèi)外許多研究報道［12－13］，ISL在抗腫瘤、抗炎、抗氧化等方面具有強大的潛能，但極少有在抑制腫瘤血管生成方面的報道。本研究即從腫瘤血管生成的各個環(huán)節(jié)出發(fā)，探討ISL對腫瘤血管生成過程的影響以及ISL在抗腫瘤方面的應(yīng)用價值。

Fig 7 Antiangiogenesis effect of ISL on chorioallantoic membrane

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ISL可明顯抑制A549和SW620細胞的增殖，證實了ISL的抗腫瘤活性，同時，ISL可以明顯地阻滯血管內(nèi)皮細胞的增殖，說明ISL發(fā)揮其抗腫瘤作用不僅通過直接抑制腫瘤細胞的生長，還具有抗腫瘤血管生成作用。隨著ISL作用時間的延長和濃度的增加，ISL對腫瘤細胞和HMEC-1細胞增殖的抑制作用也越來越明顯。此外，本實驗還通過流式細胞方法分析ISL對HMEC-1細胞增殖周期的影響，結(jié)果表明，在較高濃度時，ISL主要通過將細胞阻滯于S期來抑制HMEC-1細胞增殖，而在低濃度時，其主要是通過誘導(dǎo)細胞凋亡來發(fā)揮作用的。

內(nèi)皮細胞的出芽是血管生成的啟動步驟，在出芽過程中，內(nèi)皮細胞需要遷移到基膜下細胞外基質(zhì)形成管樣結(jié)構(gòu)來作為血管骨架，而HMEC-1細胞可以分泌一系列生物蛋白酶來降解細胞外基質(zhì)，幫助HMEC-1細胞順利地向細胞外基質(zhì)遷移。體內(nèi)與降解細胞外基質(zhì)有關(guān)的酶主要為基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞中都有MMPs的表達，尤其以MMP-2和MMP-9為代表的明膠酶在血管生成過程中扮演著十分重要的角色，其表達量可明顯影響HMEC-1細胞對細胞外基質(zhì)的降解能力，從而影響細胞的遷移活性和腫瘤血管生成過程。本研究發(fā)現(xiàn)，ISL可以明顯抑制HMEC-1細胞表達MMP-2和MMP-9，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴關(guān)系。同時，本研究還通過遷移實驗發(fā)現(xiàn)，HMEC-1細胞可在VEGF的誘導(dǎo)下發(fā)生自發(fā)性遷移，促進血管生成過程，而ISL可明顯降低HMEC-1細胞的自發(fā)性遷移。以上研究說明ISL不僅可以直接抑制HMEC-1細胞的遷移，而且還通過抑制HMEC-1細胞對MMP-2和MMP-9的表達而影響HMEC-1細胞的遷移活性。

腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和浸潤生長都有體內(nèi)ROS的參與和調(diào)節(jié)，同時，腫瘤血管生成也與體內(nèi)ROS的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。許多體內(nèi)外實驗表明［14－15］，ROS能夠在血管生成過程發(fā)揮明顯的刺激作用，但是其作用的具體機制目前仍然沒有被完全闡明。大多數(shù)學(xué)者認為，NADPH氧化酶作用產(chǎn)生的ROS可以刺激黏附分子、細胞因子以及MMPs的表達，而ROS對血管生成的影響可能是通過ROS刺激MMPs的活性，以及刺激產(chǎn)生一些可以促進基膜降解和內(nèi)皮細胞遷移的血管生成整聯(lián)蛋白而發(fā)揮作用的。除此之外，ROS可增強與血管生成過程密切相關(guān)的細胞因子的作用，如VEGF、FGF等，從而加強內(nèi)皮細胞增殖和管樣結(jié)構(gòu)形成能力，促進血管生成過程的順利進行。本實驗表明，ISL可明顯抑制HMEC-1細胞由VEGF誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS量，且具有明顯的濃度依賴關(guān)系，說明ISL可通過干擾細胞內(nèi)ROS生成來抑制腫瘤的血管新生。

本實驗還通過雞胚絨毛尿囊膜探討了ISL的體內(nèi)抗血管生成活性，結(jié)果顯示，隨著ISL劑量的不斷增加，尿囊膜新生毛細血管也相應(yīng)減少，說明ISL在體內(nèi)抗血管生成方面具有很大的潛力，但其具體量效關(guān)系還有待進一步實驗加以證明。

本研究的創(chuàng)新點在于首次將ISL的抗腫瘤活性同人微血管內(nèi)皮細胞血管生成過程相結(jié)合，深入探討了ISL對血管生成過程中VEGF介導(dǎo)的血管新生的抑制作用，為證實其抗腫瘤活性提供了可靠的實驗依據(jù)。

綜上所述，ISL是一種新的腫瘤血管生成抑制劑，其抗腫瘤作用是一個綜合效應(yīng)。雖然目前對ISL抗腫瘤活性已經(jīng)有了初步的認識，但如何將其開發(fā)成可用于臨床的抗腫瘤藥物及其臨床應(yīng)用的實用價值，仍需進一步研究進行探討。

（致謝：本實驗是在西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物室黃雙盛教授幫助下完成，感謝蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心的大力幫助。）

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Antitumor activities and mechanisms of isoliquiritigenin

WANG Zhi-qiang1，2，ZHANG Xiu-ying3*，LI Wen-guang1*，HUANG Shuang-sheng4，LIU Yuan-yuan1，HU La-mei1，HOU Cui-lan1，ZHANG Xiao-yu1
（1．School of Basic Medicine，Lanzhou University；2．Reproductive Medical Center of Gansu Provincial Maternal and Child-care Hopital；3．Dept of Emergency，Gansu Provincial Hospital；4．Medical College，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730000，China）

Abstract：Aim To investigate the effects of isoliquiri-tigenin（ISL）on anti-angiogenesis both in vitro and in vivo and its mechanisms．Methods We assessed the antiangiogenic activities of ISL on proliferation viabili-ty，migration and tube formation of human microvascu-lar endothelial cell line-1（HMEC-1）in vitro．The cell proliferation viability was assessed using the Sulforho-damine B（SRB）assay．Modified Boyden Transwell chamber assay was done to study the effect of ISL on HMEC-1 cells migration．2′，7′-dichlorofluorescein di-acetate（DCFH-DA）was used to measure the levels of intracellular reactive oxygen species（ROS），which was induced by VEGF．Metalloproteinase-2（MMP-2） and metalloproteinase-9（MMP-9）expressions by HMEC-1 cells were assessed through gelatin zymogra-phy assay．HMEC-1 cells cycle was detected by flow cytometry．Moreover，we investigated the in vivo anti-angiogenic activity of ISL on chicken embryos nap al-lantoic membrane model（CAM）．Results ISL con-centration-dependently inhibited the growth of HMEC-1 cells as well as SW620 and A549 cells．ISL signifi-cantly and concentration-dependently suppressed the migration activity of HMEC-1 cells．Tube sample struc-ture formation further confirmed the effect of ISL on an-ti-angiogenesis．Moreover，ISL also inhibited intracel-lular ROS level，MMP-2 and MMP-9 expression bybook=1165,ebook=134HMEC-1 cells．ISL induced endothelial cell apoptosis at a low concentration（ISL 12．5 μmol·L－1）and blocked the cells in S phase of mitosis at higher con-centrations（ISL 25～100 μmol·L－1）．Furthermore，ISL distinctly inhibited the angiogenesis of chick em-bryos in vivo．Conclusions ISL has anti-tumor and angiogenesis effects on HMEC-1 cells．The mechanism may be related to intracellular ROS scavenging and ap-optosis induction of HMEC-1 cells．

Key words：isoliquiritignin（ISL）；antitumor；angio-genesis；HMEC-1 cells；vascular endothelial growth factor（VEGF）；apoptosis

作者簡介：王志強（1986－），男，碩士生，研究方向：細胞生理學(xué)、生殖醫(yī)學(xué)，E-mail：babaral＿w＠163．com；*與第一作者對本文有同等貢獻張小郁（1966－），女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：細胞生理學(xué)、腫瘤藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：zhangxyu＠lzu．edu．cn

基金項目：甘肅省自然科學(xué)研究基金計劃項目（No 1208RJZA231）

收稿日期：2015－04－13，修回日期：2015－05－16

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1159－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．026