許凡凡,賀　丹,孫曉紅,3,王　麗，高　嵩,盛　輝*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 呼吸科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，吉林大學(xué)真菌研究中心·

教育部人獸共患病重點實驗室，吉林 長春130021；3.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林132013)

白假絲酵母熒光定量PCR鑒定方法的建立

許凡凡1,賀丹2,孫曉紅2,3,王麗2，高嵩2,盛輝1*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 呼吸科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，吉林大學(xué)真菌研究中心·

教育部人獸共患病重點實驗室，吉林 長春130021；3.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林132013)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0528)

近年來，免疫功能低下人群增多，導(dǎo)致真菌感染的發(fā)生率不斷增高，感染的病原菌種類不斷增多，且該病缺乏特異的癥狀和體征，使得早期診斷困難。由于臨床上抗真菌藥物種類較少、毒副作用大，且真菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，導(dǎo)致該病的治療困難、死亡率高[1-5]。因此，建立主要病原真菌快速、敏感、特異的鑒定診斷方法，對于感染的早期診斷和及時有效治療至關(guān)重要。

目前，吉林省真菌感染的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，白假絲酵母仍是感染率最高的病原菌，多分離自呼吸科患者，且痰標(biāo)本分離率最高[6,7]。為了能快速、特異性鑒定該菌，本研究以線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ(mitochondrial cytochrome C oxidase subunitⅡ，COⅡ)基因為靶標(biāo)設(shè)計了種特異性引物，建立了熒光定量PCR檢測方法，分析了該方法的靈敏度、特異性及重復(fù)性，為臨床白假絲酵母感染的早期診治及核酸快速檢測試劑盒的研發(fā)奠定了實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　實驗菌株

實驗菌株共9屬、16種、20株，包括白假絲酵母5株，光滑假絲酵母、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、克柔假絲酵母、煙曲霉、黃曲霉、黒曲霉、土曲霉、茄病鐮刀菌、產(chǎn)黃青霉、淡紫擬青霉、枝頂孢霉、紅色毛癬菌、申克孢子絲菌及卷枝毛霉各1株。由吉林大學(xué)真菌研究中心菌種保藏中心(Culture Collection of Jilin University Mycology Research Center，JLCC)提供。

1.2　主要試劑和儀器

Gene TLETM酵母菌DNA提取試劑盒、Taq PCR擴(kuò)增試劑盒、SYBR○RPremix Ex TaqTMKit、pMD 18-T Vector、X-Gal、IPTG購于大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，引物合成和序列測定由大連寶生物工程有限公司完成。應(yīng)用的主要儀器有熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra)、凝膠成像分析儀、(美國KoDaK)、核酸蛋白分析儀(日本Hitachi)。

1.3　引物設(shè)計

檢索GenBank中的真菌線粒體COⅡ基因序列，包括白假絲酵母、光滑假絲酵母、近平滑假絲酵母、黑曲霉、馬內(nèi)菲青霉、巴西白僵菌、紅色毛癬菌、絮狀表皮癬菌及尖孢鐮刀菌等7種酵母菌和8種絲狀真菌，利用生物信息學(xué)分析選擇白假絲酵母特異位點，設(shè)計該菌Real-time PCR特異引物f COⅡ1和r COⅡ2。

1.4　熒光定量PCR擴(kuò)增

利用Gene TLETM酵母菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA用于PCR擴(kuò)增[8]。熒光定量PCR擴(kuò)增體系為25 μl，包括12.5 μl 2×SYBR Premix ExTaq、0.5 μl 10 μmol/L f COⅡ1、0.5 μl 10 μmol/L r COⅡ2及1 μl模板DNA。擴(kuò)增條件為95℃ 30 s后，95℃ 5 s、60℃ 10 s、72℃ 30 s 共40個循環(huán)，最后72℃收集熒光信號，建立熒光定量PCR特異性檢測方法。

1.5　標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和靈敏度檢測

參照文獻(xiàn)構(gòu)建重組質(zhì)粒[9]，選取陽性克隆抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為25 μl，包括2.5 μl 10×buffer、1.0 μl dNTP、1.0 μl 10 μmol/L f COⅡ1、1.0 μl 10 μmol/L r COⅡ2、1.0 μl rTaq酶及1.0 μl模板DNA。擴(kuò)增條件為94 ℃ 預(yù)變性2 min后，94 ℃變性30 s、60℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將測序正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測其質(zhì)粒DNA濃度為307 ng/μl(拷貝數(shù)為9.67×1010copies/μl)，進(jìn)行倍比稀釋，濃度依次為1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μl。以不同濃度的質(zhì)粒作為模板DNA，進(jìn)行熒光定量PCR，確定COⅡ基因引物的檢測限，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6　特異性和重復(fù)性檢測

利用建立的熒光定量PCR體系擴(kuò)增白假絲酵母、光滑假絲酵母、煙曲霉、茄病鐮刀菌、卷枝毛霉等20株實驗菌株DNA，驗證COⅡ基因引物的特異性。

選取濃度分別為1×106、1×105、1×103copies/μl的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度3個平行樣本，實施3次熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)Ct平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，驗證建立檢測方法的重復(fù)性。

2結(jié)果

2.1　標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度檢測結(jié)果

對不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實施熒光定量PCR，結(jié)果顯示當(dāng)濃度低于1×102copies/μl時不能出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。表明該體系檢測靈敏度為1×102copies/μl(對應(yīng)DNA 濃度為3.17×10-7ng/μl)。且質(zhì)粒濃度介于1×106～1×102copies/μl時，與Ct值具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=-2.882 5x+22.142 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5(圖1)。

2.2　特異性驗證結(jié)果

對9屬、16種、20株實驗菌株進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果表明僅白假絲酵母可獲得擴(kuò)增曲線，其他種、屬真菌均未見擴(kuò)增。且熔解曲線在85.7℃具有單一峰，無引物二聚體等非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，表明設(shè)計的白假絲酵母COⅡ基因引物具有較好的特異性(圖2)。

1～5：質(zhì)粒濃度依次為1×106、1×105、1×104、1×103、1×102copies/μL

圖1白假絲酵母標(biāo)準(zhǔn)品的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

1：白假絲酵母JLCC31956；2：白假絲酵母JLCC31963；3：白假絲酵母JLCC33787；4：白假絲酵母JLCC33799；5：白假絲酵母JLCC33806

圖2白假絲酵母的熒光定量PCR特異性擴(kuò)增曲線

2.3　重復(fù)性檢測結(jié)果

熒光定量PCR重復(fù)性檢測結(jié)果顯示，單一濃度的3個平行樣本的Ct值接近(圖3)，不同濃度的3個平行樣本的變異系數(shù)分別為1.49 %、1.33%、0.99%(表1)，不同濃度的3次實驗的變異系數(shù)分別為2.07%、1.48 %、1.80%(表2)，均小于3%，表明建立的方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1～3:質(zhì)粒濃度分別為1×106、1×105、1×103copies/μL

質(zhì)粒濃度(copies/μl)Ct值樣本1樣本2樣本3平均值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)(%)10610510313.67416.87422.32413.38016.43922.76413.76816.58222.48013.60716.63222.5230.2020.2220.2231.491.330.99

表2　不同濃度白假絲酵母的3次熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

3討論

近年來，由于抗生素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，移植、介入等診治技術(shù)的開展，艾滋病、惡性腫瘤等疾病增多，導(dǎo)致免疫功能低下人群不斷增加，真菌感染的發(fā)生率日益升高，且臨床診治困難，死亡率較高[1-5]。有研究表明假絲酵母已成為院內(nèi)血行感染的第四大病原菌，其中白假絲酵母是最常見的病原菌[2,10,11]。

目前，用于檢測病原真菌的方法主要是培養(yǎng)法，但該方法主觀性較強(qiáng)，且需要時間較長。研究者將目光集中于非培養(yǎng)法，包括血清學(xué)、代謝組學(xué)、組織病理學(xué)等方法。但這些方法存在取材困難、交叉反應(yīng)、易受環(huán)境影響等問題[12-14]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，因其在鑒定病原菌方面具有快速、靈敏、特異性高等優(yōu)點，已廣泛被應(yīng)用于臨床感染的診斷中。實時定量PCR技術(shù)敏感性和特異性強(qiáng)、自動化程度高，有效解決了PCR技術(shù)中的污染問題，且實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，已被用于細(xì)菌、真菌及病毒的檢測中[15-17]。

在微生物鑒定、分類的分子生物學(xué)方法研究中，靶基因的選擇至關(guān)重要。由于真菌線粒體DNA具有獨立復(fù)制的能力，嚴(yán)格的遵循母系遺傳，為多拷貝。線粒體DNA變異較迅速，且不同區(qū)段進(jìn)化速率不同，適于屬、種不同水平的鑒定。

線粒體COⅡ基因在昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育研究中，已成為首選的分子標(biāo)記，可用于昆蟲屬、種及種以下水平的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究。亦有研究者嘗試將其用于酵母型真菌的系統(tǒng)發(fā)育研究。Belloch C等人利用COⅡ基因研究克魯維酵母(Kluyveromyces)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該基因可代替rDNA序列，能夠較好地推斷酵母菌的譜系關(guān)系[18]。Young-Joon C等人利用ITS和COⅡ基因序列，研究了來自不同宿主的白銹菌(Albugo candida)的系統(tǒng)發(fā)育，表明兩者均可很好的反映種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[19]。目前，利用COⅡ基因進(jìn)行曲霉鑒定、分類及系統(tǒng)發(fā)育分析的研究尚未見報道。

本研究，基于真菌線粒體COⅡ基因序列，設(shè)計了白假絲酵母的特異性引物，建立了熒光定量PCR鑒定體系，對其靈敏度、特異性及重復(fù)性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示該體系檢測的靈敏度可達(dá)1×102copies/μl(相當(dāng)于10-7ng/μl)，與利用SYBRGreen I染料進(jìn)行熒光定量PCR檢測的靈敏度(0.1 fg，相當(dāng)于10-7ng/μl)基本一致[20]。熔解曲線顯示反應(yīng)具有單一峰，且僅有白假絲酵母出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他種、屬真菌均未見擴(kuò)增，表明所設(shè)計的引物具有較高的特異性，適合該菌種的特異性鑒定。重復(fù)性驗證實驗結(jié)果表明，建立的檢測方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。上述結(jié)果表明建立的基于真菌線粒體COⅡ基因鑒定白假絲酵母的熒光定量PCR方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性和穩(wěn)定性好的特點，適于臨床真菌感染微量標(biāo)本的快速檢測。該研究為真菌感染的早期診治和真菌核酸快速檢測試劑盒的開發(fā)奠定了實驗基礎(chǔ)。

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摘要：目的真菌感染發(fā)病率和死亡率逐年增高，亟需建立主要病原真菌快速、敏感、特異的鑒定方法，對感染的早期診治至關(guān)重要。方法以真菌線粒體COⅡ基因為靶標(biāo)，設(shè)計白假絲酵母的特異性引物，建立熒光定量PCR鑒定方法，分析其靈敏度、特異性及重復(fù)性。結(jié)果該方法檢測的靈敏度可達(dá)1×102copies/μl(相當(dāng)于10-7ng/μl)，熔解曲線顯示具有單一峰，且僅有白假絲酵母出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他種、屬真菌均未見擴(kuò)增。且具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。結(jié)論建立的白假絲酵母熒光定量PCR鑒定方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，適于臨床真菌感染微量標(biāo)本的快速檢測。該研究為真菌核酸快速檢測試劑盒的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：白假絲酵母；熒光定量PCR；鑒定；COⅡ基因

Establish a real-time PCR method to rapid identify Candida albicansXUFan-fan,HEDan,SUNXiao-hong,etal.(DepartmentofRespiratory,FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveThe morbidity and mortality of fungal infections increased these years.It is necessary to establish a rapid,sensitive and specific identification method which is essential for early diagnosis and treatment of the infections.MethodsSpecific primers of Candida albicans were designed according to the sequences of fungal mitochondrial COⅡ gene.And a real-time PCR method was established to identify Candida albicans.The sensitivity,specificity and repeatability of this identification method were analyzed.ResultsSensitivity of the method was up to 1×102copies/μl (equivalent 10-7ng/μl).There was a single peak of dissociation curve.Only Candida albicans was amplified,other genus and speciesof fungi were not amplified.The method had good repeatability and stability.ConclusionThe established real-time PCR method of Candida albicans has higher sensitivity and specificity,good repeatability and stability,which is suitable for rapid diagnosis with trace specimens of fungal infections in clinic.This study will lay the foundation for the development of rapid diagnostic kit of fungi.

Key words:Candida albicans; real-time PCR; identification; COⅡ gene

收稿日期：(2014-03-20)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R379

文章編號：1007-4287(2015)04-0528-04

通訊作者*

基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃項目(20110453，20130522014JH)