?
CLIC4-RNAi對 H2O2誘導的U251損傷細胞中線粒體膜電勢的影響
袁兆新1, 許禎杰2,張艷3*
(1.長春醫(yī)學高等專科學校,吉林 長春130031;2.日照市人民醫(yī)院;3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院)
作為細胞內(nèi)氯通道家族成員之一的細胞內(nèi)氯通道4(CLIC4) 也稱之線粒體細胞內(nèi)氯通道(mtCLIC),是細胞內(nèi)氯通道家族中唯一在線粒體上表達的氯通道[1],最近大量研究表明CLIC4也參與了細胞凋亡過程[2,3]。本實驗通過過氧化氫(H2O2)復制神經(jīng)膠質(zhì)瘤(U251)細胞損傷模型,檢測線粒體膜電勢的改變,探討CLIC4-RNAi對H2O2誘導的U251損傷細胞的線粒體膜電勢的影響及其相關機制。
1材料與方法
pSilencerTM 3.1-H1 neo siRNA載體購自Ambion公司(美國)。
人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U251,接種于含10%胎牛血清的DMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
收集細胞PBS洗兩遍,轉(zhuǎn)入EP管中棄上清,按試劑盒流程提取。
取線粒體顆粒懸液,取Rhodamine 123,4℃離心棄上清,線粒體懸液上流式細胞儀檢測,計算平均熒光強度。
2結(jié)果
線粒體懸液上流式細胞儀,檢測RNAi-CLIC4組與RNAi-Scramble組細胞線粒體膜電勢,計算熒光強度,結(jié)果如圖1所示。
A.Uninfected ;B.RNAi-Scramble C.RNAi-CLIC4
見表1。與Uninfected組以及RNAi-Scramble組細胞相比,RNAi-CLIC4組在不同H2O2濃度誘導的細胞線粒體膜電勢明顯降低(P<0.05)。
表1 H2O2誘導的U251損傷細胞中線粒體膜電勢比較
#P<0.05 vs RNAi-Scramble;*P<0.05 vs Uninfected
3討論
相關研究已經(jīng)證明CLIC4在H2O2誘導的細胞損傷中表達明顯增高,與細胞的損傷明顯相關[4]。在成功構(gòu)建高效CLIC4-RNAi模型基礎上[5],本試驗中探討了下調(diào)CLIC4表達之后對H2O2誘導的U251細胞損傷過程中的線粒體膜電勢產(chǎn)生的影響。在細胞正常生理情況下,細胞內(nèi)氯通道4對線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、離子平衡具有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。本研究結(jié)果表明,RNAi-CLIC4組細胞在不同劑量的H2O2誘導的損傷細胞中線粒體膜電勢發(fā)生改變,出現(xiàn)顯著下降,這說明線粒體膜電勢在這一過程中對CLIC4的變化十分敏感,有可能啟動或促進細胞的線粒體損傷過程,而由于線粒體膜電勢的喪失對線粒體PT孔開放、CytC釋放、線粒體內(nèi)pH值改變等過程中發(fā)揮重要作用,相關作用機制將在后續(xù)研究中進一步探討。
參考文獻:
[1]Duan D,Winter C,Cowley S,et al.Molecular identification of a volume-regulated chloride channel[J].Nature,1997,390 (6658):417.
[2]Suh KS,Mutoh M,Nagashima K et al.The organellular chloride channel protein CLIC4/mtCLIC translocates to the nucleus in response to cellular stress and accelerates apoptosis [J].J Biol Chem,2004,279(6):4632.
[3]Xue L,Borutaite V,Tolkovsky AM.Inhibition of mitochondrial permeability transition and release of cytochrome c by anti-apoptotic nucleoside analogues [J].Biochem Pharmacol,2002,64(3):441.
[4]孔曉霞,張宏宇,孫連坤.內(nèi)毒素對過氧化氫引起的神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞損傷的影響[J].吉林大學學報(醫(yī)學版)[J].2009,35(1):17.
[5]袁兆新,康勁松,孔曉霞.細胞內(nèi)氯通道4基因siRNA表達載體的構(gòu)建及其沉默效應[J].中國實驗診斷學[J].2009,13(2):146.
[6]Yu SP,Lorella MT Canzoniero ,Dennis W Choi.Ion homeostasis and apoptosis[J].Current Opinionin cell Biology,2001,13(4):405.
(收稿日期:2014-06-16)
*通訊作者
文章編號:1007-4287(2015)07-1060-02