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CLIC4-RNAi對 H2O2誘導的U251損傷細胞中線粒體膜電勢的影響

袁兆新1， 許禎杰2，張艷3*

(1.長春醫(yī)學高等專科學校，吉林 長春130031；2.日照市人民醫(yī)院;3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院)

作為細胞內(nèi)氯通道家族成員之一的細胞內(nèi)氯通道4(CLIC4) 也稱之線粒體細胞內(nèi)氯通道(mtCLIC)，是細胞內(nèi)氯通道家族中唯一在線粒體上表達的氯通道[1]，最近大量研究表明CLIC4也參與了細胞凋亡過程[2，3]。本實驗通過過氧化氫(H2O2)復制神經(jīng)膠質(zhì)瘤(U251)細胞損傷模型，檢測線粒體膜電勢的改變，探討CLIC4-RNAi對H2O2誘導的U251損傷細胞的線粒體膜電勢的影響及其相關機制。

1材料與方法

1.1　材料

pSilencerTM 3.1-H1 neo siRNA載體購自Ambion公司(美國)。

1.2　細胞培養(yǎng)

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U251，接種于含10%胎牛血清的DMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.3　細胞線粒體提取

收集細胞PBS洗兩遍，轉(zhuǎn)入EP管中棄上清，按試劑盒流程提取。

1.4　Rhodamine123法檢測線粒體膜電勢

取線粒體顆粒懸液，取Rhodamine 123，4℃離心棄上清，線粒體懸液上流式細胞儀檢測，計算平均熒光強度。

1.5　統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1　Rhodamine123法流式細胞儀檢測線粒體膜電勢

線粒體懸液上流式細胞儀，檢測RNAi-CLIC4組與RNAi-Scramble組細胞線粒體膜電勢，計算熒光強度，結(jié)果如圖1所示。

A.Uninfected ;B.RNAi-Scramble C.RNAi-CLIC4

2.2　H2O2誘導的U251損傷細胞中線粒體膜電勢比較分析

見表1。與Uninfected組以及RNAi-Scramble組細胞相比，RNAi-CLIC4組在不同H2O2濃度誘導的細胞線粒體膜電勢明顯降低(P<0.05)。

表1　H2O2誘導的U251損傷細胞中線粒體膜電勢比較

#P<0.05 vs RNAi-Scramble;*P<0.05 vs Uninfected

3討論

相關研究已經(jīng)證明CLIC4在H2O2誘導的細胞損傷中表達明顯增高，與細胞的損傷明顯相關[4]。在成功構(gòu)建高效CLIC4-RNAi模型基礎上[5]，本試驗中探討了下調(diào)CLIC4表達之后對H2O2誘導的U251細胞損傷過程中的線粒體膜電勢產(chǎn)生的影響。在細胞正常生理情況下，細胞內(nèi)氯通道4對線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、離子平衡具有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。本研究結(jié)果表明，RNAi-CLIC4組細胞在不同劑量的H2O2誘導的損傷細胞中線粒體膜電勢發(fā)生改變，出現(xiàn)顯著下降，這說明線粒體膜電勢在這一過程中對CLIC4的變化十分敏感，有可能啟動或促進細胞的線粒體損傷過程，而由于線粒體膜電勢的喪失對線粒體PT孔開放、CytC釋放、線粒體內(nèi)pH值改變等過程中發(fā)揮重要作用，相關作用機制將在后續(xù)研究中進一步探討。

參考文獻：

[1]Duan D,Winter C,Cowley S,et al.Molecular identification of a volume-regulated chloride channel[J].Nature,1997,390 (6658):417.

[2]Suh KS,Mutoh M,Nagashima K et al.The organellular chloride channel protein CLIC4/mtCLIC translocates to the nucleus in response to cellular stress and accelerates apoptosis [J].J Biol Chem,2004,279(6):4632.

[3]Xue L,Borutaite V,Tolkovsky AM.Inhibition of mitochondrial permeability transition and release of cytochrome c by anti-apoptotic nucleoside analogues [J].Biochem Pharmacol,2002,64(3):441.

[4]孔曉霞，張宏宇，孫連坤.內(nèi)毒素對過氧化氫引起的神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞損傷的影響[J].吉林大學學報(醫(yī)學版)[J].2009,35(1)：17.

[5]袁兆新，康勁松，孔曉霞.細胞內(nèi)氯通道4基因siRNA表達載體的構(gòu)建及其沉默效應[J].中國實驗診斷學[J].2009，13(2):146.

[6]Yu SP,Lorella MT Canzoniero ,Dennis W Choi.Ion homeostasis and apoptosis[J].Current Opinionin cell Biology,2001,13(4):405.

(收稿日期：2014-06-16)

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2015)07-1060-02