李純佳，徐超華，姚麗，覃偉，吳轉(zhuǎn)娣，劉家勇

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開(kāi)遠(yuǎn)661699）

甘蔗胚性愈傷高效誘導(dǎo)系列研究I.幼葉離體培養(yǎng)直接誘導(dǎo)胚性愈傷發(fā)生

李純佳，徐超華，姚麗，覃偉，吳轉(zhuǎn)娣，劉家勇

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開(kāi)遠(yuǎn)661699）

以ROC22心葉為外植體，研究了取材部位、培養(yǎng)基蔗糖含量等因素對(duì)甘蔗胚性愈傷發(fā)生的影響，重點(diǎn)探討了不同植物激素和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的作用，建立了無(wú)需繼代、直接誘導(dǎo)高質(zhì)量甘蔗胚性愈傷發(fā)生的體系。結(jié)果表明：頂端生長(zhǎng)點(diǎn)以上5～6 cm區(qū)段最內(nèi)層3片心葉為最適外植體；MS+2，4-D 3.0 mg/L+ Dicamba 1.0 mg/L+6-BA 0.1mg/L+DA-6 6.0 mg/L+CSN 4.0mg/L+蔗糖40 g/L為最佳培養(yǎng)基；經(jīng)28 d暗培養(yǎng)，心葉無(wú)需繼代即可分化成為胚性愈傷，誘導(dǎo)率可達(dá)42.67%。所得胚性愈傷質(zhì)量高、分化強(qiáng)，可用于甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化研究。

甘蔗；胚性愈傷；無(wú)繼代誘導(dǎo)；植物激素；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

甘蔗（Saccharum officinarum L.）為禾本科甘蔗屬經(jīng)濟(jì)作物，是我國(guó)重要的生物能源材料和最主要的食糖來(lái)源[1]。新良種的選育是甘蔗產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的雜交育種對(duì)甘蔗遺傳改良貢獻(xiàn)良多，但受到物種自身染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜和品種遺傳基礎(chǔ)薄弱[1]等因素限制，傳統(tǒng)方法越來(lái)越難以創(chuàng)造出新的優(yōu)良品種。植物基因工程技術(shù)的發(fā)展為甘蔗品種改良提供了新的途徑。各國(guó)甘蔗育種家成功運(yùn)用分子育種技術(shù)創(chuàng)制了一批具有高糖[2]、抗蟲(chóng)[3]、抗病[4]、耐旱[5]等優(yōu)良性狀的基因工程材料，一些材料已形成品種并投入生產(chǎn)[6-7]。

甘蔗轉(zhuǎn)基因以基因槍轟擊法為主，農(nóng)桿菌侵染法為輔[8]，胚性愈傷誘導(dǎo)均為其必要的前置技術(shù)環(huán)節(jié)。作為外源基因的直接受體，胚性愈傷誘導(dǎo)質(zhì)量直接影響最終轉(zhuǎn)化率的高低，誘導(dǎo)時(shí)間則在很大程度上決定了整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期的長(zhǎng)短。因此，胚性愈傷誘導(dǎo)體系是甘蔗轉(zhuǎn)基因的重要基礎(chǔ)。自1979年曾吉恕[9]報(bào)道了國(guó)內(nèi)首例甘蔗組培體胚發(fā)生以來(lái)，我國(guó)研究者以不同基因型的商業(yè)種為材料，進(jìn)行了大量甘蔗胚性愈傷誘導(dǎo)工作[10]。這些工作大多強(qiáng)調(diào)愈傷增殖與分化，顯然更適用于蔗苗快繁。與組培育苗相比，轉(zhuǎn)基因有著不同的側(cè)重點(diǎn)和目的，對(duì)胚性愈傷判斷標(biāo)準(zhǔn)、誘導(dǎo)質(zhì)量、選擇時(shí)期要求也更為嚴(yán)苛[11]，因此不宜簡(jiǎn)單套用育苗體系，而必須做出相應(yīng)調(diào)整。無(wú)論是轉(zhuǎn)基因育種還是組培快繁的誘導(dǎo)體系，甘蔗胚性愈傷往往需要經(jīng)過(guò)多次繼代才能獲得[8，11]。這一過(guò)程不但耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)工多，而且增加污染風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于轉(zhuǎn)基因而言，更容易使愈傷表面胚性細(xì)胞團(tuán)在繼代培養(yǎng)中發(fā)育為成熟胚狀體，從而增加轉(zhuǎn)基因嵌合體的發(fā)生[12]。

本研究中，我們借鑒前人工作經(jīng)驗(yàn)，以當(dāng)前主栽品種ROC22為材料，使用幾種較為新穎的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，建立了特別適合遺傳轉(zhuǎn)化的甘蔗心葉外植體直接誘導(dǎo)胚性愈傷發(fā)生體系，以期為甘蔗生物育種提供便利，同時(shí)為甘蔗工廠化育苗、生物反應(yīng)器等其他需要胚性愈傷參與的研究提供一定參考。

1 材料與方法

材料為ROC22的無(wú)性系，種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所第一科研基地。取供試植株頂端肥厚帶以上葉鞘，以75%酒精擦拭消毒后于超凈工作臺(tái)內(nèi)剝?nèi)∽顑?nèi)層3片心葉。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加8.0 g/L卡拉膠，高壓滅菌前以1.0 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)至pH 5.8。所用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)包括：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、莠去津（Dicamba）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、激動(dòng)素（KT）、氯吡苯脲（CPPU）、胺鮮脂（DA-6）、復(fù)硝酚鈉（CSN），其配比與蔗糖用量見(jiàn)表2～5。心葉切成0.5 cm見(jiàn)方，葉背向上平鋪于培養(yǎng)基上，每處理4皿，每皿接種25塊，重復(fù)3次。愈傷誘導(dǎo)在黑暗的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，溫度設(shè)定為28±0.5℃。培養(yǎng)時(shí)間為40 d，接種后每4 d觀察1次。

參照文獻(xiàn)[8]和[10]，以顏色淡黃、質(zhì)地緊實(shí)致密、表面光滑且具有隆突的愈傷為胚性愈傷。褐化率為發(fā)生褐化的外植體占接種外植體總數(shù)的百分比；胚性愈傷誘導(dǎo)率為胚性愈傷愈傷塊數(shù)與接種外植體總數(shù)的百分比值，取40 d中出現(xiàn)的最高值；胚性愈傷形成時(shí)間為最高胚性愈傷誘導(dǎo)率首次出現(xiàn)的天數(shù)。

2 結(jié)果與分析

表1 不同部位外植體誘導(dǎo)愈傷的差異

2.1 甘蔗不同部位外植體愈傷誘導(dǎo)差異

ROC22頂端生長(zhǎng)點(diǎn)以上5～8 cm范圍內(nèi)，心葉不同部位外植體的愈傷誘導(dǎo)情況存在差異（表1）。5～6 cm段表現(xiàn)最佳，在本試驗(yàn)中未見(jiàn)污染，褐化率0.33%亦為本試驗(yàn)中最低水平，其愈傷發(fā)生率達(dá)最高的96.00%；其次是6～7 cm段，此段外植體同樣未見(jiàn)污染，其褐化率也較低，為8.33%，其愈傷發(fā)生率也高達(dá)89.67%；7～8 cm段三項(xiàng)數(shù)據(jù)均為最差，其污染率高達(dá)9.33%，褐化率達(dá)15.67%，愈傷發(fā)生率僅有72.67%。由此可見(jiàn)，心葉不同部位在離體培養(yǎng)中具有不同表現(xiàn)，頂端生長(zhǎng)點(diǎn)以上5～6 cm段是外植體的最佳選擇。

2.2 外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)甘蔗心葉胚性愈傷發(fā)生的影響

2.2.1 2，4-D和Dicamba及其配比的影響前人研究[13-15]表明，甘蔗心葉胚性愈傷誘導(dǎo)中2，4-D等生長(zhǎng)素用量不宜超過(guò)4.0 mg/L。表2顯示了這一總劑量下，2，4-D和Dicamba間不同配比誘導(dǎo)外植體胚性愈傷發(fā)生的情況。5個(gè)組合均成功誘導(dǎo)了心葉外植體的胚性愈傷發(fā)生，說(shuō)明甘蔗心葉外植體具有直接形成胚性愈傷組織的能力，但發(fā)生率低下，難以滿足實(shí)際應(yīng)用需求。

本試驗(yàn)中，2，4-D和Dicamba搭配使用時(shí)褐化率較低、胚性愈傷發(fā)生率相對(duì)較高，效果優(yōu)于各自單獨(dú)使用，這提示了激素配合對(duì)甘蔗心葉胚性愈傷誘導(dǎo)具有一定協(xié)同作用。

2.2.2 細(xì)胞分裂素（CTK）的影響在只含有6-BA、KT、CPPU等CTK的MS培養(yǎng)基上，外植體褐化嚴(yán)重，愈傷體積膨大，質(zhì)地松散，呈膠狀或水漬狀，質(zhì)量較差，說(shuō)明只使用CTK難以誘導(dǎo)出胚性愈傷。與2，4-D、Dicamba配合使用時(shí)，CTK對(duì)ROC22心葉胚性愈傷誘導(dǎo)影響巨大，如表3所示。

與對(duì)照（B-1）相比，含有CTK的培養(yǎng)基上外植體褐化率顯著提高。KT褐化率較低（12.67%～17.33%），6-BA居中（16.67%～36.00%），CPPU最高（34.33%～65.33%）。這一排序與三者的生物活性一致。同時(shí)，各CTK引起的外植體褐化又隨使用濃度的提高而加劇，0.1 mg/L KT最低，為12.67%，而0.5 mg/L CPPU最高，高達(dá)65.33%。

表2 2,4-D和Di c amba不同配比誘導(dǎo)外植體胚性愈傷發(fā)生

表3 細(xì)胞分裂素對(duì)甘蔗心葉胚性愈傷誘導(dǎo)的影響

表4 DA-6對(duì)甘蔗心葉胚性愈傷誘導(dǎo)的影響

3個(gè)濃度水平下，CPPU僅在用量為0.1 mg/L時(shí)顯示了輕微的促進(jìn)作用，綜合表現(xiàn)較差，不宜選用。低濃度（0.1、0.2 mg/L）6-BA和高濃度（0.5 mg/ L）KT對(duì)胚性愈傷發(fā)生的促進(jìn)作用比較明顯。三者胚性愈傷發(fā)生率均為本試驗(yàn)最高的24.67%，但培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，KT耗時(shí)較長(zhǎng)，胚性愈傷易老化，甚至偶有白化小葉分化形成。綜上認(rèn)為0.1或0.2 mg/L 6-BA是較為適宜的選擇。

2.2.3 DA-6的影響在只含有DA-6的MS培養(yǎng)基上，外植體分化緩慢，愈傷發(fā)生率低，未獲得胚性愈傷，說(shuō)明DA-6不能替代外源激素，或者對(duì)外源激素的替代作用十分有限。但從表4可以看出，DA-6與外源植物激素搭配使用對(duì)甘蔗胚性愈傷發(fā)生具有很好的誘導(dǎo)效果。

未使用6-BA時(shí)，2.0～10.0mg/L的DA-6均可促進(jìn)胚性愈傷發(fā)生，同時(shí)未引起褐化加劇。6-BA加入后，DA-6正向作用濃度范圍被縮小至2.0～6.0mg/L，此時(shí)，DA-6抗外植體褐化、促胚性愈傷發(fā)生的功效隨用量升高而加強(qiáng)，并在6.0 mg/L處達(dá)到頂點(diǎn)。與0.1mg/L 6-BA合用時(shí)（C-10培養(yǎng)基），獲得了36.00%的最高胚性愈傷發(fā)生率，而褐化率僅為9.33%。繼續(xù)提高DA-6濃度并不能取得更好的效果，8.0和10.0mg/L濃度下僅取得了與對(duì)照（C-7、C-13）大致相當(dāng)或劣于對(duì)照的效果。

可見(jiàn)，DA-6在抑制外植體褐化、促進(jìn)胚性愈傷發(fā)生等兩方面具有積極作用，其作用效果隨使用濃度增加呈現(xiàn)較為一致的拐點(diǎn)效應(yīng)，不高于6.0mg/L的用量可取得較好的效果。培養(yǎng)過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn)，含有DA-6的培養(yǎng)基上，外植體分化減緩，但愈傷質(zhì)量普遍較好，這些高質(zhì)量愈傷表面陸續(xù)產(chǎn)生隆突，成為胚性愈傷，從而使胚性愈傷形成時(shí)間有所延長(zhǎng)。

表5 蔗糖濃度和CSN對(duì)甘蔗心葉胚性愈傷發(fā)生的影響

2.2.4 蔗糖濃度和CSN的影響如表5所示，蔗糖的不同濃度對(duì)外植體褐化率和胚性愈傷發(fā)生率幾乎沒(méi)有影響，但蔗糖濃度為40 g/L的培養(yǎng)基上，愈傷體積較小、質(zhì)地緊實(shí)、顏色嫩黃，質(zhì)量較高，胚性愈傷形成時(shí)間也略有縮短。

CSN對(duì)甘蔗心葉胚性愈傷誘導(dǎo)具有雙重積極作用，可在提高胚性愈傷發(fā)生率的同時(shí)大幅提高誘導(dǎo)效率。表5顯示，外植體胚性愈傷發(fā)生率隨CSN用量先升后降，并在4.0 mg/L時(shí)達(dá)到最高，為42.67%。在此濃度下，外植體分化緩慢的情況得以充分解除，大量高質(zhì)量愈傷在較短時(shí)間內(nèi)集中轉(zhuǎn)化為胚性愈傷，從而極大提前了胚性愈傷出現(xiàn)的時(shí)間。

2.3 胚性愈傷分化

按照本文標(biāo)準(zhǔn)選擇的胚性愈傷具有極強(qiáng)的分化能力，甚至可在不含任何激素的MS空白培養(yǎng)基上100%分化成苗，但添加適量CTK更有利于愈傷分化。經(jīng)約2周的光照培養(yǎng)，胚性愈傷性狀發(fā)生變化，顏色由淡黃或乳白完全變?yōu)榘咨?，胞質(zhì)濃郁，表面干濕適中且有光澤，隆突變?yōu)榇植陬w粒，進(jìn)而有綠色芽點(diǎn)分化出現(xiàn)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷表面芽點(diǎn)增多，并進(jìn)一步發(fā)育形成心形心葉；胚性愈傷分化率不斷提高，最終可達(dá)100%?？傮w而言，所得胚性愈傷分化十分容易，可不依賴外源激素而自行成苗。

3 結(jié)論與討論

甘蔗心葉離體培養(yǎng)過(guò)程中，部分高質(zhì)量的緊致愈傷表面產(chǎn)生了光滑的隆突。具有這種形態(tài)特征的愈傷分化再生能力極強(qiáng)，外源激素已不再是其分化成苗的必要條件。這是一般的愈傷組織難以企及的。澳大利亞8個(gè)主栽品種經(jīng)誘導(dǎo)均得到了這種胚性愈傷[11]，說(shuō)明這種愈傷形態(tài)特征并非ROC22獨(dú)有，而在甘蔗中普遍存在。組織學(xué)觀察[16]和遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)[8，11]結(jié)果均顯示這種愈傷適用于轉(zhuǎn)基因育種。我們認(rèn)為可以將隆突的有無(wú)作為甘蔗胚性愈傷的判別標(biāo)準(zhǔn)。

外源激素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的搭配使用提高了胚性愈傷誘導(dǎo)率，不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)間對(duì)甘蔗胚性愈傷發(fā)生具有十分明顯的協(xié)同促進(jìn)作用。這一結(jié)果與崔廣榮等在文心蘭[17-18]和蝴蝶蘭[19]組培研究中得出的細(xì)胞分裂素間具有“加性效應(yīng)”理論一致，并可作為前者的拓展與補(bǔ)充。DA-6和CSN均為新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。DA-6可平衡植物細(xì)胞體內(nèi)各激素配比[20-21]，CSN是一種植物細(xì)胞賦活劑[22-23]。二者在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用，目前僅限于誘導(dǎo)余甘子離體不定芽生根[24]。我們首次將其應(yīng)用于植物胚性愈傷誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)二者具有促進(jìn)甘蔗胚性愈傷發(fā)生、抑制外植體褐化、縮短誘導(dǎo)時(shí)間的功效。以上結(jié)果提示了多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑間互相搭配的強(qiáng)大功效，但其最優(yōu)組合尚需進(jìn)一步試驗(yàn)探尋。

綜上，我們建立了無(wú)需繼代的甘蔗胚性愈傷誘導(dǎo)體系。以ROC22頂端生長(zhǎng)點(diǎn)以上5～6 cm區(qū)段內(nèi)最內(nèi)層3片心葉為外植體，在MS+2，4-D 3.0 mg/L+Dicamba 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+DA-6 6.0 mg/L+CSN 4.0 mg/L+蔗糖40 g/L培養(yǎng)基上，經(jīng)28 d暗培養(yǎng)，外植體可不經(jīng)繼代、直接分化成為胚性愈傷，誘導(dǎo)率可達(dá)42.67%。所得胚性愈傷分化再生能力極強(qiáng)，具有在空白培養(yǎng)基上自行成苗的能力，可滿足甘蔗生物技術(shù)育種、育苗的相關(guān)需求。

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A Serial Studies on High-efficiency Induction for Sugarcane Embryonic Callus I.Vitro Direct Induction of Embryonic Callus in Sugarcane Leaf Exp lants

LIChun-jia,XU Chao-hua,YAO Li,QINWei,WU Zhuan-di,LIU Jia-yong
(Yunnan Sugarcane Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences; Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement,Kaiyuan 661699)

Direct and subculture-free induction system for high-quality embryonic callus of sugarcane was established with furled young leaves of ROC22 sectioned as explants,and effects of different parts of young leaves,sucrose content ofmedium,especially the combination of various phytohormone and growth regulators to induction rate were investigated.The results showed that longitudinal region between 5 to 6 cm above the apical meristem of inner 3 leaveswas optimal as explant;MSmedium with 2,4-D 3.0 mg/L+Dicamba 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+DA-6 6.0 mg/L+CSN 4.0mg/L+Sucrose 40 g/L was screened to be as the optimum.After treating 28 d of darkness and non-subculture,the explants could be directly inducted into embryonic callus rate up to 42.67%.Thus the embryonic callus of high quality and strong ability of regeneration from the subculture-free induction system was particularly suitable for sugarcane gene-transfer.

sugarcane;embryonic callus;subculture-free induction;phytohormone;plantgrowth regulator

S566.103

A

1007－2624（2015）01－0001－04

10.13570/j.cnki.scc.2015.01.001

2014-12-25

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗品種改良與應(yīng)用省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2014HC015）；云南甘蔗雜交花穗規(guī)模化生產(chǎn)與抗旱新品種選育及示范（2014RA059）；云南省技術(shù)創(chuàng)新人才培養(yǎng)對(duì)象（2014HB058）。

李純佳（1985-），男，湖北省十堰人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：甘蔗分子生理學(xué)，E-mail：welsper@126.com。

劉家勇（1976-），男，研究員，研究方向：甘蔗遺傳育種，E-mail：lljjyy1976@163.com。