李倩

（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

標(biāo)準(zhǔn)化無(wú)菌及支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基應(yīng)用試驗(yàn)

李倩

（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

經(jīng)靈敏度檢查合格的標(biāo)準(zhǔn)化無(wú)菌及支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基已經(jīng)在4個(gè)生物制藥公司進(jìn)行應(yīng)用實(shí)驗(yàn)并且投入使用，分批進(jìn)行抗原檢測(cè)，99.5%的培養(yǎng)基經(jīng)試驗(yàn)檢測(cè)未被污染，可以投入使用。本文圍繞這種無(wú)菌及支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基進(jìn)行研究分析，從材料和方法入手，最終進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)以及方法探討。

無(wú)菌；支原體檢驗(yàn)；培養(yǎng)基

支原體是一種常見(jiàn)于生物制品中的污染微生物，它的污染不像細(xì)菌或者真菌那樣容易被肉眼看見(jiàn)，所以在其培養(yǎng)時(shí)也很難被觀察，這樣就需要我們配置適宜的培養(yǎng)基。支原體對(duì)生長(zhǎng)條件的要求比較嚴(yán)格，比如對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的要求，對(duì)溫度，濕度，pH的要求。由于這個(gè)原因，支原體的檢驗(yàn)培養(yǎng)基一直是從事此方面工作人員難以解決的問(wèn)題，下面我們就一起來(lái)分析研究本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基檢驗(yàn)試驗(yàn)，具體情況如下:

1　材料

葡萄糖，乳蛋白水解物，25%酵母浸出物，1%L-半膚氨酸10.0mL，10%精氨酸，血清（本實(shí)驗(yàn)室采集），NaCl，KCl等鹽，PPLO肉湯粉等；本實(shí)驗(yàn)用的所有類型的水都是北京某生物制藥廠生產(chǎn)的，都是經(jīng)過(guò)國(guó)家藥品檢測(cè)而達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的水質(zhì)，其他實(shí)驗(yàn)材料也都是經(jīng)過(guò)有關(guān)部門質(zhì)量檢測(cè)的。而本實(shí)驗(yàn)的支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基在制備時(shí)，完全按照國(guó)家制定標(biāo)準(zhǔn)完成，有質(zhì)量的保障。

2　方法

2.1培養(yǎng)基的制備無(wú)菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基：需要用到的材料有硫乙醇酸鹽、酪陳瓊脂和葡萄糖蛋白陳干粉。對(duì)這些材料進(jìn)行簡(jiǎn)單的處理。將這三種材料的培養(yǎng)基分別按照9mL/支，6mL/支，7mL/支進(jìn)行封裝，之后采用高溫高壓法進(jìn)行滅菌，控制適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，準(zhǔn)備為后期試驗(yàn)所用。

支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基：主要原料有：一定量的PPLO肉湯粉和葡萄糖，25%酵母浸出液100.0mL，10%精氨酸20.0mL，10倍濃縮MEM溶液10.0mL，血清，青霉素（8萬(wàn)IU/mL）10.0mL蒸餾水。配制后調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH，使之維持弱堿性，采用適宜的方法去除雜菌的污染，然后在-20℃條件下進(jìn)行保存。所用的固體培養(yǎng)基就是在此基礎(chǔ)上加入適量的瓊脂，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)固態(tài)，但培養(yǎng)基的成分及含量基本保持不變。

2.2支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基的應(yīng)用試驗(yàn)培養(yǎng)基的配制的成功與否要看培養(yǎng)基培養(yǎng)支原體的情況以及支原體生長(zhǎng)的情況。本實(shí)驗(yàn)選用豬鼻支原體（BTS-7）進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)的方法為：將培養(yǎng)基依次稀釋10倍到10-3，10-4，10-5，一直依次遞減，再將支原體加入其中，將其置于適宜溫度下培養(yǎng)4～5d，當(dāng)其中一組試驗(yàn)的培養(yǎng)基的顏色出現(xiàn)明顯變化時(shí)停止試驗(yàn)，即為試驗(yàn)終點(diǎn)，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行后期分析。

2.3培養(yǎng)基的保存試驗(yàn)用控制變量的方法，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行保存的檢測(cè)試驗(yàn)。先取5支試管，分別加入等量且適宜的培養(yǎng)基，放入-20℃恒溫箱中保存，記為第1組；再取5支試管，加入與第1組等量的培養(yǎng)基，放入37℃的恒溫箱里保存，記為第2組。將兩組的五支試管分別保存1d，2d，3d，4d，5d。前兩組在保存規(guī)定時(shí)間后，將培養(yǎng)基與室溫溫度相同時(shí)，直接進(jìn)行上述檢測(cè)試驗(yàn)。而我們?cè)O(shè)置的第3組實(shí)驗(yàn)則是將相同量的5支試管的培養(yǎng)基先進(jìn)行-20℃保存0.5d，1d，1.5d，2臺(tái)，2.5d，再保存在37℃下相應(yīng)的天數(shù)，進(jìn)行這種冰凍-融化處理，在進(jìn)行檢測(cè)，記錄試驗(yàn)的結(jié)果。

3　結(jié)果

從支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基的試驗(yàn)中可以看出，這種配置方法的培養(yǎng)基濃度對(duì)于支原體培養(yǎng)的影響不大，先出現(xiàn)顏色變化的培養(yǎng)基也是隨機(jī)的，而對(duì)所有參加檢測(cè)的抗原，非禽源支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基抽檢樣品，其中包括疫苗，細(xì)胞培養(yǎng)上清液等，血清支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基抽檢血清樣品，他們?cè)跓o(wú)菌培養(yǎng)基檢測(cè)的結(jié)果一致。均沒(méi)有污染情況產(chǎn)生。而經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基的保存試驗(yàn)可以得出結(jié)論，從支原體的生長(zhǎng)速度可以看出，培養(yǎng)基在低溫和適度高溫，以至緩凍的條件下都可以保持較高的穩(wěn)定性，支原體活菌滴度平均達(dá)到109/mL，營(yíng)養(yǎng)條件保持良好，pH值沒(méi)有明顯變化，各個(gè)微量元素的含量無(wú)明顯變化，且批次之間沒(méi)有差異。

4　討論

將培養(yǎng)基進(jìn)行一定的改良，可以確保培養(yǎng)基的質(zhì)量，提高檢驗(yàn)工作的效率。由于支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基對(duì)于培養(yǎng)條件要求特別嚴(yán)格，所以在配制時(shí)應(yīng)注意改良方法。影響其質(zhì)量的條件因素有很多，通常情況下一般的影響因素有溫度，濕度以及培養(yǎng)時(shí)氧氣的濃度。溫度主要能夠影響支原體的存活狀況，溫度過(guò)高將使支原體無(wú)法正常正常生存繁殖，溫度過(guò)低則又會(huì)使支原體處于休眠狀態(tài)，所以控制培養(yǎng)時(shí)的溫度是十分重要的。濕度對(duì)支原體培養(yǎng)的影響也是較為顯著的，濕度強(qiáng)度會(huì)直接影響到支原體的生長(zhǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中氧氣濃度不僅會(huì)影響支原體的生長(zhǎng)速度，還可能有助于其他的雜菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致支原體的培養(yǎng)失敗。在支原體的培養(yǎng)過(guò)程中要對(duì)培養(yǎng)的溫度、濕度及氧氣濃度都要進(jìn)行嚴(yán)格的控制，只要這樣才能進(jìn)一步保證支原體培養(yǎng)的成功。

5　結(jié)語(yǔ)

本文對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化無(wú)菌及支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基應(yīng)用試驗(yàn)進(jìn)行分析研究，改進(jìn)了支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基的配制，使它的更易保存，不易被污染。長(zhǎng)期以來(lái)支原體培養(yǎng)檢驗(yàn)的培養(yǎng)基的原料質(zhì)量一直沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但通過(guò)大量的試驗(yàn)研究總結(jié)了對(duì)于配制培養(yǎng)基的配制更有利的各原材料的質(zhì)量參數(shù)配比。避免了因培養(yǎng)基質(zhì)量而帶來(lái)的各種實(shí)驗(yàn)誤差，提高了支原體檢驗(yàn)工作的準(zhǔn)確性。而且試驗(yàn)中對(duì)于培養(yǎng)基保存條件的實(shí)驗(yàn)更是進(jìn)行了深入研究，模擬了各種情況下的保存，這為支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基的儲(chǔ)存和運(yùn)輸起到了很好的作用。

［1］張瑞婷，等.獸用生物制品的支原體污染檢驗(yàn)及注意事項(xiàng)［J］.中國(guó)獸藥雜志2012，35（2）:28-30.

［2］羅玉峰，等，標(biāo)準(zhǔn)化無(wú)菌及支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基應(yīng)用試驗(yàn)［J］.中國(guó)獸藥雜志，2012，43（6）:26-29.

［3］羅玉峰，等.獸用藥品無(wú)菌檢驗(yàn)用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基的研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2011，43（4）:28-29.

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.07.017