脂肪細(xì)胞去分化過(guò)程中脂滴丟失的調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展*

李翼飛 綜述王兆杰 審校

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院骨科， 廣東 珠海 519100)

【摘要】低氧低血環(huán)境是去分化過(guò)程的起始條件也是脂肪細(xì)胞發(fā)生形態(tài)顯著改變的重要誘導(dǎo)因素。利用天花板培養(yǎng)法培養(yǎng)脂肪細(xì)胞，使其去分化成為前體脂肪細(xì)胞，此過(guò)程中最顯著的形態(tài)變化是存在于脂肪細(xì)胞胞質(zhì)中并占據(jù)脂肪細(xì)胞體積90%的脂滴的丟失，細(xì)胞由單房圓形變化為成纖維樣細(xì)胞，并獲得了多向分化潛能。本文基于去分化脂肪細(xì)胞(DA)的無(wú)血清培養(yǎng)，從低氧、低血等誘導(dǎo)因素方面綜述脂肪細(xì)胞去分化的調(diào)控機(jī)制，為之后進(jìn)一步研究去分化調(diào)控機(jī)制提供新的理論，并對(duì)脂肪細(xì)胞去分化的天花板培養(yǎng)提供簡(jiǎn)便可行的培養(yǎng)模式。本文查閱近10年有關(guān)低血低氧對(duì)脂肪細(xì)胞去分化影響的文獻(xiàn)，并對(duì)脂肪細(xì)胞去分化過(guò)程中脂滴丟失的調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】去分化脂肪細(xì)胞; 脂肪組織 組織工程; 無(wú)血清培養(yǎng)

【中圖分類號(hào)】R 446.8【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

基金項(xiàng)目：貴州省科技廳

收稿日期：( 2014-05-04； 編輯： 張翰林)

Research status of the mechanism of lipid drops lost during the process of adipocyte dedifferentiationLI Jifeireviewing,WANG Zhaojiechecking

(DepartmentofOsteology,TheFifthAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege(Zhuhai),Zhuhai519100,Guangdong)

【Objective】The conditions of hypoxia and free serum medium are the initial induce condition of the process of dedifferentiation, which lead to the change of aipocyte’s phenotype and functional gene.After ceiling culture, adipocyte shift into lipid-free fiberoblast-like cells, and regain mutilineage properties.We retrieved the recent 10 years literatures that correlate to adipocyte culture of hypoxia condition and free serum medium condition.

【Key words】Adipocyte dedifferentiation; Fat tissue tissue engineering; Serum-free medium

通信作者：王兆杰，《西部醫(yī)學(xué)》編委，E-mail:zhaojiewang@163.com

去分化脂肪細(xì)胞(DA)因其來(lái)源廣，數(shù)量充足，功能良好，穩(wěn)定性強(qiáng)，純度高，取材方便等特點(diǎn)，近年來(lái)備受關(guān)注。脂肪組織可以通過(guò)特殊信號(hào)調(diào)控免疫調(diào)節(jié)，而胞質(zhì)中的脂滴占成熟脂肪細(xì)胞體積的90%，也因其存在表現(xiàn)出特定的細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)[1]。謂去分化[2]是指在一定信號(hào)和刺激因子作用下，已分化成熟的細(xì)胞和組織倒退分化，返回原始幼稚狀態(tài)，這是一種通過(guò)自噬，胞質(zhì)脫落，陳舊分泌物和殘?bào)w外排等作用清除衰老的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)成分以及細(xì)胞有害物質(zhì)的過(guò)程。細(xì)胞質(zhì)凈化，細(xì)胞體變小，核仁重新出現(xiàn)，終末期分化細(xì)胞變成未分化狀態(tài)祖細(xì)胞，去分化后的細(xì)胞往往可以恢復(fù)活力。1975年van等[3]首次發(fā)現(xiàn)成熟脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)生了形態(tài)上的變化，從單房圓形逐漸丟失胞質(zhì)內(nèi)的脂滴，呈成纖維細(xì)胞樣[4]，在此過(guò)程中不僅細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，基因表達(dá)也發(fā)生相應(yīng)改變，呈脂肪前體細(xì)胞的特征[5]。盡管DA近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)，并且初步應(yīng)用于臨床，但是去分化的機(jī)制、培養(yǎng)條件以等許多問(wèn)題尚未解決。

1去分化脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)

1.1天花板培養(yǎng)1986年由sugihara首次提出[10](見(jiàn)于表格1)，不同于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的下沉性，成熟脂肪細(xì)胞具有漂浮性，在裝滿培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，漂浮的脂肪細(xì)胞會(huì)貼住內(nèi)壁，貼壁細(xì)胞會(huì)逐漸發(fā)生形態(tài)上的變化，大脂滴變?yōu)槎鄠€(gè)小脂滴，根據(jù)不同的研究顯示[11-15]，經(jīng)過(guò) 2~3周不加干預(yù)的培養(yǎng)后，脂滴逐漸消失，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)槌衫w維樣。

1.2改良天花板培養(yǎng)近年應(yīng)用較多的是matsumoto提出的改良天花板貼壁法(16)，自脂肪組織中分離脂肪細(xì)胞的方法與前者相同，37℃條件下震蕩消化一小時(shí)后以135g離心3min后，提取表面漂浮的脂肪細(xì)胞，于加入20%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，7天后去除培養(yǎng)液并倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。并證實(shí)不用添加特殊細(xì)胞因子和條件進(jìn)行誘導(dǎo)即可獲得貼壁DA，但培養(yǎng)的同時(shí)仍需注意[17]:①由于脂肪組織含有多種細(xì)胞如脂肪細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞，脂肪前體細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，血細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，外膜細(xì)胞等(11,18-21)，稍有不慎，這些細(xì)胞將會(huì)影響DA的純度。為提高分離脂肪組織的純度，充分的震蕩和Ⅰ型膠原酶充分消化至關(guān)重要。此外，位獲得高純度DA，還要求對(duì)大體組織重復(fù)研磨、過(guò)濾、沖洗和離心。②在脂肪細(xì)胞開(kāi)始接觸培養(yǎng)瓶壁的時(shí)候盡可能不要干涉和移動(dòng)是脂肪細(xì)胞成功去分化的關(guān)鍵。

1.3脂肪細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)國(guó)內(nèi)王歡歡等等[48]利用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)豬成熟脂肪細(xì)胞，培養(yǎng)方法在天花板的基礎(chǔ)上，使用了無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，并且棄用低速的135g離心3min，而選用在500、800、1200g三個(gè)梯度離心后選取效果最好的800g離心15min漂洗，吸取1ml上清液至新的離心管，加入適量無(wú)血清培養(yǎng)液800g離心15min，取上清后，轉(zhuǎn)移入到25cm3培養(yǎng)瓶中，加滿無(wú)血清培養(yǎng)液于37℃，5%CO2條件培養(yǎng)，保證了脂肪細(xì)胞的純度和提取效率。10d后成熟脂肪細(xì)胞完全去分化成為成纖維樣脂肪前體細(xì)胞，行rt-PCR油紅O等檢測(cè)，證實(shí)成功獲得DA。

2脂質(zhì)代謝的相關(guān)功能基因、功能酶和細(xì)胞因子

2.1去分化過(guò)程中功能基因的改變?cè)谌シ只^(guò)程中有362種基因下調(diào)，308種上調(diào)，其中下調(diào)的功能基因中幾乎都是針對(duì)脂肪酸代謝的基因和脂滴代謝的基因發(fā)生了改變，包括ADIPOQ,LIPE,PDK4,LPL,FASN,PPARγ和FABP4，以上功能基因關(guān)系著脂滴形態(tài)的改變和甘油三酯以及脂肪酸的代謝[23]。而上調(diào)基因主要是與細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變、遷移、增殖分化的能力獲得有著重要的決定作用。所以，脂滴的丟失主要與脂肪酸代謝和脂滴代謝的調(diào)控基因下調(diào)有關(guān)。

2.1.1PPARγ氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ)是具有重要生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控脂肪細(xì)胞分泌的多種蛋白質(zhì)因子基因的表達(dá)[24]PPAR基因家族包括α、β和γ三種成員，在機(jī)體脂類代謝及脂肪細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要作用，它是脂肪細(xì)胞基因表達(dá)和胰島素細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)者，參與脂肪細(xì)胞分化和糖脂代謝的調(diào)節(jié)[25]，在脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程中不僅能促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞的分化，而且也能促進(jìn)非脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成脂肪細(xì)胞，與脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)分化關(guān)系密切。

2.1.2c/EBPα c/EBP蛋白因其能與啟動(dòng)子的CCAAT區(qū)及多種病毒增強(qiáng)子結(jié)合而得名[26]。Luft等指出[27]C/EBPα對(duì)成脂分化作用比PPARγ更大一些，但是c/EBPα對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)控依賴于PPARγ[28]。

2.2乙酰輔酶A羧化酶與脂肪酸合成酶動(dòng)物體脂沉積[29]所需要的脂肪酸大多來(lái)自脂肪酸的從頭合成(De novo fatty acid synthesis)，即由脂肪酸合成酶催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸，進(jìn)而合成甘油三酯[30,31]。脂肪酸合成初始基礎(chǔ)物質(zhì)在乙酰CoA合成酶(ACS)的催化下合成乙酰CoA，然后在ACC催化下形成丙二酸單酰CoA，為脂肪酸合成提供原料，繼而在FAS的作用下，催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸[32]。所以當(dāng)FAS與ACC表達(dá)水平的升高時(shí)能夠顯著增加甘油三酯在細(xì)胞內(nèi)的沉積[40]。

2.3TNFα、IL6 腫瘤壞死因子多由脂肪組織中存在的脫脂細(xì)胞分泌[33]白介素6則由TNFα誘導(dǎo)合成[37]，在脂質(zhì)代謝的過(guò)程中Green等[6-8]發(fā)現(xiàn)TNFα下調(diào)脂肪表面標(biāo)志物和相關(guān)功能基因的表達(dá)，如(9)c/EBPα，RXRα，PPARγ等基因，并通過(guò)[34]自分泌和旁分泌途徑發(fā)揮刺激脂肪細(xì)胞分解，尤其是降低LPL的生成和活性，誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化(破壞前脂肪細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞逆分化)，加速脂肪細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞凋亡的作用，以促成脂肪細(xì)胞的去分化。有研究表明[35]肥胖病人的脂肪組織可以誘導(dǎo)TNFα和IL6濃度的提升，所以推測(cè)脂肪沉積程度和脂肪細(xì)胞數(shù)量是TNFα和IL6分泌的誘導(dǎo)因素，并且通過(guò)抑制脂質(zhì)合成來(lái)阻止脂肪的沉積和脂肪細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)。

3去分化過(guò)程中脂滴丟失的調(diào)控機(jī)制

3.1脂肪細(xì)胞形態(tài)的改變廖云君等研究證實(shí)[2]，為了模仿局部低氧低血的內(nèi)環(huán)境，在1%低濃度胎牛血清以及無(wú)氧條件下體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞10d，缺氧缺血可啟動(dòng)脂肪細(xì)胞脫去脂滴，圓形單房細(xì)胞移行成成纖維樣細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)去分化。而移植早期缺血缺氧的環(huán)境下，部分成熟脂肪細(xì)胞去分化，脫去脂滴，變成成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，使細(xì)胞提高了耐受能力，并逃避宿主巨噬細(xì)胞的攻擊[22]。證明了低血低氧培養(yǎng)基培養(yǎng)可以達(dá)到使脂肪細(xì)胞去分化的效果。

3.2脂肪酸的代謝改變國(guó)外研究者發(fā)現(xiàn)，肥胖患者脂肪組織中存在局部低氧的環(huán)境，低氧是誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素。Yin等發(fā)現(xiàn)[36]，在低氧環(huán)境下，脂肪酸的積累減少，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FATP1 和 CD36的表達(dá)受到明顯的抑制，脂解作用增強(qiáng)，脂質(zhì)代謝加速，造成了脂肪細(xì)胞胞質(zhì)中脂滴的大量減少。

3.3功能基因的改變Luther等發(fā)現(xiàn)[38]局部低氧環(huán)境能誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子(HIFs)表達(dá)，HIFs能誘導(dǎo)AP-1轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子Fra-2的表達(dá)上調(diào)，并且Fra-2能夠給與PPARγ結(jié)合，并抑制PPARγ表達(dá)。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[36]脂肪組織低氧環(huán)境(ATH)會(huì)加速脂質(zhì)代謝，并且抑制轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和 C/EBPα的表達(dá)，促使胞質(zhì)中的脂滴合成減少。而金小嵐等發(fā)現(xiàn)[39]，在不同低氧環(huán)境下誘導(dǎo)基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化時(shí)，與常氧組相比，各低氧組BMP-2蛋白和RUNX2表達(dá)呈不同程度的上調(diào)，并且氧濃度越低，表達(dá)上調(diào)越明顯。RUNX2與PPARγ呈此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，而RUNX2的表達(dá)上調(diào)，表明PPARγ的表達(dá)下調(diào)，證明低氧培養(yǎng)能抑制干細(xì)胞的成脂分化。

3.4脂肪酶的改變 Semenkovich等[40]指出動(dòng)物體脂水平和FAS的表達(dá)成正相關(guān)，而HSL水平與脂解活力呈強(qiáng)線性關(guān)系[41]，HSL是甘油三酯水解限速酶，能夠抑制甘油三酯在脂肪細(xì)胞中的積累[42]。國(guó)內(nèi)盧建雄的實(shí)驗(yàn)小組研究證明[43]，血清剝奪可以促使脂肪細(xì)胞去分化，依血清剝奪時(shí)間延長(zhǎng)，脂肪細(xì)胞激素敏感酯酶mRNA水平顯著增高，而FAS，ACC1水平顯著下降，導(dǎo)致脂肪酸積累顯著減少，脂滴逐漸縮小。無(wú)血清條件培養(yǎng)脂肪細(xì)胞36小時(shí)，細(xì)胞脂肪沉積下降22.6%，72h培養(yǎng)脂肪沉積下降50.7%，恢復(fù)血清條件培養(yǎng)后脂質(zhì)沉積于36h，72h分別提高30.8%和65.4%。行rt-PCR后顯示在無(wú)血清培養(yǎng)的條件下，F(xiàn)AS與ACC1mRNA水平顯著下調(diào)，而恢復(fù)血清培養(yǎng)條件后恢復(fù)到正常水平。從而證明血清條件的剝奪使得HSL表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)AS，ACC1表達(dá)下調(diào)，在脂滴丟失中起到了重要的生脂抑制和脂解加速作用，由此可以推斷去分化過(guò)程中脂滴丟失與動(dòng)物血清有密切的關(guān)系。

3.5細(xì)胞因子表達(dá)的改變白介素6(IL-6)和腫瘤破壞因子(TNFα)是由巨噬細(xì)胞分泌的炎性介質(zhì)，可以抑制脂聯(lián)素的表達(dá)[44]，從而可以抑制脂質(zhì)代謝。不同實(shí)驗(yàn)小組驗(yàn)證[44，45]低氧條件可以抑制脂聯(lián)素分泌，同時(shí)使得TNF-α和IL-6表達(dá)上調(diào)，并可激活NF-κB[46]通路，增加轉(zhuǎn)錄抑制子組蛋白去乙酰酶3(HDAC3)向細(xì)胞核內(nèi)以為，來(lái)抑制PPARγ的活性[47]，從而使得脂質(zhì)分解加速。

4小結(jié)與展望

去分化脂肪細(xì)胞具有來(lái)源廣泛、存儲(chǔ)豐富、抗衰老能力強(qiáng)、多向分化能力強(qiáng)、穩(wěn)定性高、取材方便、同源性高等優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)秀的組織工程種子細(xì)胞。

在低氧低血的培養(yǎng)條件下，脂肪細(xì)胞發(fā)生了去分化，脂肪細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了變化，由單房圓形細(xì)胞，變成了成纖維樣細(xì)胞，并且功能基因(PPARγ，C/EBPα)、脂肪酶(FAS,ACC1)、以及脂質(zhì)代謝相關(guān)的細(xì)胞因子(TNFα、IL6)的表達(dá)都發(fā)生了相應(yīng)的改變，使得脂質(zhì)代謝增強(qiáng)，脂肪酸積累減少，甘油三酯合成減少，從而使脂質(zhì)合成抑制，造成脂肪細(xì)胞胞質(zhì)中的脂滴減少丟失。由此可認(rèn)為低氧無(wú)血清的培養(yǎng)條件是啟動(dòng)脂肪細(xì)胞去分化的誘導(dǎo)因素之一。

目前的試驗(yàn)，細(xì)胞培養(yǎng)基中多加入了動(dòng)物血清，但是血清中的成分復(fù)雜，并且有可能會(huì)引發(fā)動(dòng)物疾病的感染和不必要的免疫應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果有可能產(chǎn)生干擾，對(duì)臨床試驗(yàn)造成了相應(yīng)的障礙，使得試驗(yàn)難以應(yīng)用于臨床研究。加入血清的培養(yǎng)基增加試驗(yàn)了的成本，并且是細(xì)菌的良好環(huán)境，容易造成培養(yǎng)基的污染。

骨折初期局部低氧低血的情況適合去分化脂肪細(xì)胞的生存環(huán)境，并有效抑制成脂分化趨勢(shì)(去分化脂肪細(xì)胞具有耐低氧耐低血的環(huán)境)，可以為骨住址工程提供良好的種子細(xì)胞，而且無(wú)血清條件培養(yǎng)脂肪細(xì)胞可有效促進(jìn)脂肪細(xì)胞去分化的過(guò)程，可以在天花板培養(yǎng)中考慮不加入血清，從而保證了實(shí)驗(yàn)效率和節(jié)省資源。目前國(guó)內(nèi)無(wú)血清培養(yǎng)與加入胎牛血清培養(yǎng)基的去分化脂肪細(xì)胞多向分化能力比較試驗(yàn)實(shí)例甚少。其他調(diào)節(jié)途徑對(duì)于脂肪細(xì)胞去分化的調(diào)控機(jī)制還未清楚，例如wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)的改變對(duì)于脂肪細(xì)胞去分化過(guò)程的影響，以及其他功能基因表達(dá)的改變?cè)谥炯?xì)胞去分化過(guò)程中發(fā)揮的作用等，這些問(wèn)題有待于未來(lái)的試驗(yàn)提供明確的結(jié)果。

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回歸分析中應(yīng)正確使用r、R、R2三種符號(hào)

回歸分析中所獲取的r是相關(guān)系數(shù)，R是復(fù)相關(guān)系數(shù)(Frisch R, 1934)，R2是決定系數(shù)或相關(guān)指數(shù)。r是簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)，描述兩變量間相關(guān)關(guān)系，或直線回歸中反應(yīng)變量與自變量之間的相關(guān)關(guān)系。在多元線性回歸(多重線性回歸)分析中，R是復(fù)相關(guān)系數(shù)，回歸平方和與總回歸平方和之比的平方根，描述反應(yīng)變量與多個(gè)自變量之間的線性相關(guān)關(guān)系。在多元線性回歸(多重線性回歸)分析中，R2是R的平方，稱決定系數(shù)或相關(guān)指數(shù)，是回歸平方和在整個(gè)反應(yīng)變量平方和(總回歸平方和)中所占比重，一般R2愈大表示回歸模型擬合愈好；但R2過(guò)大，意味著可能存在多重共線性問(wèn)題，常用容忍度(1-R2)、方差膨脹因子(VIF= 1/(1-R2))等指標(biāo)判斷，當(dāng)容忍度小于0.1，或VIF>10提示存在多重共線性問(wèn)題。

(四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院陳彬)