馬艷弘，劉　晨，張宏志，李亞輝，黃開紅

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457)

響應(yīng)面法優(yōu)化蘆薈皮多糖的微波輔助提取工藝及抗氧化活性研究

馬艷弘1，劉晨2，張宏志1，李亞輝1，黃開紅1

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457)

摘要：研究蘆薈皮多糖的微波輔助提取工藝及其抗氧化能力。在單因素試驗基礎(chǔ)上，以微波時間、微波功率、料液比、水提溫度為因素，采用Box-Benhnke試驗設(shè)計，以多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，并考察蘆薈皮多糖的抗氧化活性。結(jié)果顯示，蘆薈皮多糖的最佳微波輔助提取條件為料液比1∶31(g/mL)、微波時間95 s、微波功率400 W、提取溫度74 ℃，在此條件下蘆薈皮多糖提取率為4.926%；所提蘆薈皮多糖能夠降低脂質(zhì)過氧化物形成、清除DPPH自由基和羥自由基，具有較強的抗氧化能力，且在一定濃度范圍內(nèi)，其抗氧化能力與粗提物濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：蘆薈皮；多糖；微波輔助提取；響應(yīng)面分析；抗氧化活性

蘆薈為蘆薈屬百合科多年生常綠多肉質(zhì)草本植物[1]，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值和開發(fā)前景。研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈含有160多種化學(xué)成分，72種成分具有生物活性。包括蘆薈多糖、有機酸、黃酮、蘆薈大黃素、大黃酸、蘆薈苷等[2]。其中蘆薈多糖(aloe polysaccharide)是蘆薈最主要的生理活性成分之一，具有抗氧化、抗癌、抗菌消炎、保護(hù)心血管、降血糖、增強機體免疫力、延緩衰老等多種藥理保健功能[3-8]。素有“天然美容師”、“家庭醫(yī)生”等美譽，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為“21世紀(jì)人類的最佳保健品之一”，是國內(nèi)外公認(rèn)的藥食同源性植物。

隨著人們對蘆薈藥用價值的認(rèn)識，蘆薈在保健品、美容護(hù)膚、藥物中間體制備等方面得到了廣泛應(yīng)用。目前市場上的蘆薈產(chǎn)品均以蘆薈去皮后的葉肉為原料加工而成，95%以上的蘆薈皮被丟棄而未得到充分利用，不僅造成了資源的極度浪費，還容易引起嚴(yán)重的環(huán)境污染。研究報道蘆薈多糖不僅存在于蘆薈凝膠中，蘆薈葉表皮角質(zhì)下的柵欄組織中也貯存著大量的多糖[9]。但迄今為止有關(guān)蘆薈皮中活性多糖的高效提取技術(shù)仍未見報道。

近年來微波提取技術(shù)因其操作簡便、產(chǎn)率高及產(chǎn)物易提純等優(yōu)點在天然產(chǎn)物提取中得到了廣泛應(yīng)用[10-12]。因此，本研究以庫拉索蘆薈(aloe vera)的加工廢棄物蘆薈皮為研究材料，通過Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析(response surface methodology，RSM)優(yōu)化蘆薈皮中蘆薈多糖的提取工藝，并探討其抗氧化活性，為提高庫拉索蘆薈加工附加值、降低生產(chǎn)成本、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、提高資源的綜合利用率提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

庫拉索蘆薈皮,由徐州華瑞蘆薈制品有限公司提供；無水乙醇、濃硫酸、檸檬酸、硫氰酸氨、氯化亞鐵，南京化學(xué)股份有限公司生產(chǎn)；抗壞血酸、葡萄糖、苯酚,西隴化工股份有限公司生產(chǎn),上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；PBS磷酸緩沖液,北京奧萊寶生物有限公司生產(chǎn)；亞油酸、DPPH，美國Sigma公司生產(chǎn)。以上試劑均為分析純。羥自由基測定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.2儀器設(shè)備

Epoch微孔板分光光度計，美國Biotek公司；格蘭仕G80W23YSL-V3型微波爐，格蘭仕微波爐電器有限公司生產(chǎn)；RE-5220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器生產(chǎn)；JJ500型電子天平，常州雙杰測試儀器廠生產(chǎn)；HJ-6A多頭磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司生產(chǎn)。

1.3實驗方法

1.3.1蘆薈多糖提取工藝蘆薈皮清洗干凈后，50 ℃烘干至恒重，粉碎，過60目篩，稱取5 g樣品粉末，按照一定的固液比與蒸餾水混合，置于微波爐于不同微波功率和不同微波時間進(jìn)行微波輔助提取，將微波輔助提取后的提取液置于不同溫度下提取2 h，過濾，濾渣再提取1次，合并2次濾液，減壓旋蒸濃縮后，用4倍體積的80%乙醇(V/V)沉淀靜置過夜，3 500 r/min離心15 min，無水乙醇洗滌即可得蘆薈皮多糖粗提物。再于通風(fēng)櫥中室溫干燥，放入干燥器內(nèi)貯藏備用。

1.3.2多糖提取率的測定以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，再根據(jù)如下公式計算提取率。

多糖得率=0.9×多糖質(zhì)量濃度×多糖提取液體系×100%/原料質(zhì)量

(1)

式中：0.9 為葡萄糖的換算系數(shù)。

1.3.3單因素試驗設(shè)計以多糖提取量為目標(biāo)，按照上述多糖提取工藝，分別考察不同微波時間、不同微波功率、不同液料比和不同提取溫度對蘆薈皮多糖提取率的影響。

表1　蘆薈皮多糖提取的單因素實驗設(shè)計

1.3.4Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 設(shè)計方案，以微波時間A、微波功率B、料液比C、提取溫度D為考察因素，以多糖提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.05b軟件優(yōu)化蘆薈皮多糖提取工藝。 試驗因素、水平編碼見表2。

表2　Box-Behnken試驗設(shè)計因素和水平編碼表

(2)亞油酸體系法測定抗氧化能力。參考Braca等的檢測方法[14]。將多糖粗提物配制成濃度為5、10、15、20、25、30 mg/mL的水溶液，各取2 mL分別置于10 mL的具塞試管中，加入體積分?jǐn)?shù)為2.51%的亞油酸無水乙醇溶液2 mL、0.05 mol/L pH7.0的PBS磷酸鹽緩沖液4 mL、蒸餾水2 mL，渦旋振蕩混勻，密閉后置于40℃恒溫水浴鍋中避光水浴?？瞻撞患涌寡趸瘎?，其余處理相同。取0.1 mL以上混合溶液，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇9.7 mL和30%的硫氰酸銨0.1 mL、以及0.02 mol/L 氯化亞鐵(3.5%鹽酸配制) 溶液0.1 mL，混勻。準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，500 nm處測定吸光度。每隔12 h測定1次。共測定96 h。以上試驗平行進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。

(3)羥自由基清除能力測定。采用羥自由基測定試劑盒進(jìn)行測定，將蘆薈皮多糖粗提物制成濃度為5、10、15、20、25、30 mg/mL的水溶液，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。空白組以蒸餾水代替，標(biāo)準(zhǔn)組以0.03% H2O2代替，對照組以同濃度抗壞血酸代替。反應(yīng)后，550 nm處測吸光度值。以上試驗均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1微波時間對多糖提取率的影響考察不同微波處理時間對蘆薈皮多糖提取率的影響。由圖1可知，隨著微波時間的延長，蘆薈皮多糖提取率增大，當(dāng)微波時間為90 s時，提取率達(dá)最大，超過90 s后，微波提取率略微下降。原因可能為微波時間越長，多糖類化合物溶出的越多，測定值越大。當(dāng)提取時間達(dá)90 s 以后，由于溫度升高而導(dǎo)致部分多糖分解致使多糖提取率略微下降。因而確定最適微波時間為90 s。

圖1　微波時間對蘆薈皮多糖提取率的影響Fig.1　Effect of micro-wave time on polysaccharides extraction rate

圖2　微波功率對蘆薈皮多糖提取率的影響Fig.2　Effect of micro-wave power on polysaccharides extraction rate

2.1.2微波功率對多糖提取率的影響考察不同微波功率對蘆薈皮多糖的影響，由圖2可知，隨著微波功率的增加，蘆薈皮多糖的提取率增大，當(dāng)微波功率達(dá)400 W時，提取率達(dá)到最大，繼續(xù)提高微波功率，多糖提取率則不增反降。這可能是因為微波功率過大造成提取液溫度過高，使部分多糖分解造成提取率小幅降低。

2.1.3液料比對多糖提取率的影響考察不同料液比對蘆薈皮多糖的影響，由圖3可知，隨著料液比的增加，多糖提取率逐漸增大，但是當(dāng)料液比達(dá)1∶30后，多糖溶出量增幅很小，趨于穩(wěn)定。這是因為料液比達(dá)到一定比值時，蘆薈皮中多糖基本全部溶出，擴散達(dá)到平衡[15]，繼續(xù)增大溶劑劑量也不會促進(jìn)多糖的提取，反而會加重后續(xù)濃縮負(fù)擔(dān)。因此，提取蘆薈皮多糖適宜的料液比為1∶30。

圖3　液料比對蘆薈皮多糖提取率的影響Fig.3　Effect of liquid-solid rate on polysaccharides extraction rate

圖4　提取溫度對蘆薈皮多糖提取率的影響Fig.4　Effect of extract temperature on polysaccharides extraction rate

2.1.4提取溫度對多糖提取率的影響考察不同提取溫度對多糖提取率的影響。由圖4可知，低于70 ℃時，提取率隨提取溫度的提高而上升，當(dāng)溫度達(dá)70 ℃時，提取率達(dá)最大。溫度超過70 ℃后，多糖提取率又隨溫度升高而下降。這是因為隨著提取溫度升高，多糖降解率也增大，從而導(dǎo)致了提取率下降[16-17]。因此考慮70 ℃為蘆薈多糖適宜的提取溫度。

2.2蘆薈皮多糖提取響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1試驗結(jié)果與模型建立在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-behnken 設(shè)計方案，以多糖提取率為響應(yīng)值，優(yōu)化蘆薈皮多糖提取工藝。試驗結(jié)果見表3(實測值為3次平行試驗結(jié)果平均值)。

應(yīng)用Design Expert軟件對27個試驗的響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸分析，得到以蘆薈皮多糖提取率為響應(yīng)值的回歸方程為：Y=-2.38+0.027A+4.025×10-3B+0.19C+0.061D+3.33×10-6AB-3.33×10-4AC+5.00×10-5AD+5.00×10-6BC-2.25×10-5BD-5.50×10-4CD-1.17×10-4A2-3.50×10-6B2-1.90×10-4C2-2.63×10-4D2。

2.2.2方差分析與顯著性檢驗對模型方程進(jìn)行顯著性檢驗，由表4方差分析結(jié)果可見，回歸模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項(P=0.413 7)不顯著，實際試驗值與預(yù)測值具有高度相關(guān)性(R2=0.926 9)，表明模型與試驗值擬合良好[18]，試驗方法可信度高，該模型可以對蘆薈皮多糖的提取率進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測和分析。由表4還可知，四個自變量對響應(yīng)值的影響程度大小依次為液料比(C)>提取溫度(D)>微波時間(A)>微波功率(B)，其中因素A、C、D以及4個因素的二次項對蘆薈皮多糖提取量影響極顯著(P<0.01)，AC、BD、CD的交互作用對響應(yīng)值的影響顯著(P<0.05)。

表3　響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.3響應(yīng)面分析與優(yōu)化圖5至圖7反映了幾個因素間交互作用對多糖提取率的影響情況。響應(yīng)曲面圖中曲面的陡峭程度可以表明變量對多糖提取率的影響程度，曲面較陡表明影響較大，反之則較?。欢雀呔€圖反映了因素間交互作用的強弱大小，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著[19]。由圖5～7可知，任何兩個交互因素的響應(yīng)面都存在最高點，微波時間和料液比的交互作用、微波功率和提取溫度的交互作用、以及料液比和提取溫度的交互作用對提取率的影響極顯著(等高線圖為橢圓形)。同一料液比水平下，隨提取溫度和微波時間的增加，多糖提取率先逐漸提高后趨于平緩；同一提取溫度條件下，隨微波功率和料液比的增加，多糖提取率先逐漸增加后趨于平緩。

表4　方差分析

**表示差異1%水平顯著性，*表示差異5%水平顯著性。** significant at 0.01 level，* significant at 0.05 leve1.

通過軟件分析得到提取蘆薈皮多糖的最優(yōu)提取條件為：微波時間94.42 s、微波功率402.05 W、料液比1∶31.13、提取溫度74.71 ℃，多糖的預(yù)測得率為4.928%。為了操作方便，修正最佳提取條件為微波時間95 s、微波功率400 W、液料比1∶31(g/mL)、提取溫度74 ℃。在此條件下進(jìn)行3次平行驗證試驗，測得蘆薈皮多糖提取率為4.926%，與理論預(yù)測值4.928%基本一致。表明所得模型可以較好的預(yù)測蘆薈皮多糖的提取情況。

圖 5　微波時間和料液比對多糖提取率的交互作用Fig.5　Correlative effects of micro-wave time and solid-liquid rate on polysaccharides extraction rate

2.3蘆薈皮多糖抗氧化活性分析

2.3.1DPPH自由基清除能力分析檢測所提蘆薈皮多糖對DPPH自由基的清除能力，由圖8可知，在所設(shè)濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率隨蘆薈多糖濃度增加逐漸增強，當(dāng)濃度達(dá)到30 mg/mL時，DPPH自由基清除率達(dá)70.32%。略低于同濃度抗壞血酸的DPPH自由基清除率。

圖6　微波功率和提取溫度對多糖提取率的交互作用Fig.6　Correlative effects of micro-wave pover and extract temperature on polysaccharides extraction rate

圖7　液料比和提取溫度對多糖提取率的交互作用Fig.7　Correlative effects of solid-liquid rate and and extract temperature on polysaccharides extraction rate

圖8　蘆薈皮多糖DPPH自由基清除能力Fig.8　DPPH radical scavenging capacities of aloe peels polysaccharide

2.3.2亞油酸體系法測定抗氧化能力分析采用亞油酸體系法檢測所提蘆薈皮多糖對脂質(zhì)過氧化物的抑制能力。吸光度越小，表明其對生成的脂質(zhì)過氧化物的抑制能力越強。由圖9可知，在96 h內(nèi)空白組吸光值快速增大，表明有大量的過氧化物形成；不同濃度蘆薈皮多糖溶液吸光值均低于空白組，同一測定時間下，吸光值隨著蘆薈皮多糖濃度的增高而逐漸降低。表明檢測體系內(nèi)脂質(zhì)過氧化物濃度隨著時間延長而提高，蘆薈皮多糖對脂質(zhì)過氧化的生成具有明顯的抑制作用，且濃度越高，其抑制作用越強。

圖9　蘆薈皮多糖對脂質(zhì)過氧化物的抑制作用(亞油酸體系法)Fig.9　Inhibitions effect on aloe peels polysaccharide to lipid peroxidation by linoleic acid method

圖10　蘆薈皮多糖羥自由基清除能力Fig.10　Hydroxyl radical scavenging capacities of aloe peels polysaccharide

2.3.3羥自由基清除能力分析考察所提蘆薈皮多糖對羥自由基的清除能力，由圖10可知，隨著蘆薈皮多糖溶液濃度的增加，羥自由基清除率也逐漸增大。在0～5 mg/mL內(nèi)，相同濃度的蘆薈皮多糖與抗壞血酸的羥自由基清除率相差不大；在5～30 mg/mL內(nèi)，蘆薈皮多糖對羥自由基的清除率則大于相同濃度抗壞血酸的羥自由基清除率。當(dāng)兩者濃度均為30 mg/mL時，蘆薈皮多糖的羥自由基清除率和抗壞血酸的羥自由基清除率分別為70.9%和62.4%，與抗壞血酸相比，蘆薈皮多糖的羥自由基清除率提高了13.62%。

由以上試驗結(jié)果表明，蘆薈皮多糖具有較強的抗氧化活性。但其結(jié)構(gòu)與功能的構(gòu)效關(guān)系尚不明確，因此對蘆薈皮多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、構(gòu)效關(guān)系等相關(guān)研究仍需深入開展。目前，相關(guān)試驗正在進(jìn)行中。

3結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對微波輔助提取蘆薈皮多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了可靠的預(yù)測模型，得到蘆薈皮多糖的最佳提取工藝條件，即微波輔助時間95 s、微波功率400 W、料液比1∶31(g/mL)、提取溫度74℃。在此條件下蘆薈皮多糖提取率為4.926%，與理論預(yù)測值4.928%基本一致，模型方程高度顯著，擬合度良好，可以較好的預(yù)測蘆薈皮多糖的提取得率。對所得蘆薈皮多糖粗提物進(jìn)行抗氧化活性研究，結(jié)果顯示蘆薈皮多糖對DPPH自由基、羥自由基的清除率以及對脂質(zhì)過氧化物生成的抑制率隨濃度增大而增強。當(dāng)蘆薈皮多糖粗提物濃度達(dá)30 mg/mL時，與同濃度抗壞血酸的抗氧化能力相比，其羥自由基清除能力提高了13.62%?？梢?，微波輔助提取的蘆薈皮多糖得率較高、抗氧化能力較強，既對節(jié)能環(huán)保、提高蘆薈皮資源的利用率提供了很好的思路，也可為蘆薈皮多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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Response Surface Methodology for Optimization of Microwave-assisted

Extraction of Polysaccharides from Aloe Peel and

Evaluation of Their Antioxidant Activity

MA Yan-hong1,LIU Chen2,ZHANG Hong-zhi1,LI Ya-hui1,HUANG Kai-hong1

(1.Institute of Agricultural Products Processing,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China;2.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Abstract：Response surface methodology(RSM) was used to optimize the conditions for microwave-assisted extraction of polysaccharides from aloe peel,and the antioxidant activity of polysaccharides was also evaluated.Based on single-factor tests,Box-benhnken center composite experiment was carried out with four factors，including microwave time,microwave power,solid-liquid rate and extraction temperature.RSM was used to determine the efect of prime factors on the yield of polysaccharides.Besides,the antioxidaut activity of the polysaccharides was evaluated in vitro.The results showed that the optimal parameiers of microwave-assisted extraction were solid-liquid ratio 1∶31,microwave time 95 s,microwave power 400 W,extraction temperature 74 ℃.Under the optimal conditions,the polysaccharide extraction rate was 4.926%.The antioxidant activity of the polysaccharides from aloe peels was found in a dose dependent manner.

Key words:aloe peels;polysachharides;microwave-assisted extraction;response surface methodology;antioxidant activity

作者簡介：馬艷弘(1972—)，女，副研究員，博士，主要從事發(fā)酵食品與農(nóng)副產(chǎn)品資源綜合利用研究，E-mail:mayhhyy@126.com。

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系類項目[CX(12)1005]

收稿日期：2014-08-12修回日期：2014-10-23

中圖分類號：TS201.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-2286(2015)01-0149-08