王向輝，丁瓊浩

(1. 河南省鞏義市中醫(yī)院，河南 鞏義 451200；2. 四川省內(nèi)江市中醫(yī)院，四川 內(nèi)江 610072)

膝骨關(guān)節(jié)炎的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞療法

王向輝1，丁瓊浩2

(1. 河南省鞏義市中醫(yī)院，河南 鞏義 451200；2. 四川省內(nèi)江市中醫(yī)院，四川 內(nèi)江 610072)

膝骨關(guān)節(jié)炎；軟骨組織；軟骨修復(fù)；組織工程；間充質(zhì)干細(xì)胞；載體支架；生長因子

膝骨關(guān)節(jié)炎是中老年人常見的關(guān)節(jié)退行性病變。骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨破壞及關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨質(zhì)再生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病。本病病理核心是關(guān)節(jié)軟骨的損傷及骨贅形成。目前認(rèn)為本病是多因素聯(lián)合作用的結(jié)果：軟骨基質(zhì)合成與分解代謝失調(diào)，軟骨下骨板損害使軟骨失去緩沖作用，關(guān)節(jié)內(nèi)局灶性炎癥[1]。臨床常見患者膝關(guān)節(jié)的疼痛、晨僵、腫脹、摩擦音及畸形，嚴(yán)重影響了中老年人的生活質(zhì)量。近年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)廣泛用于膝骨關(guān)節(jié)炎的治療，現(xiàn)將研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 軟骨的生理結(jié)構(gòu)、損傷與修復(fù)特點(diǎn)

關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞與基質(zhì)組成。其中，軟骨細(xì)胞占成熟組織體積的10%以下，負(fù)責(zé)維持基質(zhì)?；|(zhì)主要由水(占70%～85%)、Ⅱ型膠原(占10%～20%)、蛋白多糖(占5%～10%)組成。關(guān)節(jié)軟骨主要靠滑液的彌散來獲取營養(yǎng)，只有在反復(fù)負(fù)載的情況下才能保持正常的代謝。

軟骨組織無血管、神經(jīng)及淋巴引流。故成年的軟骨一旦破壞，因缺乏血供則不能使纖維蛋白凝塊形成，或炎性細(xì)胞和未分化細(xì)胞從血管遷移到組織損傷部位進(jìn)行修復(fù)。此外，軟骨缺少能夠遷移、增殖并參與修復(fù)反應(yīng)的未分化細(xì)胞。而僅有的高分化的軟骨細(xì)胞，既無法穿過致密的膠原-蛋白多糖基質(zhì)到達(dá)受損處，又不能很好促進(jìn)基質(zhì)合成。

臨床常見的修復(fù)軟骨損傷的方法有：傳統(tǒng)的包括骨軟骨成形術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)、微骨折術(shù)，組織工程學(xué)治療包括骨膜或軟骨膜移植術(shù)、自體(馬賽克成形術(shù))或異體骨軟骨移植、自體軟骨細(xì)胞種植(ACI)、基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植(MACI)、關(guān)節(jié)軟骨原位再生技術(shù)以及干細(xì)胞治療等。①骨軟骨成形術(shù)是關(guān)節(jié)鏡下對(duì)受損軟骨進(jìn)行機(jī)械磨削至出血，誘發(fā)自身的修復(fù)，同時(shí)也減少活動(dòng)時(shí)的摩擦。由于缺乏前瞻性的臨床隨機(jī)對(duì)照研究，此術(shù)式的有效性還不確定[2]。②軟骨下骨鉆孔術(shù)即從軟骨缺損的區(qū)域向軟骨下骨板鉆孔至出血，但鉆孔時(shí)產(chǎn)生大量熱量，易使周圍骨質(zhì)壞死；且再生的組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，耐磨性差；術(shù)后易發(fā)生關(guān)節(jié)的炎癥。③微骨折術(shù)即在關(guān)節(jié)鏡下清除受損軟骨及鈣化軟骨層，用錐鉆在軟骨下骨上打孔至出血，使孔中滲出的血液和骨髓形成血凝塊，其中的干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，再生成由纖維軟骨或類透明軟骨構(gòu)成的替代性組織，但其性能較透明軟骨差，術(shù)后易復(fù)發(fā)，且康復(fù)的時(shí)間長、要求高，被認(rèn)為是一種過渡手段。該手術(shù)對(duì)于年輕患者(<45歲)效果較好。目前有將生物材料和其他技術(shù)與該手術(shù)聯(lián)合使用。將生物材料作為支架使細(xì)胞維持于一定位置，以增強(qiáng)血凝塊的早期機(jī)械穩(wěn)定性，或者在鉆孔中加入生物活性因子促進(jìn)透明軟骨生成量。但這些技術(shù)還存在一些問題尚待解決。④馬賽克技術(shù)是關(guān)節(jié)鏡下用特制手術(shù)器械取非負(fù)重區(qū)的骨軟骨復(fù)合體，如鑲嵌馬賽克一樣置于軟骨缺損區(qū)。這種方法事實(shí)上是將低應(yīng)力區(qū)軟骨移至高應(yīng)力區(qū)，手術(shù)本身也是一種損害，易造成供區(qū)軟骨的退變。⑤骨膜或軟骨膜移植術(shù)是利用骨膜或軟骨膜生發(fā)層(含有豐富的間充質(zhì)細(xì)胞)的成軟骨活性將其植入缺損處修復(fù)損傷，但仍存在植入物固定不牢、遠(yuǎn)期效果不確切、移植中的免疫反應(yīng)等問題。⑥ACI是關(guān)節(jié)鏡下活檢取患者自體的軟骨，經(jīng)酶處理后體外提取軟骨細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增，然后將軟骨細(xì)胞以混懸液形式注射到缺損處，取非負(fù)重區(qū)骨膜或生物膜縫合固定。該術(shù)短中期效果肯定，但遠(yuǎn)期效果觀察少，且新生組織多是纖維軟骨與透明軟骨的混合，機(jī)械性能與正常軟骨有差異，費(fèi)用高。⑦M(jìn)ACI，主要是將提取自體活檢組織中的軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)后種植在特殊的膠原膜(基質(zhì)，ACI-MaixTM)上，然后根據(jù)缺損形狀將MACI膜片剪切后移植與受損處，并用纖維蛋白粘合劑對(duì)其密封固定。該方法主要用于15～55歲間由創(chuàng)傷或剝脫性軟骨炎所致的軟骨缺損。相對(duì)而言，手術(shù)費(fèi)用昂貴、病例少、遠(yuǎn)期療效不確切。⑧關(guān)節(jié)原位再生技術(shù)是將載有生物趨化因子的生物型支架植入缺損處，誘導(dǎo)內(nèi)源性多能干細(xì)胞遷移聚集于缺損區(qū)，并通過控時(shí)釋放生物因子以刺激體內(nèi)干細(xì)胞增殖分化為軟骨細(xì)胞，進(jìn)而重建軟骨。原位再生技術(shù)采用的支架材料性能是實(shí)現(xiàn)軟骨有效修復(fù)的關(guān)鍵，關(guān)于支架如何負(fù)載誘導(dǎo)因子并達(dá)到緩慢釋放，是促進(jìn)軟骨再生支架構(gòu)建研究中的一大難點(diǎn)[3]。

以上手術(shù)方式比較發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)治療多依賴軟骨的自主修復(fù)，新生的組織多是纖維軟骨，其性能較正常軟骨差；而組織工程學(xué)技術(shù)獲取的組織雖更接近透明軟骨，但又存在體外培養(yǎng)中軟骨細(xì)胞來源不足的問題，而且軟骨細(xì)胞屬分化終末期細(xì)胞，體外培養(yǎng)傳代后可能出現(xiàn)“失分化”現(xiàn)象，而逐漸喪失其表型，不再產(chǎn)生軟骨特異性的基質(zhì)成分；關(guān)節(jié)原位再生技術(shù)生成的組織雖然有軟骨，但臨床報(bào)道少。因此，我們應(yīng)探索軟骨修復(fù)的新策略，尋找更為理想的種子細(xì)胞。而干細(xì)胞治療是組織工程領(lǐng)域軟骨損傷修復(fù)的研究熱點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景廣闊。

2 BMSCs的來源、特性、優(yōu)勢及分離培養(yǎng)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)起源于中胚層，終身存在于骨髓、髕骨下脂肪體、骨膜、關(guān)節(jié)滑膜等結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，負(fù)責(zé)組織的修復(fù)和更新，具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下可以分化成不同的組織，如骨組織、軟骨組織、脂肪組織、內(nèi)皮組織、肌肉組織、神經(jīng)組織、上皮組織等。MSCs來源廣，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，且無免疫排斥[4]。

從骨髓、臍帶血、外周血和脂肪組織中均能分離出MSCs。脂肪是MSCs的豐富來源之一[5]，與骨髓來源的MSCs相比成軟骨細(xì)胞的能力低[6]。外周血分離出MSCs數(shù)量很低，很難誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞[7]。有日本學(xué)者曾將滑液、骨髓、肌肉及脂肪來源的MSCs移植于兔的軟骨缺損之上，以比較不同來源MSCs的活體內(nèi)成軟骨潛能[8]，結(jié)果證明，滑液及骨髓來源的MSCs，其成軟骨能力要遠(yuǎn)優(yōu)于后兩種。

BMSCs主要存在于骨髓竇的內(nèi)腔面，其含量極少，但在體外培養(yǎng)中BMSCs具有較強(qiáng)的增殖傳代能力并能保持良好的生物學(xué)活性[9]。BMSCs在體內(nèi)外不僅能逃避宿主的免疫清除，還能調(diào)節(jié)大多數(shù)主要免疫細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)強(qiáng)大的免疫抑制和抗炎功能[10]。由于 BMSCs 的低免疫原性，使其在異體移植時(shí)產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)較輕微，為它在宿主中的生存提供了可能[11]。

目前，BMSCs的分離方法主要有以下幾種：①全骨髓貼壁分離法：將無菌抽取的骨髓加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液并培養(yǎng)，原代培養(yǎng)培養(yǎng)物以造血細(xì)胞成分居多，為利于BMSCs的貼壁生長，可采用DMEM和胎牛血清培養(yǎng)。②密度梯度離心法。根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同，常采用離心分離法進(jìn)行提取培養(yǎng)。為了提高純度，目前常常將上述兩種方法結(jié)合。③細(xì)胞表面分子標(biāo)記分選法[12]。根據(jù)BMSCs的細(xì)胞表面分子特征進(jìn)行分離。一般采用流式細(xì)胞儀、免疫磁珠或免疫沉積法[13]來進(jìn)行分選。④紅細(xì)胞裂解液分離法。⑤特制培養(yǎng)板篩選法。文獻(xiàn)報(bào)道多采用前2種方法[14]。

3 BMSCs的載體支架、生長因子

軟骨組織工程的基本原理是將體外培養(yǎng)的高濃度異體或自體活細(xì)胞，種植在天然或人工合成的聚合物支架上，形成細(xì)胞支架復(fù)合物后，回植入人體或動(dòng)物的組織缺損部位，同時(shí)輔以特殊生長因子。其后支架材料逐漸降解，被細(xì)胞分泌的基質(zhì)所代替，形成某種結(jié)構(gòu)和功能的組織和器官，從而完成修復(fù)與再造。成功的軟骨組織工程研究包含3部分：①能夠分化并保持特殊細(xì)胞表型且數(shù)量足夠的“種子”細(xì)胞；②載體支架；③可調(diào)節(jié)“種子”細(xì)胞增殖并維持其表型等特征的生長因子。其中，理想的MSCs載體支架應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：①能均勻搭載并保留細(xì)胞；②便于觀察新骨形成；③良好生物降解性；④支持血管快速內(nèi)生；⑤提高骨的骨傳導(dǎo)性橋接；⑥新骨形成后能被吸收和替代利于骨改建；⑦力學(xué)強(qiáng)度；⑧可以保留分化細(xì)胞的功能；⑨易于加工制作；⑩組織相容性好。常見的天然的支架材料有膠原、纖維蛋白、殼聚糖、藻酸鈣、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素等。優(yōu)點(diǎn)在于取材方便，可降解性，生物相容性好。其中，膠原和纖維蛋白應(yīng)用最廣。

而人工材料則包括聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇對(duì)苯二酸酯-聚丁烯對(duì)苯二酸酯(PEGT-PBT)、聚氨酯、聚乙烯氧化物等。優(yōu)勢是可批量生產(chǎn)，重復(fù)性好，形態(tài)結(jié)構(gòu)可控性強(qiáng)。但生物相容性不好，且親水性差，對(duì)細(xì)胞吸附不足，降解過程代謝產(chǎn)物產(chǎn)生炎性反應(yīng)[15]。PLA、PGA、PLGA是較常用的多孔生物降解聚合物。PLGA目前應(yīng)用比較廣泛[16]。

應(yīng)用MSCs的組織工程化軟骨主要有種子細(xì)胞-支架和種子細(xì)胞-支架-細(xì)胞因子2種形式。前者是將種子細(xì)胞和載體共同培育而獲得工程化軟骨，支架可維持軟骨缺損內(nèi)的細(xì)胞，并作為載體誘導(dǎo)透明軟骨細(xì)胞。后者是一種完全工程化的組織復(fù)合體，它是將種子細(xì)胞、載體支架及生長因子重組在一起，然后植入體內(nèi)而獲得新的組織。

BMSCs 的定向分化誘導(dǎo)具有重要作用。誘導(dǎo)方法有：①化學(xué)藥物誘導(dǎo)。目前較常用，它是在培養(yǎng)體系中加入地塞米松、維生素C及β-甘油磷酸鈉。②細(xì)胞因子和生長因子的誘導(dǎo)。③在與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)下分化。④物理方法，如體外沖擊波、電磁場等。⑤利用中藥如龜甲、杜仲、巴戟天、淫羊藿等的提取物與化學(xué)培養(yǎng)液共同或單獨(dú)發(fā)揮作用。⑥在轉(zhuǎn)基因作用下分化。這種誘導(dǎo)包括添加許多不同的生長因子、分化因子、激素和細(xì)胞因子。主要有轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1,TGF-β3)、胰島素樣生長因子( IGF-1)、地塞米松、骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族(BMPs)[17]、軟骨來源形態(tài)形成蛋白及整合素[18]等。其中，生長因子的影響尤為重要，它們能增強(qiáng)或維持軟骨細(xì)胞表型的表達(dá)，也可激發(fā)非軟骨細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞的表型，在軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)研究中均能不同程度地促進(jìn)軟骨的形成[16]。地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素 C是BMSCs向成骨細(xì)胞分化和體外成骨的必要條件[19]。

轉(zhuǎn)化因子-β(TGF-β)是當(dāng)前最強(qiáng)的細(xì)胞促生長因子，可以明顯促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，增加成骨細(xì)胞數(shù)量，在軟骨細(xì)胞定向分化方面起著主要作用；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是迄今為止已知的最強(qiáng)的骨誘導(dǎo)形成因子；IGF-1可促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，是TGF-β1重要的輔助因子。多個(gè)因子的聯(lián)合應(yīng)用可更好地修復(fù)軟骨缺損，但并非所有的生長因子的組合都是有利的[16]。

MSCs可分泌廣譜的具有免疫調(diào)節(jié)[20-21]和/或再生活動(dòng)性的生物活性分子[22]。通過直接的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用或多種因子的分泌，MSCs修飾局部環(huán)境并激活內(nèi)源性的前體細(xì)胞，從而對(duì)局部組織修復(fù)施以重要影響[23]。用BMSCs移植治療骨性關(guān)節(jié)炎機(jī)制，可能是通過BMSCs的營養(yǎng)作用和抗炎、抗免疫的特性來影響局部環(huán)境和內(nèi)源性祖細(xì)胞從而修復(fù)受損的軟骨組織[24]。

MSCs結(jié)合三維支架和/或生長因子，通過開放性切開術(shù)植入動(dòng)物的軟骨缺損處[25-27]具有創(chuàng)傷性并增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[28]。因此，一種更為簡單、無需支架的方法，即將MSCs制備成為懸液，直接進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)注射已被廣泛嘗試于軟骨修復(fù)。

4 問題與展望

近年來雖然對(duì)BMSCs的研究取得了很大進(jìn)展，但仍存在一些問題，如：①種子細(xì)胞的保存；②新生軟骨組織的生物力學(xué)性能不甚滿意；③缺乏鑒定BMSCs的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，尚未找到BMSCs的特異標(biāo)記分子；④BMSCs的定向分化機(jī)制、影響因素還不甚清楚；⑤干細(xì)胞的最佳傳遞策略，包括：干細(xì)胞的給藥時(shí)間(次數(shù))和傳遞途徑、干細(xì)胞給藥濃度、干細(xì)胞存儲(chǔ)介質(zhì)、干細(xì)胞的空間定位[29]；⑥如何提高BMSCs的定向分化率；⑦哪種填充材料作為載體更加有利于BMSCs 發(fā)揮作用且不良反應(yīng)??；⑧現(xiàn)階段的實(shí)驗(yàn)仍是一些初期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，還需要做高級(jí)動(dòng)物和臨床研究[30]；⑨BMSCs實(shí)驗(yàn)僅限于自體移植，在異體移植免疫應(yīng)問題上有待進(jìn)一步探索[31]；⑩體外擴(kuò)增、培養(yǎng)細(xì)胞的過程可能引入外源性物質(zhì)，存在安全性問題。

盡管關(guān)于BMSCs的應(yīng)用還有許多問題需要進(jìn)一步研究，但BMSCs作為未來軟骨修復(fù)的方向?qū)⒉蝗莺鲆暋Ｏ嘈烹S著研究的深入和應(yīng)用的推廣，一定會(huì)將組織工程化軟骨更好的應(yīng)用于臨床。

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丁瓊浩，E-mail:1163704990@qq.com

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R684.3

A

1008-8849(2015)04-0451-03

2014-03-01