王新星，高 鵬，鮑林飛，范美華，廖 智

（浙江海洋學院海洋科學與技術學院，海洋生物資源及分子工程實驗室，浙江舟山 316022）

地中海貽貝貝殼肌棱柱層蛋白質(zhì)組學分析

王新星，高 鵬，鮑林飛，范美華，廖 智

（浙江海洋學院海洋科學與技術學院，海洋生物資源及分子工程實驗室，浙江舟山 316022）

貽貝貝殼與后閉殼肌形成緊密連接并由此介導了貝殼的閉合。為了解貽貝后閉殼肌-貝殼之間連接界面以及蛋白質(zhì)分子組成，利用掃描電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜對地中海貽貝貝殼的微觀結構、碳酸鈣晶體構型進行分析；同時，采用酸抽提法獲取地中海貽貝后閉殼肌痕部位肌棱柱層的貝殼基質(zhì)蛋白，對酸可溶性蛋白和酸不溶性蛋白分別采用液質(zhì)聯(lián)用技術結合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索，共鑒定61種貝殼基質(zhì)蛋白。上述研究為深入了解貝殼的生物礦化機制以及肌肉-貝殼界面的無機相-有機相連接機理奠定了基礎。

地中海貽貝；肌棱柱層；掃描電子顯微鏡；傅里葉紅外光譜；蛋白質(zhì)組學

Key words：Mytilus galloprovincialis;myostracum;scanning electronic microscopic;fourier transform infrared spectroscopy;proteomics

貝類貝殼是由碳酸晶體在貝殼基質(zhì)蛋白（shell matrix protein,SMP）指導下形成的有序的納米結構，具有極佳的力學性能，因而在生物材料，生物醫(yī)學工程等方面具有較好的仿生學意義[1-3]。貽貝（Mytilus）貝殼微觀結構屬于典型的“珍珠質(zhì)-棱柱模型”（nacro-prismatic model）[4]，主要包括兩種不同晶體構型的碳酸鈣晶體結構，分別為位于貝殼外側的纖維棱柱層（fibrous prism）和位于貝殼內(nèi)側的珍珠質(zhì)層（nacre）。其中，纖維棱柱層賦予貝殼應力分散（crack propagation）和抗沖壓性能（puncture-resistance），而內(nèi)側的珍珠質(zhì)層則賦予了貝殼抗斷裂性能（fracture-resistance）[5-7]。肌棱柱層（myostracum）是一種特殊的貝殼微觀結構，在不同的雙殼貝類貝殼中均有發(fā)現(xiàn)[8,9]。肌棱柱層在貝殼的微觀結構中所占比例較小，然而，肌棱柱層在貽貝貝殼的后閉殼肌痕（Adductor Muscle Scar，AMS）部位直接與后閉殼肌產(chǎn)生緊密連接，因而在控制貝殼的閉合方面具有重要的意義[10]。GALTSOFF曾報道，太平洋牡蠣Crassostrea virginica中由后閉殼肌介導的貝殼閉合力超過10 kg，且在強行拉開時，斷裂部位通常位于后閉殼肌中間，而非后閉殼肌與貝殼的連接部位[11]。這表明后閉殼肌-貝殼的連接界面極為牢固，為人造骨骼的移植以及人工肌腱的研發(fā)提供了很好的參考價值。

貝殼的形成及其力學性能與其所含的貝殼基質(zhì)蛋白密切相關。貝殼基質(zhì)蛋白指導或參與了貝殼碳酸鈣晶體的成核，晶體生長方向控制，晶體構型選擇等過程[12]，同時，部分貝殼基質(zhì)蛋白，如絲狀蛋白等，與貝殼內(nèi)其他有機質(zhì)，如幾丁質(zhì)等，參與了貝殼內(nèi)有機制框架的形成，并賦予了貝殼優(yōu)異的機械性能[13]。目前對于貝殼基質(zhì)蛋白的研究主要集中于珍珠質(zhì)層或者纖維棱柱層[14]，而對于肌棱柱層的貝殼基質(zhì)蛋白研究尚未見報道。為深入了解貝殼肌棱柱層的微觀結構以及蛋白質(zhì)分子組成，我們以地中海貽貝Mytilus galloprovincialis為研究對象，采用掃描電子顯微鏡以及傅里葉紅外光譜等手段分析其后閉殼肌痕部位的微觀結構，同時，采取蛋白質(zhì)組學結合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索策略，分析了后閉殼肌痕部位肌棱柱層的貝殼基質(zhì)蛋白組成。上述研究為深入研究肌棱柱層的生物礦化機制以及肌棱柱層在后閉殼肌-貝殼連接界面中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 貝殼的采集和樣品處理

成年地中海貽貝（體長3～4 cm）采自浙江省舟山市東極島海域。去除體內(nèi)軟組織后，將貝殼浸沒于5%氫氧化鈉溶液30 min以去除貝殼表面附著的各種雜質(zhì)，之后以純水清洗并晾干備用。

1.2 掃面電子顯微鏡觀察

將貝殼沿縱向于后閉殼肌痕部位斷裂，斷裂后的貝殼樣品以去離子水清洗并進行超聲處理以去除橫斷面表面的雜質(zhì)。斷面經(jīng)噴金處理后，置于掃描電子顯微鏡（TESCAN，VEGA3型，捷克）進行觀察，掃描電壓為20 kV。

1.3 傅里葉紅光譜分析

肌棱柱層粉末狀樣品以不銹鋼手術刀從后閉殼肌痕部位表層刮取。所刮取的粉末樣品于瑪瑙研缽中進一步研磨至粒徑200目。粉末樣品和磨細的KBr粉末按質(zhì)量比約1∶100在瑪瑙研缽中研磨混合均勻，采用透射模式測量；分析儀器為美國Nicolet Nexus 670 FTIR分光光度計,掃描范圍400～4 000 cm-1,掃描次數(shù)32，分辨率為4 cm-1。紅外譜圖采用儀器附帶的Omnic軟件（版本8.2.387）進行分析處理。

1.4 肌棱柱層貝殼基質(zhì)蛋白的提取

取自肌棱柱層的貝殼粉末樣品溶于5%醋酸，充分溶解1 h后，離心（12,000×g,4℃）20 min，上清液（酸可溶性貝殼基質(zhì)蛋白）經(jīng)透析處理（截留分子量1 kDa）后冷凍干燥，于-20℃儲存?zhèn)溆茫怀恋恚ㄋ岵蝗苄载悮せ|(zhì)蛋白）以去離子水洗滌6次后冷凍干燥后于-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 蛋白質(zhì)酶解及質(zhì)譜分析

提取的貝殼基質(zhì)蛋白樣品溶于8 M尿素溶液，超聲處理30 min，加入事先溶解于50 mM碳酸氫銨溶液的二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），終濃度為10 mM，于57°C條件下還原1 h；之后再加入事先溶解于50 mM碳酸氫銨溶液的碘乙酰胺溶液（iodoacetamide，IAA）至終濃度20 mM；室溫，黑暗條件下進行烷基化反應45 min。還原烷基化反應后，將樣品溶液稀釋10倍，按1:50比例加入胰蛋白酶（Proteomics grade，Sigma），37°C條件下孵育18 h。酶解完成后，樣品溶液經(jīng)離心(12,000×g，4℃）20 min，上清液冷凍干燥后復溶于30 L 4%乙腈溶液（含0.1%三氟乙酸）準備進行質(zhì)譜分析。

質(zhì)譜分析在四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（QSTAR-Elite，Applied Biosystems，USA）上進行。酶解后的樣品溶液首先上樣質(zhì)譜儀配備的高效液相色譜系統(tǒng)（20AD HPLC system，Shimadzu，日本）；分離柱為Zorbax 300SB-C18反相柱(0.1×150 mm，5 μ，300 ?；Microm，Auburn，CA）；洗脫液分別為含0.1%甲酸的5%乙腈溶液（buffer A）和95%乙腈（buffer B）；洗脫梯度為90 min內(nèi)buffer B的比例由5%上升到35%，流速為0.3mL/min。質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集由軟件Analyst QS 1.1（Applied Biosystems，美國）自動完成；一級質(zhì)譜掃描范圍m/z 350～1 500；分辨率分別為60 000（全掃描)）和2 000（MS/MS掃描）；強度最大的8個峰（m/z 100～2 000）經(jīng)動態(tài)排除法收集后進行序列分析。

1.6 蛋白質(zhì)鑒定與序列分析

蛋白質(zhì)鑒定采用MSCOT軟件（版本2.1，Matrix Science，London，英國）進行。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫采用貽貝EST序列衍生數(shù)據(jù)庫，包括來自加利福尼亞貽貝M.californianus的EST 42 354條、地中海貽貝M.galloprovincialis的EST 19 617條、紫貽貝M.edulis的EST 5 300條、以及厚殼貽貝M.coruscus的EST 719條等，共計68 209條EST序列（下載自美國國家醫(yī)學圖書館數(shù)據(jù)庫）。上述EST數(shù)據(jù)按照六種可能的翻譯框翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列，經(jīng)MSCOT軟件轉(zhuǎn)化格式后構成自定義本地數(shù)據(jù)庫，二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)用以檢索該蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫；質(zhì)譜質(zhì)量容差（mass tolerance）分別設定為20 ppm（一級質(zhì)譜）和0.3 Da（二級質(zhì)譜）；固定修飾設定為乙酰化，可變修飾設定為氧化；蛋白質(zhì)得分在100分以上且最佳離子得分（ion score）為39分以上為可信鑒定。

鑒定后的所匹配的EST序列采用lasergene軟件分析其開放閱讀框；同原序列搜索在http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/在線進行；結構域預測采用SMART軟件在線http://smart.embl-heidelberg.de/進行；氨基酸組成分析采用ProtParam軟件在線http://web.expasy.org/protparam/進行。

2 結果

2.1 地中海貽貝后閉殼肌痕部位的斷面及表面微觀結構

由圖1a可見，地中海貽貝貝殼內(nèi)側后閉殼肌緊密粘附于貝殼后背端靠近生長邊緣處，經(jīng)5%氫氧化鈉溶液處理后，該肌肉組織可被去除，原所在部位為近橢圓形的深色區(qū)域，即后閉殼肌痕（圖1b）。將貝殼沿圖1b白線所示方向斷開后，后閉殼肌痕部位的斷面結構經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察，可發(fā)現(xiàn)有3種不同形貌的層次結構，從上至下分別肌棱柱層（Myostracum）、珍珠質(zhì)層（Nacre）和纖維棱柱層（Fibrous prism）。與肌肉組織直接連接的為肌棱柱層。此外，后閉殼肌痕的表面覆蓋一層光滑的膜樣組織且分布有少量納米級的小孔（圖1d）。

圖1 地中海貽貝貝殼后閉殼肌痕（AMS）斷層的掃描電子顯微鏡圖譜(a)地中海貽貝貝殼內(nèi)表面，箭頭示后閉殼肌(adductor muscle)；(b)地中海貽貝貝殼內(nèi)表面經(jīng)5%氫氧化鈉溶液處理后，后閉殼肌去除，箭頭所示為后閉殼肌痕；白色線代表貝殼斷裂位置；(c)地中海貽貝后閉殼肌痕部位斷面結構，展示三種不同的層次結構，分別為肌棱柱層(myostracum)、珍珠質(zhì)層(nacre)和纖維棱柱層(fibrous prism)；(d)后閉殼肌痕部位的表面結構，顯示該部位表面覆蓋有一層膜樣組織且分布少量納米級小孔.Fig.1 The photograph of interior surface and SEM images of cross-section of adductor muscle scar in M.galloprovincialis shell (a)the photograph of inner surface of an adult M.galloprovincialis.The adductor muscle was denoted by an arrow;(b)the photograph of inner surface of M.galloprovincialis shell after the muscle was removed by 5%NaOH;(c)the SEM image of section of the adductor muscle scar.The myostracum,nacre and fibrous prism were shown;(d)the SEM image of surface of adductor muscle scar.The membrane-like material with micro holes can be observed.

2.2 肌棱柱層傅里葉紅外光譜分析

地中海貽貝貝殼肌棱柱層的傅里葉紅外光譜展示了1個位于酰胺一帶的特征峰（1 784.80 cm-1）和4個碳酸鈣晶體特征峰（圖2），分別為CO32-的反對稱伸縮振動峰（1 437.60 cm-1,υ3）、CO32-的對稱伸縮振動峰（1 082 cm-1，υ1）、CO32-的面外彎曲振動峰（854.60 cm-1，υ2）和CO32-的面內(nèi)彎曲振動峰（712.09 cm-1和699.13 cm-1，υ4）。根據(jù)DAUPHIN等[15]的描述，上述4個碳酸鈣晶體特征峰屬于文石型碳酸鈣晶體的特征峰，表明地中海貽貝貝殼肌棱柱層的碳酸鈣晶體構型為文石型；而酰胺一帶出現(xiàn)的特征峰表明在肌棱柱層內(nèi)含有少量有機質(zhì)。

圖2 地中海貽貝貝殼肌棱柱層粉末樣品的FTIR光譜Fig.2 FTIR spectra of myostracum layer from M.galloprovincialis shell

2.3 肌棱柱層貝殼基質(zhì)蛋白的鑒定

利用LC-MS/MS質(zhì)譜技術結合貽貝EST數(shù)據(jù)庫搜索，從地中海貽貝貝殼肌棱柱層可溶性蛋白樣品中共獲得12個高可信度的鑒定結果（表1）；從不可溶性蛋白樣品中共計獲得49個高可信度的鑒定結果（表2）。對所匹配的61條EST序列進行開放閱讀框分析并進行序列同源性搜索、結構域預測以及氨基酸組成分析。代表性二級質(zhì)譜圖見圖3，其匹配的EST為gi|145900307，該EST編碼的蛋白與來自牡蠣 C.gigas的貝殼基質(zhì)蛋白 Whirlin(gb| EKC33408.1)的序列一致性為61%，匹配的肽段數(shù)為四條，蛋白質(zhì)得分208分（表1）。

圖3 匹配結果為gi|145900307的代表性二級質(zhì)譜圖(a)質(zhì)荷比為1090.61Da的蛋白質(zhì)片段序列-DPSVQWGFR-;(b)質(zhì)荷比為1711.98Da的蛋白質(zhì)片段序列-INNVPATYLDHEQAK-;(c)質(zhì)荷比為1312.69Da的蛋白質(zhì)片段序列-SEVDEEPSMYK-;(d)質(zhì)荷比為1111.74Da的蛋白質(zhì)片段序列-SGLRPGDGILK-.Fig.3 Representative MS/MS spectra for four peptides matching with gi|145900307 (a)MS/MS spectrum of the“-DPSVQWGFR-”with m/z of 1090.61Da; (b)MS/MS spectrum of the“-INNVPATYLDHEQAK-”with m/z of 1711.98 Da;(c)MS/MS spectrum of the“-SEVDEEPSMYK-”with m/z of 1312.69 Da;(d)MS/MS spectrum of the“-SGLRPGDGILK-”with m/z of 1111.74 Da.

不溶性蛋白樣品中所鑒定的蛋白質(zhì)種類遠多于可溶性蛋白樣品，表明多數(shù)貝殼基質(zhì)蛋白具有較強的疏水性。在上述已鑒定的蛋白中，有6種蛋白與已報道的來自其他貝類的貝殼基質(zhì)蛋白同源，如MUSP-3（EST gi|212814580）、NSPI-like protein(EST gi|238643545)、Shellmatrix protein (EST gi| 145887968)、Perlucin -like protein (EST gi| 58306883)、Nacrein-like protein (gi|223025603)和Whirlin(EST gi|145900307)。其余為此前未曾報道的新型貝殼基質(zhì)蛋白。其中，Calponin蛋白家族的種類最多，共鑒定到14種，其次是膠原類（Collagenlike）蛋白、含Calponin同源結構域的Transgelin類蛋白、Filamin蛋白、酶類（包括精氨酸激酶和醛縮酶）、以及具有特殊氨基酸組成的蛋白（如富含丙氨酸、甘氨酸和亮氨酸的蛋白）等。

3 討論

貝殼基質(zhì)蛋白研究不僅有助于了解貝殼的形成機制，同時也有助于從中開發(fā)具有生物醫(yī)藥應用價值的新型蛋白藥物，如骨生長促進因子等。目前數(shù)據(jù)庫中已報到的貝殼基質(zhì)蛋白種類已經(jīng)超過100種，主要來自貝殼的珍珠質(zhì)層或者棱柱層，物種來源主要為鮑魚（Haliotis）、牡蠣（Crassostrea）、以及珠母貝（Pinctada）。貽貝的貝殼基質(zhì)蛋白目前研究尚不多見，已報到的貽貝貝殼基質(zhì)蛋白目前僅十余種[16]，肌棱柱層特異的貝殼基質(zhì)蛋白目前尚未見報道。地中海貽貝貝殼肌棱柱層在后閉殼肌痕部位直接與后閉殼肌形成牢固連接。掃描電鏡觀察結果表明，肌棱柱層在形貌上與珍珠質(zhì)層和纖維棱柱層有較大的區(qū)別，主要表現(xiàn)為垂

直柱狀結構，這一結構特點有利于分散來自閉殼肌的拉力，從而使得肌棱柱層與后閉殼肌之間連接較為緊密；傅里葉紅外光譜分析表明，地中海貽貝貝殼肌棱柱層主要采取了文石型的碳酸鈣晶型。該結果類似于牡蠣的肌棱柱層[8]，表明肌棱柱層的碳酸鈣晶體構型在不同貝類貝殼中基本一致。

表1 地中海貽貝貝殼肌棱柱層可溶性蛋白的鑒定結果Tab.1 Protein identification of acid-soluble matrix of mytostracum from M.galloprovincialis shell

表2 地中海貽貝貝殼肌棱柱層不可溶性蛋白的鑒定結果Tab.2 Protein identification of acid-insoluble matrix of mytostracum from M.galloprovincialis shell

貝殼基質(zhì)蛋白通常具有較強的疏水性且在貝殼中形成交聯(lián)結構，因而常規(guī)的蛋白質(zhì)分離純化和鑒定策略在貝殼基質(zhì)蛋白研究中遭遇不少困難。目前，利用質(zhì)譜的高通量、高靈敏度、高精確度特點，結合貽貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行貝殼基質(zhì)蛋白的鑒定是當前研究生物礦化相關分子組成的主流方法[17-19]。由于肌棱柱層不僅是貝殼的一種組成結構，同時還參與了與后閉殼肌的緊密連接，因而在所鑒定的貝殼基質(zhì)蛋白中，不僅存在參與生物礦化的貝殼基質(zhì)蛋白，還存在可能參與肌肉-碳酸鈣連接的蛋白。在本次研究中，我們鑒定到6種已知貝殼基質(zhì)蛋白的同源蛋白，分別為MUSP-3、Shell matrix protein、Perlucin-like protein、Nacrein-like protein、NSPI-like protein和Whirlin-like protein。其中MUSP-3和Shell matrix protein最早發(fā)現(xiàn)于加利福尼亞貽貝的貝殼[8]，MUSP-3貝殼形成中的功能尚不清楚，而Shell matrix protein是一種具有鈣離子結合活性的蛋白，被認為在貝殼形成過程中參與了與碳酸鈣的結合[8]；Perlucin鑒定自鮑魚（H.cumingii）貝殼，可促進碳酸鈣的結晶并對碳酸鈣晶體的生長方向具有調(diào)節(jié)作用[20]。Nacrein是第一種被報道的貝殼基質(zhì)蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于珠母貝（P.fucata），且在珍珠質(zhì)層和棱柱層均有發(fā)現(xiàn)[21,22]；此外，Nacrein序列中含有碳酸酐酶結構域，在貝殼形成中具有促進碳酸鈣形成的作用，對生物礦化過程具有重要意義[23]。NSPI（Nacre serine protease inhibitor）是一種珠母貝（P.maxima）珍珠質(zhì)層的貝殼基質(zhì)蛋白，具有蛋白酶抑制劑活性[24]；本次從地中海貽貝貝殼肌棱柱層鑒定到的NSPI類似蛋白序列中含有兩個Kunitz型（KU）蛋白酶抑制劑結構域，預示著該蛋白可能在貝殼中起到保護貝殼基質(zhì)蛋白防止被降解的作用。Whirlin是一種鑒定自牡蠣的貝殼基質(zhì)蛋白，其序列中含有PDZ結構域[25]。該結構域參與蛋白質(zhì)相互作用，可選擇性的與其他蛋白的C端產(chǎn)生結合[26,27]。推測該蛋白可能參與了貝殼基質(zhì)蛋白的分子交聯(lián)。

鑒定結果中豐度最高的為含calponin結構域（Calponin domain）或者calponin同源結構域（Calponin homology domain）的蛋白，包括Calponin-like protein、Transgelin-like protein和Filamin-like protein。calponin結構域以及calponin同源結構域均具有肌動蛋白結合活性[28]；此外，我們還鑒定到一種含有Thymosin（THY）結構域的蛋白（EST gi|238649869），THY結構域同樣具有肌動蛋白結合活性[29]；上述蛋白的發(fā)現(xiàn)暗示著這些蛋白可能通過與肌動蛋白的相互作用從而使得肌棱柱層與后閉殼肌的肌肉組織之間形成連接。

鑒定結果中還包括7種膠原蛋白（表2）。盡管此前的研究已從貝殼的分泌組織外套膜中鑒定到分泌型膠原蛋白[30]，但貝殼中膠原蛋白的存在一直未獲證實。本次研究中所鑒定的7種膠原蛋白均來自酸不溶性蛋白樣品，多數(shù)含有VWA(von Willebrand factor type A)結構域，含VWA結構域的蛋白通常是構成細胞外基質(zhì)的成分，多與細胞粘附有關[31]。Galtsoff早期的一項研究表明，膠原蛋白酶處理能顯著降低閉殼肌與貝殼之間的連接力[11]。因此，膠原蛋白可能在肌棱柱層與閉殼肌的連接中發(fā)揮了重要作用。此外，在地中海貽貝貝殼肌棱柱層中還鑒定到細絲蛋白(filamin)和粗絲蛋白(filament)，兩者序列中分別含有filamin和filament結構域。Filamin結構域通常以串聯(lián)形式存在于骨架蛋白，具有肌動蛋白結合功能，同時也參與了蛋白質(zhì)相互作用[32]；Filament則是構成中間纖維的主要成分，主要發(fā)現(xiàn)于細胞骨架蛋白[33]。上述兩種蛋白在肌肉組織中含量豐富。細絲蛋白和粗絲蛋白在地中海貽貝貝殼肌棱柱層中的存在暗示著這兩種蛋白可能貫穿于肌肉組織和肌棱柱層；同時，結合圖1D中肌棱柱層表面膜結構中的小孔，推測在肌肉組織和肌棱柱層之間存在纖維狀有機質(zhì)，使得閉殼肌和肌棱柱層之間的連接更為緊密。

此外，地中海貽貝貝殼肌棱柱層中還鑒定到部分未知蛋白，這些未知蛋白在序列同源性搜索以及結構域預測中均未獲得超過閾值的結果；而氨基酸組成分析表明，這些未知蛋白往往具有特殊的氨基酸組成。例如，EST gi|58308563編碼的蛋白序列中含有高達41.2%的丙氨酸；EST gi|212830099編碼的蛋白序列中含有豐富的亮氨酸（11.3%）；EST gi|58307533編碼的蛋白序列中含有豐富的絲氨酸（14.2%）等（表1）。此前的研究表明，部分貝殼基質(zhì)蛋白表現(xiàn)出對某種氨基酸的偏好性（如高含量的丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸等）[17-19]，特殊的氨基酸組成有利于貝殼基質(zhì)蛋白形成特殊的空間結構以便與碳酸鈣分子產(chǎn)生結合或者與其他基質(zhì)蛋白（或幾丁質(zhì)等其他有機物）形成框架結構用以指導碳酸鈣分子的結晶和沉積[34]。

上述研究結果表明，地中海貽貝貝殼后閉殼肌與肌棱柱層形成緊密連接。肌棱柱層碳酸鈣晶體采取了文石型的晶體構型且具有復雜的蛋白質(zhì)分子組成。從中所鑒定的61種貝殼基質(zhì)蛋白對肌棱柱層的形成以及與后閉殼肌的連接具有重要意義，同時也為深入探討肌棱柱層的生物礦化機制以及碳酸鈣-肌肉之間的連接機制奠定了基礎。

致謝：感謝上海復旦大學蛋白質(zhì)組研究中心周新文博士提供質(zhì)譜分析。

[1]ALBECK S,ADDADI L,WEINER S.Regulation of calcite crystal morphology by intracrystalline acidic proteins and glycoproteins[J].Connective Tissue Research,1996,35:365-370.

[2]SELLINGER A,WEISS P M,NGUYEN A,et al.Continuous selfassembly of organic-inorganic nanocomposite coatings that mimic nacre[J].Nature,1998,394:256-260.

[3]LEE S W,JANG Y N,RYU K W,et al.Mechanical characteristics and morphological effect of complex crossed structure in biomaterials:fracture mechanics and microstructure of chalky layer in oyster shell[J].Micron,2011,42:60-70.

[4]KOUCHINSKY A.Shell microstructures in Early Cambrian mollusks[J].Acta Palaeontol Pol,2000,45(2):119-150.

[5]JACKSON A P,VINCENT J F V,TURNER R M.The mechanical design of nacre[J].Proc R Soc Lond B Biol Sci,1988,234: 415-440.

[6]TAYLOR J,LAYMAN M.The mechanical properties of bivalve(Mollusca)shell structures[J].Paleontology,1972,15(1):73-87.

[7]LI X,CHANG W C,YUH J C,et al.Nanoscale structural and mechanical characterization of a natural nanocomposite material: The shell of red abalone[J].Nano Lett,2004,4:613-617.

[8]LEE S W,JANG Y N,KIM J C.Characteristics of the Aragonitic Layer in Adult Oyster Shells,Crassostrea gigas:Structural Study of Myostracum including the Adductor Muscle Scar[J].Evid Based Complement Alternat Med,2011,2011:742 963.

[9]LOWENSTAM H A,WEINER S.On Biomineralization[M].New York:Oxford University Press,1989.

[10]CARTER J G.Shell microstructural data for the Bivalvia[Z]//Skeletal Biomineralization:Patterns,Processes and Evolutionary Trends.New York:Van Nostrand Reinhold,1990,1:297-411.

[11]GALTSOFF P A.The American oyster.Fish and Wildlife Service[M].U.S.Government Printing Office,1964.

[12]ALBECK S,ADDADI L,WEINER S.Regulation of calcite crystal morphology by intracrystalline acidic proteins and glycoproteins[J].Connective Tissue Research,1996,35:365-370.

[13]SUZUKI M,SAKUDA S,NAGASAWA H.Identification of chitin in the prismatic layer of the shell and a chitin synthase gene from the Japanese pearl oyster,Pinctada fucata[J].Bioscience,biotechnology,and biochemistry,2007,71:1 735-1 744.

[14]MARIE B,JOUBERT C,TAYAL A,et al.Different secretory repertoires control the biomineralization processes of prism and nacre deposition of the pearl oyster shell[J].Proc Natl Acad Sci,2012,109(51):20 986-20 991.

[15]DAUPHIN Y.Infrared spectra and elemental composition in recent biogenic calcites:relationships between the υ4 band wavelength and Sr and Mg concentrations[J].Appl Spectrom,1999,53:184-190.

[16]MARIE B,LE RN,ZANELLA-CLEON I,et al.Molecular evolution of mollusc shell proteins:insights from proteomic analysis of the edible mussel Mytilus[J].J Mol Evol,2011,72:531-546.

[17]CAROLINE J,DAVID P,BENJAMIN M.Transcriptome and proteome analysis of Pinctada margaritifera calcifying mantle and shell:focus on biomineralization[J].BMC Genomics,2010,11:613-625.

[18]MARIE B,MARIE A,JACKSON D J.Proteomic analysis of the organic matrix of the abalone Haliotis asinina calcified shell [J].Proteome Science,2010,8:54-64.

[19]MARIE B,TRINKLER N,ZANELLA-CLEON I.Proteomic identification of novel proteins from the calcifying shell matrix of the Manila clam Venerupis philippinarum[J].Marine Biotechnology,2011,13:955-962.

[20]LIN J Y,MA K Y,BAI Z Y,et al.Molecular cloning and characterization of perlucin from the freshwater pearl mussel,Hyriopsis cumingii[J].Gene,2013,526(2):210-216.

[21]MIYASHITA T,TAKAGI R,MIYAMOTA H,et al.Identical carbonic anhydrase contributes to nacreous or prismatic layer formation in Pinctada fucata(Mollusca:Bivalvia)[J].Veliger,2002,45:250-255.

[22]MARIE B,MARIN F,MARIE A,et al.Evolution of nacre:Biochemistry and proteomics of the shell organic matrix of the cephalopod Nautilus macromphalus[J].Chembiochem,2009,10:1 495-1 506.

[23]MIYAMOTO H,YANO M,MIYASHITA T.Similarities in the structure of nacrein,the shell-matrix protein,in a bivalve and a gastropod[J].J Molluscan Stud,2003,69:87-89.

[24]JACKSON D J,MCDOUGALL C,WOODCROFT B,et al.Parallel evolution of nacre building gene sets in molluscs[J].Molecular Biology Evolution,2010,27:591-608.

[25]ZHANG G,FANG X,GUO X,et al.The oyster genome reveals stress adaptation and complexity of shell formation[J].Nature, 2012,490:49-54.

[26]KHAN Z,LAFON M.PDZ domain-mediated protein interactions:therapeutic targets in neurological disorders[J].Curr Med Chem,2014,21(23):2 632-2 641.

[27]CHI C N,BACH A,STR?MGAARD K,et al.Ligand binding by PDZ domains[J].Biofactors,2012,38(5):338-348.

[28]FERJANI I,FATTOUM A,MANAI M,et al.Two distinct regions of calponin share common binding sites on actin resulting in different modes of calponin-actin interaction[J].Biochimica et Biophysica Acta,2010,1804:1 760-1 767.

[29]XUE B,LEYRAT C,GRIMES J M,et al.Structural basis of thymosin-β4/profilin exchange leading to actin filament polymerization[J].Proc Natl Acad Sci,2014,111(43):4 596-4 605.

[30]RAMAN M,MATHEW S.Study of chemical properties and evaluation of collagen in mantle,epidermal connective tissue and tentacle of Indian Squid,Loligo duvauceli Orbigny[J].J Food Sci Technol,2014,51(8):1509-16.

[31]COLOMBATTI A,BONALDO P,DOLIANA R.Type A modules:interacting domains found in several non-fibrillar collagens and in other extracellular matrix proteins[J].Matrix,1993,13(4):297-306.

[32]RUSKAMO S,YLNNE J.Structure of the human filamin A actin-binding domain[J].Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2009, 65(11):1 217-1 221.

[33]HERRMANN H,B?R H,KREPLAK L,et al.Intermediate filaments:from cell architecture to nanomechanics[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(7):562-573.

[34]EVANS J S.“Tuning in”to mollusk shell nacre-and prismatic-associated protein terminal sequence.Implications for biomineralization and the construction of high performance inorganic-organic composites[J].Chemical Reviews,2008,108:4 455-4 462.

Proteomic Analysis of Myostracum of Mytilus galloprovincialis Shell

WANG Xin-xing,GAO Peng,BAO Lin-fei,et al
(Laboratory of Marine Biological Resources and Molecular Engineering,School of Marine Science and Techonology,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

The attachment of adductor muscle-shell in Mytilus mediates the closing of shells.For understanding the mechanism and the molecular composition of this attachment,Scanning Electronic Microscopic and Fourier Transform Infrared Spectroscopy were used to explore the micro-structure and polymorph of muscle-shell attachment of Mytilus galloprovincialis.Furthermore,the protein composition of shell matrix from myostracum layer from adductor muscle scar of M.galloprovincialis was detected by a combination of LC-MS/ MS analysis with the Mytilus EST dataset search,which resulted in the identification of a total of 61 proteins from acid-soluble and acid-insoluble shell matrix proteins form myostracum of M.galloprovincialis shell.From this protein set,many novel shell proteins were identified which included proteins with possible link to biomineralization and certain uncharacterized proteins with unusual amino acid composition.This data would be useful in understanding the role of SMPs associated with the formation of myostracum.Further,the identified protein set from the myostracum layer could provide a clue for exploring the mechanism of adductor muscle-shell attachment.

Q67

A

1008－830X(2015)05－0444－08

2015-02-10

浙江省自然科學基金項目（LY14C100001）；蛋白質(zhì)化學與發(fā)育生物學教育部重點實驗室開放課題（2015DF02）；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（01410340002）

王新星（1995-），女，研究方向：海洋生物學.E-mail:1421861484@qq.com

廖智.E-mail:liaozhi@zjou.edu.cn