潘宣任 綜述，王 凱，龐玉生 審校

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，南寧 530021)

·綜 述·

鈣激活性氯離子通道抑制劑對肺動(dòng)脈平滑肌作用的研究進(jìn)展*

潘宣任 綜述，王 凱，龐玉生△審校

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，南寧 530021)

鈣激活性氯離子通道；肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；跨膜蛋白16A

1 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)的鈣激活性氯離子通道(CaCCs)與跨膜蛋白16A(TMEM16A)

肺血管張力維持需要CaCCs參與。人們對不同組織(包括肺動(dòng)脈)中平滑肌細(xì)胞上CaCCs進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)其通道活性在維持肺血管張力中起著重要作用[1-2]。

CaCCs如何參與平滑肌細(xì)胞收縮，現(xiàn)有2 種假設(shè)機(jī)制[3-4]：(1)“ryanodine 受體(RyR) 通道”機(jī)制。肌漿網(wǎng)上的RyR 中，存在Ca2+-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ) 的特異性磷酸化結(jié)合位點(diǎn)，CaMKⅡ能增加兔PASMCs上CaCCs的電流[I(Cl)Ca] 強(qiáng)度[5]。有研究者通過影響Ca2+內(nèi)流，觸發(fā)胞內(nèi)鈣池Ca2+釋放，引起血管平滑肌收縮。值得注意的是，低濃度ryanodine(1.0 nmol/L～10.0 μmol/L) 可使RyR處于開放狀態(tài)，但是高濃度ryanodine (0.3～2.0 mmol/L) 反而會(huì)使RyR通道關(guān)閉[6]。此外，肌漿網(wǎng)表面RyR通道產(chǎn)生的自發(fā)瞬時(shí)鈣釋放也可引發(fā)I(Cl)Ca。(2)“CaCCs激動(dòng)劑+三磷酸肌醇受體(IP3R) 通道”機(jī)制——CaCCs激動(dòng)劑有內(nèi)皮素-1 (ET-1)、5-羥色胺(5-HT)等[7]。膜G 蛋白耦聯(lián)受體Gq由CaCCs激動(dòng)劑激活，促使三磷酸肌醇(IP3) 作用于IP3受體通道，導(dǎo)致肌漿網(wǎng)釋放Ca2+，CaCCs激活，誘發(fā)I(Cl)Ca；另一方面，被激活的CaCCs使細(xì)胞膜去極化，電壓依賴性鈣通道(VDCC)開放，更多Ca2+內(nèi)流，平滑肌收縮。而PASMCs中的Ca2+濃度在這一正反饋循環(huán)中也升高了200～1 000 nmol/L[8]，激活的CaCCs在此過程中起了重要作用。

2008年3個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)構(gòu)成CaCCs的分子基礎(chǔ)為TMEM16A,并證實(shí)其能編碼CaCCs，這使通過基因手段調(diào)控CaCCs功能與表達(dá)成為了可能，為進(jìn)一步探究CaCCs生理與生物學(xué)特性提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[9-11]。在包括心、肺、肝臟、小腸、胎盤和骨骼肌的人類諸多組織中，TMEM16A mRNA均有分布[12]。Manoury等[13]使用細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測離體的大鼠PASMCs上的生理電流，分離出較強(qiáng)的外向整流性慢激活型I(Cl)Ca，與異源性TMEM16A 通道蛋白中檢測到的電流存在高度相似性；另一方面，他們使用小RNA干擾技術(shù)將離體培養(yǎng)大鼠PASMCs上TMEM16A的表達(dá)下調(diào)，發(fā)現(xiàn)與之相伴的是全細(xì)胞上I(Cl)Ca幾乎完全缺失。這說明TMEM16A是大鼠PASMCs上CaCCs蛋白的主要組成部分，對TMEM16A功能與表達(dá)的調(diào)控完全可以影響PASMCs上CaCCs的功能特性。此發(fā)現(xiàn)為與肺動(dòng)脈相關(guān)疾病的研究提供了新平臺。

一些肺血管病變，如低氧或高肺血流所致肺動(dòng)脈高壓，都有肺血管收縮異常、結(jié)構(gòu)重塑等病理表現(xiàn)，PASMCs參與了這些病理變化過程，而CaCCs功能異常是其中的重要環(huán)節(jié)。因此對PASMCs上CaCCs的研究，有助于進(jìn)一步了解上述疾病形成機(jī)制，從而為相關(guān)疾病防治找到新思路與新靶點(diǎn)。

2 PASMCs的CaCCs抑制劑

2.1 尼氟滅酸(niflumic acid，NFA) 研究PASMCs上CaCCs，需要對其具有特異性的藥物工具，才能從細(xì)胞膜上混合生理電流中分離出CaCCs的特定電流，單獨(dú)完整地證明該通道的生理功能與特性。目前國內(nèi)研究中，常用于PASMCs的Cl-通道抑制劑有：三苯氧胺(他莫昔芬，tamoxifen，TAM)[14]、NFA和indaryloxyacetic acid(IAA-94)等[15]。其中TAM是一般氯通道阻滯劑[16]，在低氧性肺動(dòng)脈高壓中，莫碧文等[14]發(fā)現(xiàn)其抑制PASMCs增生作用與肺動(dòng)脈血管擴(kuò)張效應(yīng)，不僅是通過抑制PASMCs上的CaCCs,也是通過抑制了其上的容量敏感性Cl-通道活性來完成的，因此TAM對于CaCCs不具特異性；而后二者則是常見的CaCCs抑制劑，其中以NFA最具代表性。NFA是一種單羧酸衍生物，曾被認(rèn)為是CaCCs特異性抑制劑，它能阻滯各種激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血管收縮效應(yīng)，其濃度在10.0～100.0 μmol/L時(shí)，能引起細(xì)胞膜超極化和血管舒張，但對胞外高鉀介導(dǎo)的收縮效應(yīng)無影響[8]。楊朝等[17]通過實(shí)驗(yàn)證明，NFA可以抑制急性低氧人PASMCs胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)升高，并發(fā)現(xiàn)NFA對急性低氧人肺動(dòng)脈血管環(huán)張力具有舒張作用?？赡軝C(jī)制是：低氧致[Ca2+]i升高，CaCCs 激活，細(xì)胞膜去極化，電壓依賴性鈣通道開放，胞外大量Ca2+內(nèi)流，[Ca2+]i進(jìn)一步升高，平滑肌收縮；NFA抑制CaCCs后，細(xì)胞膜去極化作用減弱，胞外Ca2+內(nèi)流減少，[Ca2+]i降低，平滑肌舒張。另一方面，盛文超等[18]發(fā)現(xiàn)，在低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，對于CaCCs的通道蛋白mRNA以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，NFA都有著抑制二者表達(dá)的作用。前者證明了NFA對肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮的抑制作用；而對于后者，MAPK通路與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)，NFA可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)[Ca2+]i，阻斷MAPK通路激活，抑制平滑肌細(xì)胞增殖。但NFA具有雙重效應(yīng)。Ledoux等[19]發(fā)現(xiàn)在兔PASMCs上，NFA既能抑制CaCCs，也能刺激出現(xiàn)一個(gè)持續(xù)的濃度依賴型I(Cl)Ca。在[Ca2+]i為250～500 nmol/L、電壓條件為負(fù)的情況下，胞外濃度在100.0 μmol/L的NFA可以增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞的I(Cl)Ca，而外向電流在正電壓條件下卻受抑制；對NFA洗脫后，正負(fù)電壓下I(Cl)Ca都增大了。NFA能阻斷容積調(diào)節(jié)性陰離子通道(VRACs)和K+通道，也能影響Ca2+電流，其應(yīng)用于PASMCs研究將增大解釋I(Cl)Ca的復(fù)雜性[20]。所以，NFA并非可以完全分離I(Cl)Ca的藥理學(xué)工具，亦不能成為最理想的研究PASMCs上CaCCs的特異性抑制劑。

2.2 CaCCinh-A01 隨著人們對CaCCs研究的深入，近年來國外出現(xiàn)了更具特異性的合成物，其中較新型的藥物工具有：CaCCinh-A01[21]和T16Ainh-A01[22]。有研究者在對150種以上紅酒進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)赤霞珠(一種釀造紅葡萄酒的紅葡萄品種)的提取物和小分子合成物可以抑制T84細(xì)胞的I(Cl)Ca，其半抑制濃度(IC50)是該提取物純品的1∶200稀釋度，而且更高濃度的該藥物能產(chǎn)生100%的抑制作用[23]。他們發(fā)現(xiàn)給小鼠接種輪狀病毒后，再予以口服該藥物處理可以阻止腹瀉發(fā)生。其機(jī)制是該藥物抑制了上皮細(xì)胞CaCCs活性，從而抑制了小鼠腸道上皮細(xì)胞液體分泌，此過程中該藥物并未影響輪狀病毒感染情況。此藥物不能阻止霍亂毒素所致水樣便的產(chǎn)生，在水樣便形成過程中，囊性纖維化Cl-通道(CFTR)(一種cAMP調(diào)節(jié)性Cl-通道)依賴性液體分泌起到激活機(jī)制的作用，這說明該藥物并不能抑制腸道上皮CFTR，而只針對CaCCs。此藥物即CaCCinh-A01。Yang等[24]以轉(zhuǎn)染了TMEM16A通道蛋白的CHO細(xì)胞為研究平臺，用以原子吸收光譜技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測系統(tǒng)對CaCCs/TMEM16A抑制劑進(jìn)行了高通量篩選，發(fā)現(xiàn)NPPB(一種Ca2+敏感性ICl-抑制劑)和CaCCinh-A01都對CaCCs/TMEM16A具有較好的濃度依賴性效應(yīng)，二者在濃度為300.0 μmol/L時(shí)，都能完全抑制CaCCs/TMEM16A的電流；而CaCCinh-A01的IC50為(6.35±0.27)μmol/L，NPPB的IC50為(39.35±4.72)μmol/L，前者IC50低于后者，說明CaCCinh-A01對CaCCs/TMEM16A電流抑制作用強(qiáng)于NPPB。較早前就有研究認(rèn)為，3-?；?2-氨基噻吩類型的CaCCinh-A01是潛在的CaCCs抑制劑[25]，說明其對PASMCs潛在的收縮拮抗作用。但是目前尚未有將其應(yīng)用于PASMCs中CaCCs的研究。如前所述，TMEM16A是PASMCs上CaCCs的主要成分，而CaCCinh-A01作為CaCCs/TMEM16A電流相對有效的特異抑制劑，將其應(yīng)用在該方面的研究具有可行性。

2.3 T16Ainh-A01 TMEM16A是CaCCs分子基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)，使很多實(shí)驗(yàn)課題組將CaCCs特異性抑制劑的研發(fā)聚焦其上。有研究者篩選了10萬多種化合物，發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑苯并吡唑類化合物能明顯抑制TMEM16A電流，抑制作用較強(qiáng)的A組化合物結(jié)構(gòu)母核為硫代乙?；B接的嘧啶環(huán)與苯并吡唑環(huán)，其中抑制作用最強(qiáng)的一種化合物的IC50僅1.0 μmol/L左右，并且其對TMEM16A的Cl-電流抑制并未干擾細(xì)胞信號通路上游Ca2+信號[22]，說明該化合物能直接作用于TMEM16A，因此其被命名為T16Ainh-A01。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)CaCCinh-A01可以完全抑制人氣管和小腸細(xì)胞上的I(Cl)Ca，而T16Ainh-A01在這些細(xì)胞上的抑制作用則相對較弱。研究顯示T16Ainh-A01主要抑制的是初始的激動(dòng)劑刺激性瞬時(shí)Cl-電流。Davis等[26]在兔PASMCs上應(yīng)用了T16Ainh-A01，并以全細(xì)胞模式膜片鉗技術(shù)記錄了給藥前后以及藥物洗脫后細(xì)胞膜I(Cl)Ca變化：給藥后400 s，標(biāo)準(zhǔn)化電流由原來的1.0下降到0.8以下，而藥物洗脫后300 s內(nèi)電流回升至1.0以上。此前有研究顯示，在兔PASMCs全細(xì)胞I(Cl)Ca記錄中，使用NFA對其具有抑制與刺激的雙重效應(yīng)，刺激效應(yīng)表現(xiàn)為在負(fù)性檢驗(yàn)電位時(shí)I(Cl)Ca增加，藥物洗脫后全細(xì)胞電流增強(qiáng)到了給藥前水平約200%[5]。而在有的研究者的實(shí)驗(yàn)中，無論是給予T16Ainh-A01后，還是藥物洗脫后，皆未觀察到刺激效應(yīng)，以10.0 μmol/L濃度給藥，5 min后洗脫，全細(xì)胞電流恢復(fù)到給藥前水平(105±5)%。這說明T16Ainh-A01在有效抑制PASMCs上I(Cl)Ca的同時(shí)，并未產(chǎn)生過多反向效應(yīng)，相較于NFA，其將能更真實(shí)地反映PASMCs上CaCCs的功能特點(diǎn)。10.0 μmol/L的T16Ainh-A01對阻力性動(dòng)脈血管有顯著抑制性，這些動(dòng)脈血管上已證明有TMEM16A表達(dá)，而且它對于5-HT誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈收縮亦有拮抗作用[27]，其還對高鉀引起的血管收縮無顯著影響；它的抑制效能并不受鈣激活鉀通道阻滯劑(paxilline)、格列苯脲(glibenclamide)或利諾吡啶(linopirdine)影響，上述3種藥物分別是ATP敏感性鉀通道，KCa3.1、KCNQ編碼的鉀通道的有效抑制劑，這些通道蛋白也表達(dá)在PASMCs中。另外，T16Ainh-A01也同樣能拮抗甲氧胺(methoxamine)或U46619誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮，說明其并非以受體阻斷劑的形式來發(fā)揮作用的[26]。以上都證明對于PASMCs上的CaCCs，T16Ainh-A01比其他傳統(tǒng)CaCCs抑制劑具有更強(qiáng)特異性。

3 總 結(jié)

TMEM16A是PASMCs上CaCCs蛋白的主要成分，此發(fā)現(xiàn)極大帶動(dòng)了CaCCs特異性抑制劑的研發(fā)，較新的藥理學(xué)工具因而得以出現(xiàn)，而這又推動(dòng)了CaCCs研究的進(jìn)一步加深。但運(yùn)用抑制性藥物工具去分析PASMCs上CaCCs功能特點(diǎn)時(shí)仍需謹(jǐn)慎，因?yàn)橄嗨瞥潭鹊腜ASMCs收縮拮抗，也可由直接抑制Ca2+通道或激活K+通道來完成，這都能間接導(dǎo)致具有相同功能的離子通道關(guān)閉，從而增加細(xì)胞離子通道中生理電流研究的復(fù)雜性。另一方面，血管平滑肌上CaCCs是否僅由TMEM16A組成仍具爭議，從兔肺動(dòng)脈上測得天然的CaCCs單通道電導(dǎo)性為1-3 pS[27]，比Yang等[9]在TMEM16A通道蛋白過表達(dá)研究中測得的TMEM16A電導(dǎo)性(8 pS)要小，這或許是于表達(dá)在血管平滑肌細(xì)胞上的不同的TMEM16A剪切變異體具體特性不同所致。因此，對PASMCs上CaCCs完全特異的抑制劑或許尚未出現(xiàn)，仍需大量CaCCs的實(shí)驗(yàn)研究去促進(jìn)更新型CaCCs特異性抑制劑的研發(fā)。

CaCCs抑制劑不僅是研究PASMCs上CaCCs較好的藥理學(xué)工具，其對PASMCs收縮的拮抗作用，也將對人們研發(fā)新型血管舒張性藥物以防治相關(guān)肺動(dòng)脈高壓疾病，提供新的思維與手段。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2015.26.035

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160040)。

：潘宣任(1983-)，碩士，住院醫(yī)師，主要從事肺動(dòng)脈高壓研究工作。△

，E-mail:pangyush@163.com.cn。

R363

A

1671-8348(2015)26-3699-03

2015-03-28

2015-05-12)