許遠(yuǎn)，魏和平，吳彥

(安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 安慶246011)

響應(yīng)面優(yōu)化長裙竹蓀總黃酮提取工藝研究

許遠(yuǎn)，魏和平，吳彥

(安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 安慶246011)

[摘要]通過單因素試驗(yàn)探討了乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度對(duì)長裙竹蓀(Dictyophoraindusiata)總黃酮得率的影響，并進(jìn)一步通過響應(yīng)面分析對(duì)超聲波輔助乙醇提取長裙竹蓀總黃酮的最佳工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳工藝條件為：乙醇濃度75.5%，液料比16.5∶1，超聲時(shí)間19min，超聲溫度56℃。在此工藝條件下，長裙竹蓀總黃酮得率達(dá)到3.03mg/g。

[關(guān)鍵詞]長裙竹蓀(Dictyophoraindusiata)；總黃酮；響應(yīng)面

黃酮類化合物是一類天然抗氧化化合物[1]，具有清除自由基、抗菌、防癌、防止毛細(xì)管滲透、鎮(zhèn)痛等多種生物活性功能[2，3]?，F(xiàn)代社會(huì)“高脂肪、高蛋白、高能量”的飲食結(jié)構(gòu)帶來癌癥、心血管等多種疾病高發(fā)，食物來源的黃酮天然、低毒、高效，對(duì)于此類疾病的防治功效顯著[4]。營養(yǎng)學(xué)研究顯示，眾多品種食用菌不僅富含多糖、多酚等生物活性物質(zhì)，也具有高含量的黃酮類化合物[5～8]。竹蓀(Dictyophpraspp.)是一類名貴大型食用真菌，營養(yǎng)豐富，口味鮮美獨(dú)特，素有 “真菌皇后”、“山珍之王”等美稱，歷代列為貢品，在現(xiàn)代亦成為食療佳品[9]。目前，針對(duì)竹蓀黃酮類化合物提取工藝的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究通過超聲波輔助乙醇提取法對(duì)長裙竹蓀子實(shí)體叫黃酮含量進(jìn)行了測定，并采取響應(yīng)面分析方法對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用竹蓀黃酮類化合物提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

長裙竹蓀子實(shí)體干粉為市售，以粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，制成干粉，儲(chǔ)存于冰箱(0～4℃)備用。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(>98%)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；無水乙醇、鹽酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉等均為分析純。

儀器：FA2004B電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司) ；手提式多功能粉碎機(jī)(上海廣沙工貿(mào)有限公司)；DZ-2BCⅡ真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海洪旋實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；SY-360型臺(tái)式數(shù)控超聲波提取機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；UV759紫外可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[10]，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：D= 3.5033C+ 0.3718(D為光密度，C為蘆丁濃度)，R2= 0.9968，表明了蘆丁在濃度0～0.3mg/mL之內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2長裙竹蓀總黃酮提取工藝流程

長裙竹蓀→晾干→粉碎→過篩→稱量→混合乙醇溶液→超聲處理→回流提取→濃縮→長裙竹蓀濾液

取2mL上述濾液于10mL容量瓶中，以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，在 510nm 處測定其光密度，并根據(jù)標(biāo)曲回歸方程計(jì)算長裙竹蓀總黃酮得率，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算公式如下：

式中：C為提取液中總黃酮濃度，mg/mL；V1為顯色時(shí)定容體積，mL；V2為顯色時(shí)取樣體積，mL；V為提取液總體積，mL；m為原料質(zhì)量，g。

1.2.3單因素試驗(yàn)

以乙醇濃度、液料比、超聲溫度、超聲時(shí)間4個(gè)因素為研究對(duì)象，以長裙竹蓀總黃酮得率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每因素試驗(yàn)時(shí)，待測因素按表1依次取值，其他因素固定取值如下：乙醇濃度70%、液料比12∶1、超聲溫度50℃、超聲時(shí)間15min。

表1　單因素取值水平

1.2.4響應(yīng)面法對(duì)提取工藝參數(shù)的優(yōu)化與驗(yàn)證

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)之上，根據(jù) Box-Benhnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用 Design Expert 8.0 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，分別選擇乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲溫度(D)作為自變量，以長裙竹蓀總黃酮的得率(R1) 作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以此分析各因素間交互作用對(duì)長裙竹蓀總黃酮得率的影響，因素水平取值見表2。

表2　響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素和水平

1.3數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2003軟件整理數(shù)據(jù)，Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1乙醇濃度的選擇

圖1顯示,總黃酮得率隨乙醇濃度升高而上升，達(dá)到 75%后略呈下降趨勢(shì)。原因可能是黃酮類物質(zhì)屬弱極性化合物，當(dāng)溶劑與提取物極性趨近時(shí)，提取物更易從細(xì)胞中溢出[11]，乙醇是提取黃酮的優(yōu)良有機(jī)溶劑之一[12]，75%的乙醇溶液極性可能與長裙竹蓀黃酮的極性最為相似，故在此濃度下提取率最高。而當(dāng)濃度高于75%后，溶劑極性與提取物極性差異逐漸增大，導(dǎo)致溶解度降低，進(jìn)而影響得率[13]。故乙醇濃度選用70%～80%進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析。

2.1.2液料比的選擇

圖2 顯示：總黃酮得率隨液料比的增加不斷增大，大于16∶1后曲線略有下降并逐漸平穩(wěn)。原因可能是隨液料比的增大，使得濃度差提高，有利于傳質(zhì)，提取越來越充分，而當(dāng)黃酮的溶出已基本達(dá)到平衡時(shí)，即便再增加溶劑量，也不能再增加得率，且由于溶劑量的增大，還可能使得一些非黃酮類的化合物溶解度增大，與黃酮類化合物形成了一定的競爭關(guān)系，從而導(dǎo)致提取含量減少。故液料比選用14∶1 ～18∶1進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析。

圖1 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響圖2 液料比對(duì)總黃酮得率的影響

2.1.3超聲時(shí)間的選擇

圖3顯示：總黃酮得率隨超聲波作用時(shí)間的增加而升高，大于20min 后總黃酮得率呈平緩下降趨勢(shì)。原因是超聲波的空化作用可充分破壞植物細(xì)胞，加速胞內(nèi)物質(zhì)釋放溶解，增大提取效率[14，15]，但過長的超聲時(shí)間可能會(huì)破壞黃酮類化合物的有效結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致降解。故超聲時(shí)間選用15～25min進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析。

2.1.4超聲溫度的選擇

圖4顯示：總黃酮得率隨超聲溫度的升高呈上升趨勢(shì)，達(dá)到55℃后趨于下降。原因是較高的溫度可能破壞樣品中黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而造成損失，同時(shí)高溫導(dǎo)致提取液的揮發(fā)量增加，從而導(dǎo)致得率下降。故超聲溫度選用50～60℃ 為宜。

2.2響應(yīng)面法確定長裙竹蓀總黃酮的最佳提取條件

2.2.1響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

選擇乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時(shí)間(C)、及超聲溫度(D) 作為自變量，以長裙竹蓀總黃酮的得率(R1) 作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，擬合后得到A、B、C、D的二次多項(xiàng)回歸模型為：

長裙竹蓀總黃酮得率(mg/g)= 0.80183A+1.45092B+0.90243C+1.16123D-7.00000×10-3AB-3.20000×10-3AC+3.10000×10-3AD+1.25000×10-3BC+1.25000×10-3BD-5.50000×10-3CD-5.25667×10-3A2-0.029417B2-8.20667×10-3C2-0.011657D2-80.84067

對(duì)上述方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。

結(jié)果顯示，模型顯著性檢驗(yàn)P值< 0.0001，為極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.0664>0.05，不顯著，無失擬因素存在。該回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9990，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9980，說明該模型能夠解釋99.90%的變化，因變量與所選自變量之間線性關(guān)系顯著。以上證明該模型與試驗(yàn)擬合度良好，可用該模型代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測和分析。

模型的一次項(xiàng)A、B、C、D為極顯著;二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2為極顯著；交互項(xiàng)AB、AC、AD、CD為極顯著，BC、BD為顯著，由此可知，自變量與響應(yīng)值之間非簡單線性關(guān)系。通過F值可知，各單因素對(duì)長裙竹蓀總黃酮得率的影響程度依次為：超聲溫度>超聲時(shí)間>液料比>乙醇濃度；各兩因素交互作用對(duì)長裙竹蓀總黃酮得率的影響程度依次為：超聲時(shí)間和超聲溫度>乙醇濃度和超聲時(shí)間>乙醇濃度和超聲溫度>液料比和乙醇濃度>液料比和超聲時(shí)間=液料比和超聲溫度。

表4　回歸模型方差分析

注：* 表示P<0.05,**表示P<0.001。

2.2.2響應(yīng)面分析

圖5是按所得數(shù)學(xué)模型繪制的響應(yīng)曲面圖，響應(yīng)曲面的坡度變化及其等高線反映了各因素間交互作用效應(yīng)。其坡度直接反映了在處理?xiàng)l件下發(fā)生變化時(shí)長裙竹蓀總黃酮得率的響應(yīng)靈敏程度，如坡度相對(duì)平緩，響應(yīng)值不敏感；反之，如坡度相對(duì)陡峭，響應(yīng)值敏感。響應(yīng)值隨哪種因素的變化率更大，說明該因素在二者交互作用中對(duì)長裙竹蓀總黃酮得率的影響更大。等高線為橢圓形，說明兩因素交互作用顯著，若偏圓形，說明不太顯著。

從圖5f可知，其等高線為橢圓形，說明超聲時(shí)間和超聲溫度交互作用顯著；響應(yīng)面坡度較為陡峭，響應(yīng)值隨超聲溫度的變化率大于超聲時(shí)間的變化率，說明在二者交互作用中超聲溫度對(duì)總黃酮得率影響大于超聲時(shí)間。而從圖5d可知，其等高線較其他偏圓形，說明液料比和超聲時(shí)間交互作用不太顯著；響應(yīng)面坡度相對(duì)平緩，響應(yīng)值隨超聲時(shí)間的變化率大于液料比的變化率，說明在二者交互作用中超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率影響大于液料比。綜合所有響應(yīng)面圖分析，超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用最顯著，乙醇濃度和超聲時(shí)間、乙醇濃度和超聲溫度、乙醇濃度和液料比次之，液料比和超聲時(shí)間、液料比和超聲溫度最不顯著，其中超聲溫度和超聲時(shí)間較之乙醇濃度和液料比對(duì)響應(yīng)值的影響更大，此結(jié)果與模型中F值分析結(jié)果一致。

2.2.3條件優(yōu)化

根據(jù)響應(yīng)面分析表明： 最佳提取工藝?yán)碚撝凳且掖紳舛?5.48%，液料比16.29∶1，超聲時(shí)間19.17min，超聲溫度56℃。考慮到實(shí)際操作的便利，將長裙竹蓀中總黃酮提取的最佳工藝條件修正為：乙醇濃度75.5%，液料比16.5∶1，超聲時(shí)間19min，超聲溫度56℃。按照修正后的條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表5 所示，長裙竹蓀總黃酮得率實(shí)驗(yàn)值為3.03mg/g，與預(yù)測值3.03mg/g一致，表明試驗(yàn)結(jié)果理想，試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇合理。

圖5　各因素對(duì)總黃酮得率影響的響應(yīng)面分析

項(xiàng)目序號(hào)123平均值總黃酮得率/(mg·g-1)3.023.043.033.03

3結(jié)論

目前，提取黃酮類化合物的方法主要

有水浸提法、酶解法、超臨界萃取法、微波輔助提取法與超聲波輔助提取法等[16～20]，超聲波輔助提取法因操作簡單、方便、能耗低、無副產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞[21]，許多研究者依據(jù)此法獲得了準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，如羅彩林等[22]利用超聲波輔助提取法進(jìn)行大米草總黃酮提取工藝研究，趙強(qiáng)等[23]利用該法進(jìn)行了苦蕎皮總黃酮提取的工藝優(yōu)化,王辰等[24]也利用該法進(jìn)行了葛根黃酮的提取。

因此，本研究采用超聲波輔助乙醇提取法提取長裙竹蓀總黃酮，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，采用4 因素3 水平的響應(yīng)面分析，得出了長裙竹蓀總黃酮的最佳提取工藝條件：乙醇濃度75.5%，液料比16.5∶1，超聲時(shí)間19min，超聲溫度56℃，在此條件下測得長裙竹蓀總黃酮含量為3.03mg/g，可為進(jìn)一步研究竹蓀黃酮類化合物提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2015)15-0067-07

[中圖分類號(hào)]TS201.1