李　敏，陳　強，茅學(xué)群

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

中藥白術(shù)SCAR分子鑒定標記的篩選和克隆

李敏，陳強，茅學(xué)群

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：獲取四種白術(shù)的SCAR分子標記，并對SCAR分子標記進行回收和克隆.利用PCR技術(shù)和10個堿基組成的隨機引物對浙白術(shù)、河北小白術(shù)、湖南平術(shù)、安徽徽術(shù)進行分子鑒定標記的篩選，對分子鑒定標記進行回收和T-載體克隆.利用隨機引物S9，S10經(jīng)PCR技術(shù)，分別從浙白術(shù)和河北小白術(shù)中獲取到SCAR分子標記ZBZ和HBZ，這兩個SCAR標記經(jīng)回收后成功克隆進入T-載體.實驗篩選獲得浙白術(shù)和河北小白術(shù)的SCAR分子標記ZBZ和HBZ，克隆后的SCAR標記經(jīng)測序后，可以為白術(shù)特異性PCR鑒定方法的引物設(shè)計奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：白術(shù)；SCAR分子標記；中藥分子鑒定

The screening and cloning of SCAR molecular marker from

AtractylodesmacrocephaLaKoidz

LI Min, CHEN Qiang, MAO Xuequn

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:A sequence characterized amplified region (SCAR) markers from four kinds of Atractylodes macrocephaLa Koidz was obtained, and then these SCAR markers were recycled and cloned. Methods SCAR markers of Atractylodes macrocephaLa Koidz from Zhejiang, Hebei, Hunan, Anhui province were screened using ten random primers by PCR. The SCAR markers obtained were recycled from the gel and inserted into T-vector to get cloned. According to the PCR results of primers S9 and S10, two SCAR markers from Zhejiang and Hebei province were screened, one named ZBZ, and the other named HBZ. These two SCAR markers successfully had been recycled and cloned into T-vector. Atractylodes macrocephaLa Koidz SCAR marker ZBZ and HBZ obtained from Zhejiang and Hebei province was screened, and then sequenced. The message of the sequence could provide a basis of primer design for Atractylodes macrocephaLa Koidz specific PCR。

Keywords:Atractylodes macrocephaLa Koidz, SCAR, molecular identification of Chinese traditional medicine

中藥白術(shù)是菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephaLaKoidz的干燥根莖，素有“十方九術(shù)”、“北參南術(shù)”之稱，具有治脾益氣，燥濕利水，止汗安胎的功效，在臨床上應(yīng)用廣泛[1].白術(shù)在我國的種植主產(chǎn)地包括浙江、河北、湖南及安徽.浙江磐安、新昌、嵊縣和東陽等地所產(chǎn)品種統(tǒng)稱為“浙白術(shù)”，是道地藥材“浙八味”之一；河北安國盛產(chǎn)“小白術(shù)”，是全國最大的白術(shù)種苗基地；湖南所產(chǎn)白術(shù)中以平江所產(chǎn)最為著名，名為“平術(shù)”；安徽亳州所產(chǎn)白術(shù)，名為“徽術(shù)”.由于白術(shù)種植市場的不斷擴大，種植戶使用的種質(zhì)混雜，種植方法不規(guī)范，以及商家以次充好等原因，導(dǎo)致了目前白術(shù)流通市場的混種情況較為嚴重[2].因此，需要對白術(shù)品種做出準確的鑒定，以保證相關(guān)藥物的質(zhì)量.由于中藥材產(chǎn)地的區(qū)別，有效成分的含量也不同，從而導(dǎo)致藥效存在很大的不同[3].白術(shù)種植地廣，品種多，各品種的外觀和理化性質(zhì)較為接近，使用傳統(tǒng)的中藥鑒定方法較難進行區(qū)分，應(yīng)用中藥分子鑒定方法，可以從白術(shù)的基因分子水平進行鑒定，具有快速、準確及重現(xiàn)性好等優(yōu)點。

SCAR(Sequence characterized amplified region，特征性擴增片段區(qū)域)分子標記是研究對象基因組中特定序列的DNA分子，找到SCAR分子標記，并獲得它的序列，就可以根據(jù)序列設(shè)計特異性引物，對研究對象實現(xiàn)特異性PCR分子鑒定方法[4-5].比較成功的例子有蔣超等人利用SCAR分子標記技術(shù)成功地鑒別出了金銀花的真?zhèn)蝃6]；龍平等應(yīng)用SCAR技術(shù)研究出了基于位點特異性PCR黃芪與紅芪鑒別方法[7].本實驗以四種白術(shù)為研究對象，通過PCR技術(shù)篩選SCAR分子標記，并對SCAR標記進行回收和克隆，為建立白術(shù)特異性PCR分子鑒定方法打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材

實驗所采用的四種白術(shù)新鮮植株于2013年5月—2013年7月分別采自于浙江、河北、湖南和安徽四個白術(shù)主產(chǎn)地，經(jīng)硅膠快速干燥，保存于-70 ℃冰箱備用.以上白術(shù)品種經(jīng)浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院華允芬副教授鑒定為正品.藥材信息詳見表1。

表1四種白術(shù)的產(chǎn)地及種質(zhì)類型

Table 1Origin and type of four kinds ofAtractylodesmacrocephaLaKoidz

序號品種品種地理位置種質(zhì)類型1浙白術(shù)浙江紹興市新昌白術(shù)生產(chǎn)基地大白術(shù)2河北小白術(shù)河北安國市齊村種植基地小白術(shù)3湖南平術(shù)湖南岳陽市平江縣農(nóng)戶半野生白術(shù)4安徽徽術(shù)安徽亳州市大白術(shù)

1.1.2試劑與儀器

植物基因組DNA快速抽提試劑盒，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Minipreps Kit，pUCm-T vector試劑盒，PCR相關(guān)試劑，瓊脂糖，LB培養(yǎng)基，AMP，X-gal，IPTG，10 mg/mL溴化乙錠(EB)溶液，50×TAE緩沖液均購于生工?生物工程(上海)有限公司.My Cycler Thermal Cycler和凝膠成像儀Molecular Imager? Gel Doc XR+ Imaging System均購于Bio-Rad Laboratories, Inc。

1.2室驗方法

1.2.1白術(shù)基因組DNA的提取

取新鮮白術(shù)嫩葉70 mg，用液氮充分研磨.依次加入400 μL的Buffer PCL、20 μL的RNase A和8 μL的β-巰基乙醇，振蕩混勻1 min，置于65 ℃溫浴45 min，間或混勻.加入200 μL的Buffer PP混勻，充分顛倒混勻，-20 ℃冰箱放置5 min.10 000 r/min離心5 min.取上清液加入新的1.5 mL離心管中，加入500 μL的氯仿，顛倒混勻，室溫12 000 r/min離心5 min.取上清液加等體積的異丙醇，4 ℃冰箱過夜，室溫10 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 000 μL的75%乙醇混勻，顛倒混勻1~3 min，10 000 r/min離心5 min，倒去上清液，晾干殘留乙醇，加入800 μL的TE Solution，65 ℃溫浴溶解DNA，-20 ℃保存。

1.2.2白術(shù)基因組DNA的質(zhì)量檢測

制備質(zhì)量分數(shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠，DNA樣品與上樣液混合后加入加樣孔中.凝膠在TAE緩沖液中電泳40~50 min.電泳結(jié)束后將膠塊浸沒于EB染色液中染色10 min，取出后用清水漂洗數(shù)次，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，拍照留存.通過電泳結(jié)果可以初步估計DNA的質(zhì)量，使用紫外-可見光分光光度法可以獲得DNA的純度.DNA樣品經(jīng)過稀釋后，放入紫外-可見光分光光度計中測定260 nm和280 nm波長處的吸光度，兩處波長的吸收值的比例可以顯示樣品的純凈度，DNA樣品的濃度的計算公式：DNA質(zhì)量濃度=A260×稀釋倍數(shù)×50。

1.2.3白術(shù)SCAR標記的篩選

實驗所使用的引物是由10 個堿基組成的單一隨機引物.引物的篩選參考了文獻報道[8-10]，從隨機引物庫中挑選了10 條，由生工?生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見表2.SCAR標記的篩選技術(shù)使用了隨機引物結(jié)合下的PCR反應(yīng).PCR反應(yīng)體系參照文獻[11-14]，設(shè)定為2 μL 10×PCR buffer，1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.5 μL隨機引物(20 μmol/L)，1.2 μL白術(shù)基因組DNA模板，0.3 μL Taq DNA polymerase，補加ddH2O至總體積為20 μL.PCR擴增程序為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，40 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，44 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min.PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，膠塊經(jīng)溴化乙錠染色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，拍照留存。

表2　隨機引物序列

1.2.4白術(shù)SCAR分子標記的回收

用刀片將膠塊中的目的條帶切下，放置已滅菌的1.5 mL離心管中，稱重.按照100 mg膠塊加300~600 μL的Buffer B2的比例向離心管中加入試劑.將離心管放置溫度為50 ℃的水浴鍋中水浴15 min，間斷性混勻，直至膠塊溶化，不再出現(xiàn)固體為止.將上述得到的溶液全部移入吸附柱中，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入上述收集管中.加入500 μL的Wash Solution于吸附柱中，轉(zhuǎn)速為9 000 r/min離心30 s，再次倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入原來的收集管中.上述步驟重復(fù)一次.將得到的空吸附柱和收集管放入離心機，轉(zhuǎn)速為9 000 r/min離心1 min.把吸附柱放入一干凈的1.5 mL的EP管中，在吸附膜中央加入30 μL的Elution Buffer，室溫放置1~2 min，9 000r/min離心1 min，DNA溶液置于-20 ℃保存.回收產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠來檢測回收效果。

圖1　pUCm-T質(zhì)粒圖Fig.1　pUCm-T vector

1.2.5白術(shù)SCAR分子標記的克隆

按照pUCm-T試劑盒說明，將回收得到的SCAR分子標記與pUCm-T載體(質(zhì)粒圖譜見圖1)進行連接：在0.6 mL的微型離心管中依次加入1 μL的10×Ligation Buffer，1 μL的50%PEG，1 μL的pUCm-T vector，4 μL的純化后的回收產(chǎn)物，最后加1 μL的T4 DNA Ligase，補加ddH2O至10 μL，連接反應(yīng)體系混勻后在20 ℃水浴中反應(yīng)30 min.同時根據(jù)感受態(tài)細胞制備盒的操作方法制備DH5α感受態(tài)細胞.將連接產(chǎn)物與受體細胞按照1∶20的比例量導(dǎo)入受體細胞，涂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜.采用藍白斑篩選法得到陽性克隆.通過EZ-10 Spin column plasmid DNA minipreps kit試劑盒得到重組質(zhì)粒。

將所得到的重組質(zhì)粒作為DNA模板，相應(yīng)隨機引物作為引物，對重組質(zhì)粒進行PCR擴增，PCR擴增反應(yīng)體系：2 μL 10×PCR buffer，1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.5 μL隨機引物(20 μmol/L)，1.2 μL重組質(zhì)粒DNA，0.3 μL Taq DNA polymerase，補加ddH2O至總體積為20 μL.PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，40 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，44 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min.重組質(zhì)粒和PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1白術(shù)基因組DNA的提取及質(zhì)量檢測

從四種白術(shù)嫩葉中提取獲得的白術(shù)基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果，見圖2.從圖2中可知：白術(shù)基因組DNA片段大小在23 kb左右，條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，說明提取獲得的白術(shù)基因組DNA純度較高，所含雜質(zhì)較少，DNA質(zhì)量較高，DNA分子完整無降解.紫外-可見光分光光度法測定白術(shù)基因組DNA的相關(guān)數(shù)據(jù)見表3，表3的數(shù)據(jù)顯示四種白術(shù)基因組DNA的OD260/OD280值均在1.8~1.9之間，DNA質(zhì)量濃度在120~240 μg/mL之間，說明白術(shù)基因組DNA的純度較高，質(zhì)量較好，為后續(xù)實驗提供了優(yōu)質(zhì)模板。

2.2白術(shù)SCAR分子標記的篩選

M—Marker；1—浙白術(shù)基因組DNA；2—河北小白術(shù)基因組DNA；3—湖南平術(shù)基因組DNA；4—安徽徽術(shù)基因組DNA圖2　四種白術(shù)基因組DNA電泳圖Fig.2　Genomic DNA isolated from four kinds of Atractylodes macrocephaLa Koidz

Table 3The concentration of genomic DNA ofAtractylodesmacrocephaLaKoidz

序號品種OD260OD280OD260/OD280DNA質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)1浙白術(shù)0.1750.0961.8221752河北小白術(shù)0.2400.1301.8432403湖南平術(shù)0.1210.0661.8351214安徽徽術(shù)0.2370.1271.861237

以四種白術(shù)基因組DNA為模板，逐一使用10條隨機引物進行PCR擴增.湖南平術(shù)和安徽徽術(shù)在10 種隨機引物結(jié)合下的PCR擴增結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)特異性片段.S9(5′-3′：TGGGGGACTC)和S10(5′-3′：CTGCTGGGAC)結(jié)合下的PCR擴增圖譜中發(fā)現(xiàn)了浙白術(shù)和河北小白術(shù)的特異性擴增條帶(圖3,4).如圖3所示，S9結(jié)合下的PCR擴增結(jié)果中，浙白術(shù)在550 bp左右(箭頭所示處)出現(xiàn)了一條擴增條帶，這條條帶只在浙白術(shù)品種中出現(xiàn)，在其他三個白術(shù)中不存在，因此，550 bp處的浙白術(shù)擴增條帶可以作為浙白術(shù)SCAR標記，命名為ZBZ.如圖4所示，S10結(jié)合下的PCR擴增結(jié)果中，河北小白術(shù)在800 bp(箭頭所示處)位置出現(xiàn)了一條擴增條帶，這條條帶只在河北小白術(shù)品種中出現(xiàn)，在其他三個白術(shù)中不存在，因此，800 bp處的河北小白術(shù)擴增條帶可以作為河北小白術(shù)SCAR標記，命名為HBZ.ZBZ和HBZ分子量大小適中，條帶清晰明亮，是質(zhì)量較佳的SCAR標記。

M—Marker；1—以浙白術(shù)基因組DNA為模板的擴增結(jié)果；2—以河北小白術(shù)基因組DNA為模板的擴增結(jié)果；3—以湖南平術(shù)基因組DNA為模板的擴增結(jié)果；4—以安徽徽術(shù)基因組DNA為模板的擴增結(jié)果圖3　引物S9的PCR擴增圖Fig.3　PCR products by S9

M—Marker；1—以浙白術(shù)基因組DNA為模板的擴增結(jié)果；2—以河北小白術(shù)基因組DNA為模板擴增結(jié)果；3—以湖南平術(shù)基因組DNA為模板的擴增結(jié)果；4—以安徽徽術(shù)基因組DNA為模板的擴增結(jié)果圖4　引物S10的PCR擴增圖Fig.4　PCR products by S10

2.3白術(shù)SCAR分子標記的回收

用刀片將浙白術(shù)和小白術(shù)的SCAR標記從凝膠中小心切下來，兩個SCAR標記分子經(jīng)膠回收試劑盒回收后進行凝膠電泳分析，實驗結(jié)果見圖5.從圖5可見：第一泳道在800 bp處出現(xiàn)一條條帶，分子量大小與小白術(shù)SCAR標記一致；第二泳道在550 bp出現(xiàn)一條條帶，分子量大小與浙白術(shù)SCAR標記一致.兩條回收條帶清晰明亮，說明浙白術(shù)和小白術(shù)的SCAR標記分子已經(jīng)被成功回收。

M—Marker；1—河北小白術(shù)SCAR分子標記的回收結(jié)果；2—白術(shù)SCAR分子標記的回收結(jié)果圖5　白術(shù)SCAR分子標記的回收電泳圖Fig.5　SCAR recycling of Atractylodes macrocephaLa Koidzs

2.4SCAR分子標記的克隆

將回收獲得的浙白術(shù)和小白術(shù)SCAR分子標記分別與T-載體pUCm-T連接，篩選出陽性克隆子.使用PCR方法對陽性克隆進行鑒定，獲得重組質(zhì)粒.重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果見圖6，7.在圖6中，第一泳道為含有小白術(shù)SCAR標記的重組質(zhì)粒A，第二泳道為以重組質(zhì)粒A為模板，S10引物結(jié)合下的PCR擴增結(jié)果，在800 bp處可見一條擴增條帶，分子大小與小白術(shù)SCAR標記一致，條帶清晰明亮，無雜帶出現(xiàn)，說明小白術(shù)SCAR標記HBZ已成功插入pUCm-T載體中.在圖7中，第一泳道為含有浙白術(shù)SCAR標記的重組質(zhì)粒B，第二泳道為以重組質(zhì)粒B為模板，S9引物結(jié)合下的PCR擴增結(jié)果，在600 bp處可見一條擴增條帶，分子大小與浙白術(shù)SCAR標記一致，條帶清晰明亮，無雜帶出現(xiàn)，說明浙白術(shù)SCAR標記ZBZ已成功插入pUCm-T載體中.重組質(zhì)粒A和B在膠中均顯示出三條條帶，從上至下分別代表開環(huán)DNA，線性DNA，超螺旋DNA，說明重組質(zhì)粒質(zhì)量較好，可以為后續(xù)的測序和設(shè)計引物工作打下基礎(chǔ)，為最終實現(xiàn)白術(shù)分子鑒定創(chuàng)造條件。

M—Marker；1—重組質(zhì)粒A；2—重組質(zhì)粒A以S10為引物的PCR擴增結(jié)果圖6　重組質(zhì)粒及以S10為引物的PCR擴增圖Fig.6　Recombinant plasmid and PCR product by S10

M—Marker；1—重組質(zhì)粒B；2—重組質(zhì)粒B以S9為引物的PCR擴增結(jié)果圖7　重組質(zhì)粒及以S9為引物的PCR擴增圖Fig.7　Recombinant plasmid and PCR product by S9

3結(jié)論

通過隨機引物結(jié)合下的PCR技術(shù)對四種不同產(chǎn)地白術(shù)進行SCAR分子標記的篩選，成功獲得了河北小白術(shù)SCAR分子標記HBZ和浙白術(shù)SCAR分子標記ZBZ.將HBZ和ZBZ回收并插入至克隆載體pUCm-T vector后得到的重組質(zhì)粒通過PCR方法實現(xiàn)了鑒定，具有操作簡單，結(jié)果可靠等優(yōu)點.安徽徽術(shù)和湖南平術(shù)尚未獲得理想的SCAR標記，今后擬選取更多的隨機引物，以期篩選得到SCAR標記.這兩個品種未能獲得SCAR也提示它們的親緣性可能較接近，基因相似度較高，因此要獲得SCAR標記難度較大.目前，河北小白術(shù)和浙白術(shù)SCAR分子標記的序列測定及分析工作正在進行中.實驗成果為最終建立白術(shù)特異性PCR分子鑒定方法打下了基礎(chǔ)，也為其他中藥品種的SCAR標記研究提供了參考。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中國人民共和國藥典：第一卷[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010:95。

[2]王宗寬，曹煒，夏強強，等.白術(shù)不同居群親緣關(guān)系RAPD分析[J].安徽林業(yè)科技，2011,37(1)：14-17。

[3]郭輝，高帥，張祎，等.15種竹葉中碳苷黃酮的含量研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014,42(1)：37-44。

[4]LU K T, LEE H C, LIU F C, et al. Discriminating astragali radix from hedysarum radix in Chinese medicine preparations using nested PCR and DNA sequencing methods[J]. Journal of Food and Drug Analysis,2009,17(5):380-385。

[5]HUH M K, BANG, K H. Identification of atractylodes Japonica and a-macrocephala by RAPD analysis and SCAR markers[J]. Silvae Genetica,2006,55(3):101-105。

[6]蔣超，張雅華，陳敏，等.基于雙向位點特異性PCR的金銀花真?zhèn)舞b別方法研究[J].中國中藥雜志，2012,37(24):3752-3757。

[7]龍平，崔占虎，李虔全，等.基于位點特異性PCR的黃芪與紅芪鑒別方法研究[J].中國中藥雜志，2013,38(16):2561-2585。

[8]孫靚，鄭玉光，袁媛，等.白術(shù)遺傳多樣性ISSR分析[J].中國中藥雜志，2012,37(22)：3381-3385。

[9]李翼飛，趙月萍，沈青，等.白術(shù)不同性狀RAPD標記[J].江蘇林業(yè)科技，2011,38(5):17-19

[10]朱振洪，劉文洪，余勤，等.四種不同產(chǎn)地白術(shù)的DNA隨機擴增多態(tài)性研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011,35(4)：575-577。

[11]李敏，趙欣.三種南方貝母RAPD的分析[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012,40(6)：634-639。

[12]夏銘，欒非時，李景鵬.RAPD影響因素的研究及實驗條件的優(yōu)化進[J].植物研究，19(2):195-200。

[13]李敏，黃龍妹，陳強.RAPD技術(shù)篩選麥冬分子鑒定標記的研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014,42(5)：504-508。

[14]李敏，黃龍妹，趙欣，等.浙貝母特異性PCR鑒定方法研究[J].中草藥，2014,45(12):1754-1757。

(責(zé)任編輯：陳石平)

中圖分類號：R282.5

文獻標志碼：A

文章編號：1006-4303(2015)02-0148-06

作者簡介：李敏(1975—)女，浙江杭州人，副教授，博士，主要從事中藥和腫瘤標志物分子鑒定的研究，E-mail:limin@zjut.edu.cn。

收稿日期：2014-11-06