徐　宇，鐘立強(qiáng)，2，李瀟軒，朱錫和，王崇華，史楊白

(1：江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，南京 210017)

(2：農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省淡水水產(chǎn)研究所，湖州 313001)

5個(gè)湖泊河川沙塘鱧(Odontobutispotamophila)種群線粒體細(xì)胞色素b基因的遺傳變異分析*

徐宇1，鐘立強(qiáng)1，2，李瀟軒1，朱錫和1，王崇華1，史楊白1*

(1：江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，南京 210017)

(2：農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省淡水水產(chǎn)研究所，湖州 313001)

摘要：通過對(duì)5個(gè)湖泊的河川沙塘鱧種群的線粒體DNA細(xì)胞色素b基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，獲得1141bp的序列全長(zhǎng).序列分析顯示，cyt b基因序列中A+T含量(55.8%)略高于G+C含量(44.2%)，共檢測(cè)到806個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，115個(gè)樣本得到87個(gè)單倍型，平均單倍型多樣性為0.969±0.012，核苷酸多樣性為0.20081±0.00742，遺傳多樣性表現(xiàn)高度多樣性.太湖種群與大縱湖種群間的遺傳距離最近，為0.137，巢湖種群和大縱湖種群之間遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.424.分子方差分析表明，群體間遺傳分化系數(shù)Fst為0.531，變異來自群體內(nèi)及群體間.cyt b基因序列構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，5個(gè)種群分化成不同的分支系譜，種群間存在的基因交流較少.

關(guān)鍵詞：河川沙塘鱧；線粒體DNA；細(xì)胞色素b基因；遺傳變異

*江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2011331)、江蘇省水產(chǎn)三新工程重大項(xiàng)目(D2013-1)和農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(ZJK2013132)聯(lián)合資助.2014-05-12收稿；2014-11-06收修改稿.徐宇(1986～)，女，碩士，研究實(shí)習(xí)員；E-mail：jsgyxuyu@126.com.

河川沙塘鱧(Odontobutispotamophila)隸屬于鱸形目(Perciformes)、鰕虎魚亞目(Gobioidei)、塘鱧科(Eleotridae)、沙塘鱧屬(Odontobutis)，是一種較為名貴的小型經(jīng)濟(jì)魚類，主要分布于長(zhǎng)江中、下游及沿江各支流，錢塘江水系，閩江水系，偶見于黃河水系[1].該魚個(gè)體雖小，但含肉量高、肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在江、浙、滬等地區(qū)歷來被視為名貴魚類，深受消費(fèi)者喜愛[2].近年來，價(jià)格更是一路攀升，已成為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ乃a(chǎn)養(yǎng)殖新品種.

近年來隨著DNA分子技術(shù)的快速發(fā)展，從分子水平研究魚類物種間的親緣關(guān)系及進(jìn)行物種鑒定已成為可能.線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，由于呈母性遺傳特點(diǎn)，復(fù)制過程中缺乏修復(fù)機(jī)制，導(dǎo)致序列的累積變異速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于核基因組的變異速率，進(jìn)化速度快且不發(fā)生重組，已成為群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育等研究的理想分子標(biāo)記[3-4].細(xì)胞色素b(cytb)基因?yàn)閙tDNA上的蛋白質(zhì)編碼基因，進(jìn)化速度適中，且容易使用一些通用引物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，因此適合進(jìn)行種間到種內(nèi)水平上的系統(tǒng)發(fā)生研究，在魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中有著廣泛的應(yīng)用[5-7].目前，通過線粒體DNA不同區(qū)域和基因序列對(duì)沙塘鱧種群的遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)演化關(guān)系已經(jīng)進(jìn)行了一些研究.謝楠等[8-9]對(duì)河川沙塘鱧線粒體cytb基因序列分析，并與塘鱧科其余種類進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建鱧科魚類系統(tǒng)發(fā)育樹.郁建鋒等[10]對(duì)太湖流域河川沙塘鱧線粒體12S和16S rRNA基因序列進(jìn)行分析，表明太湖流域河川沙塘鱧有別于其他類別的沙塘鱧，且與已知的河川沙塘鱧存在分子遺傳進(jìn)化差異.李妍等[11]采用簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)河川沙塘鱧2個(gè)群體進(jìn)行遺傳分析，表明2個(gè)群體的遺傳分化已經(jīng)達(dá)到種群分化水平.侯新遠(yuǎn)等[12]基于線粒體D-loop基因序列研究我國5種蝦虎魚類的親緣關(guān)系，而目前對(duì)長(zhǎng)江水系內(nèi)部不同湖泊和流域的河川沙塘鱧遺傳結(jié)構(gòu)分析還未見報(bào)道.本研究采集長(zhǎng)江中下游鄱陽湖、巢湖、大縱湖、固城湖、太湖5個(gè)湖泊的河川沙塘鱧種群，通過mtDNA cytb基因核苷酸序列的比較分析，探討5個(gè)湖泊的河川沙塘鱧種群遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系，以深入了解5個(gè)湖泊河川沙塘鱧種群的遺傳背景和種質(zhì)資源現(xiàn)狀，以利于在沙塘鱧育種中更好地發(fā)掘其遺傳潛力，為沙塘鱧多性狀復(fù)合育種技術(shù)的研究及新品系選育積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料和方法

1.1 研究材料

實(shí)驗(yàn)所用野生河川沙塘鱧(Odontobutispotamophila)采集于5個(gè)湖泊，分別是長(zhǎng)江流域的鄱陽湖、巢湖和太湖，江蘇省南京高淳的固城湖以及鹽城市的大縱湖，每個(gè)種群采集樣本數(shù)見表1，剪取活魚尾鰭，固定于無水乙醇中，放入4℃冰箱保存.

1.2 DNA提取

基因DNA提取參照Sambrook等[13]的方法.DNA濃度、質(zhì)量分別用分光光度儀(Unico UV-4802H)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).總DNA稀釋至100ng/μl，于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

cytb擴(kuò)增和測(cè)序的引物為通用引物L(fēng)14724和H15915[14]，引物序列為L(zhǎng)14724：5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′；H15915：5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.PCR反應(yīng)體系為50μl：模板DNA 50ng；2×PCR Mix 25μl(包含Taq酶2.5U，dNTPs 10μmol，MgCl20.1mmol)，上、下游引物(10μmol/L)各1μl，其余體積用雙蒸水補(bǔ)足.反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，94℃變性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，經(jīng)35個(gè)循環(huán)后再72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后，直接送至南京思普金生物科技有限公司利用正反引物進(jìn)行雙向測(cè)序.

1.4 數(shù)據(jù)分析

DNA序列用BioEdit 7.0.5[15]軟件比對(duì)剪切序列，MEGA 4.1軟件[16]計(jì)算堿基含量，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.通過DnaSP軟件[17]計(jì)算變異位點(diǎn)，單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)(h)、平均核苷酸差異數(shù)(K)和核苷酸多樣性指數(shù)(π)等，用Arlequin 3.01軟件[18]中的Kimura 2-Parameters方法構(gòu)建5個(gè)湖泊河川沙塘鱧種群間的相對(duì)遺傳距離，用分子方差分析(AMOVA)方法計(jì)算遺傳分化系數(shù)(Fst)并分析遺傳變異來源與組成.

2 結(jié)果

2.1 序列特征

經(jīng)Bioedit軟件對(duì)5個(gè)湖泊河川沙塘鱧種群115個(gè)個(gè)體的mtDNA cytb序列進(jìn)行比對(duì)剪切，獲得1141bp的序列全長(zhǎng)，并全部提交至GenBank，登錄號(hào)為：KM924174～KM924288，MEGA 4.1軟件分析115個(gè)序列的堿基組成平均為T(28.1%)、C(28.8%)、A(27.7%)、G(15.4%)，A+T含量為55.8%，略高于G+C含量(44.2%).DnaSP軟件分析顯示，共有806個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，約占核苷酸總數(shù)的70.64%，單態(tài)突變位點(diǎn)(singleton sites)163個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(parsimony informative sites)643個(gè)；同時(shí)還檢測(cè)到344個(gè)插入或缺失位點(diǎn)，堿基插入或缺失主要以C或G單核苷酸重復(fù)片段的形式進(jìn)行.115個(gè)個(gè)體中共檢出87種單倍型序列.5個(gè)種群的平均h值為0.969±0.012，π為0.20081±0.00742(表1).5個(gè)湖泊河川沙塘鱧種群中，大縱湖和鄱陽湖種群的h最高，固城湖種群的π最高，而太湖種群的h和π均最低.

表1 5個(gè)河川沙塘鱧種群的單倍型及遺傳多樣性參數(shù)

2.2 群體變異和遺傳結(jié)構(gòu)

將測(cè)序獲得的115個(gè)個(gè)體的mtDNA序列輸入Arlequin軟件，使用Kimura 2-Parameters方法構(gòu)建5個(gè)湖泊種群間的相對(duì)遺傳距離和Fst(表2).從遺傳距離來看，巢湖種群與大縱湖種群間的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.424)，遺傳距離最近的是大縱湖種群與太湖種群(0.137)；種群內(nèi)部遺傳距離從大到小依次為：固城湖(0.237)>大縱湖(0.189)>鄱陽湖(0.143)>巢湖(0.092)>太湖(0.056).5個(gè)種群的平均Fst為0.531，5個(gè)湖泊河川沙塘鱧種群間存在顯著性遺傳變異(P<0.05).

表2 5個(gè)河川沙塘鱧種群間Kimura 2-Parameters遺傳距離和Fst

***對(duì)角線下數(shù)值表示群體間遺傳距離；***對(duì)角線上數(shù)值表示種內(nèi)分化系數(shù).

為進(jìn)一步分析種群間的相互遺傳差別，通過Arlequin軟件中AMOVA法估算5個(gè)種群間的遺傳變異結(jié)構(gòu)及來源.AMOVA結(jié)果顯示，5個(gè)河川沙塘鱧種群內(nèi)和種群間均具有很高的遺傳變異.種群間的變異占總變異的53.15%，而種群內(nèi)的變異占總變異的46.85%(表3).分析單倍型數(shù)據(jù)所得遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.07743，基因流(Nm)為2.98；而115個(gè)個(gè)體的Gst為0.47076，Nm為0.28.

表3 5個(gè)河川沙塘鱧種群間遺傳差異的分子方差分析

2.3 聚類分析

將115個(gè)河川沙塘鱧個(gè)體的mtDNA cytb序列輸入MEGA 4.1軟件，對(duì)5個(gè)湖泊種群進(jìn)行聚類分析，得到UPGMA聚類樹(圖1).5個(gè)河川沙塘鱧地理種群沒有明顯聚類，形成了單系類群，太湖與大縱湖、固城湖種群首先聚為一支，接著與巢湖、鄱陽湖種群聚成的一支匯合.各單倍型存在相互散布在不同地理種群中的現(xiàn)象.

圖1 5個(gè)河川沙塘鱧種群的UPGMA聚類樹Fig.1 Dendrogram of five populations of O. potamophila by UPGMA method

2.4 種群擴(kuò)張

用Fu[19]的Fs中性檢驗(yàn)檢驗(yàn)5個(gè)湖泊河川沙塘鱧種群的顯著偏離中性突變：Fs>0，表明種群趨于穩(wěn)定；Fs<0，表明種群趨于擴(kuò)張.結(jié)果顯示，種群的整體Fs=1.122(P>0.05)，表明5個(gè)河川沙塘鱧種群整體上趨于穩(wěn)定，同時(shí)巢湖、固城湖、鄱陽湖和太湖種群的Fs>0，而大縱湖種群Fs<0.

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性的研究是生物多樣性研究的重要內(nèi)容，只有通過遺傳多樣性的研究才能從本質(zhì)上揭示物種多樣性的起源、變異和進(jìn)化.本研究中5個(gè)湖泊河川沙塘鱧種群cytb序列的堿基組成為T(28.1%)、C(28.8%)、A(27.7%)、G(15.4%)，其中G含量顯著低于其他堿基含量，表現(xiàn)出明顯的反G偏倚，顯示出cytb基因的共同特征[20]，同時(shí)這也是線粒體DNA的一個(gè)特點(diǎn)[21].本研究中河川沙塘鱧A+T含量為55.8%，略高于G+C含量(44.2%)，與謝楠等[9]關(guān)于河川沙塘鱧cytb基因序列的分析結(jié)果一致.

在5個(gè)湖泊河川沙塘鱧種群中的115個(gè)個(gè)體共檢測(cè)出87個(gè)單倍型，表明河川沙塘鱧群體存在豐富的mtDNA多態(tài)性.與其他淡水魚類(黃顙魚[22]、烏鱧[23]、淮河野生鲇魚[24])相比，河川沙塘鱧平均h和π相對(duì)較高(h=0.969±0.012，π=0.20081±0.00742)，顯示較高的遺傳多樣性，同時(shí)符合Grant等[25]提出的魚類不同單倍型多樣性與核苷酸多樣性間組合的第2種類型，即高h(yuǎn)和低π.而河川沙塘鱧表現(xiàn)出較高h(yuǎn)、低π特征，這可能是由于河川沙塘鱧生命周期短，使其能在較短時(shí)間內(nèi)積累較多的變異，表現(xiàn)出較高的單倍型多樣性，但短時(shí)間內(nèi)又不能積累足夠的核苷酸多樣性，從而導(dǎo)致種群核苷酸多樣性較低[26].

5個(gè)湖泊中太湖種群河川沙塘鱧的h和π均為最低，這可能是由于太湖流域工業(yè)發(fā)達(dá)、污染嚴(yán)重，藍(lán)藻水華暴發(fā)導(dǎo)致太湖水質(zhì)惡化，魚類大量死亡，河川沙塘鱧喜棲息于水質(zhì)良好的水域中，環(huán)境污染破壞其棲息地，也勢(shì)必導(dǎo)致群體急劇下降.同時(shí)為了治理太湖水質(zhì)，太湖的各個(gè)入湖和出湖水道上都修建了大量的水利設(shè)施，河川沙塘鱧種群也處于隔離狀態(tài)，造成太湖流域河川沙塘鱧群體遺傳多樣性喪失.

3.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)與基因流

本研究中，AMOVA對(duì)遺傳變異的分析表明，全部遺傳變異的53.15%來自種群間，46.85%來自種群內(nèi)部，說明河川沙塘鱧各種群間以及各種群內(nèi)個(gè)體間的遺傳多樣性均較高.種群間的遺傳距離以及Fst是衡量種群多態(tài)程度的重要指標(biāo).二者的值越大，種群多態(tài)性程度越高[27].本研究中，河川沙塘鱧的遺傳距離在0.137～0.424之間，根據(jù)遺傳距離對(duì)物種的分類依據(jù)表明河川沙塘鱧無論是群體內(nèi)還是群體間序列差異都較大[28-29]，整體上反映了各地理種群之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這也與AMOVA對(duì)遺傳變異的分析結(jié)果一致.而5個(gè)湖泊河川沙塘鱧種群間的Fst為0.531，說明5個(gè)河川沙塘鱧種群間存在較高的遺傳分化[30].種群間的遺傳距離分析與Fst的分析結(jié)果相一致.

本研究中單倍型之間的Nm為2.98，單倍型Gst為0.07743，115個(gè)個(gè)體的Nm為0.28，Gst為0.47076，表明5個(gè)湖泊種群間存在基因流動(dòng)較小，這可能與河川沙塘鱧的生活習(xí)性相關(guān)，河川沙塘鱧的游泳能力較弱，可能會(huì)導(dǎo)致群體間的基因交流較少.這與呂國慶的研究一致，認(rèn)為種群之間的遺傳變異程度也與其生態(tài)習(xí)性及生活史密切相關(guān)[31].

本研究結(jié)果也與李妍等[11]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)江蘇常熟河川沙塘鱧個(gè)體大小不等的2個(gè)群體進(jìn)行遺傳分析的結(jié)果類似，江蘇常熟河川沙塘鱧2個(gè)群體的遺傳分化已經(jīng)達(dá)到種群分化水平.同時(shí)郁建鋒等[10]通過分析太湖流域河川沙塘鱧線粒體12S和16S rRNA基因序列分析表明，在12S、16S rRNA基因水平上太湖流域河川沙塘鱧與其他沙塘鱧甚至是其他地區(qū)的河川沙塘鱧之間存在分子差異，這可能是與沙塘鱧長(zhǎng)期的區(qū)域化生長(zhǎng)繁殖有關(guān)，造成太湖流域河川沙塘鱧12S、16S rRNA基因不同程度的變異、分化，并被積累下來.

5個(gè)湖泊河川沙塘鱧種群UPGMA聚類樹分析表明，5個(gè)地理種群沒有明顯聚類，形成了單系類群，各單倍型存在相互散布在不同地理種群中的現(xiàn)象，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)受樣本數(shù)的局限，種群遺傳多樣性和種群進(jìn)化的具體參數(shù)等有待于今后進(jìn)一步的研究.此外，僅靠mtDNA cytb基因來評(píng)估河川沙塘鱧不同種群的遺傳多樣性和特征是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，要深入了解其遺傳背景還需要綜合運(yùn)用多種分子標(biāo)記手段(如簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)、擴(kuò)增酶切片斷多態(tài)性(AFLP)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等)進(jìn)一步研究河川沙塘鱧的遺傳多樣性及其適應(yīng)機(jī)制.

河川沙塘鱧是我國一種傳統(tǒng)的名貴食用魚類，在我國廣泛分布于長(zhǎng)江中下游、錢塘江、閩江等水系，具有一定的漁業(yè)價(jià)值.近年來，由于自然資源過度利用、天然水域環(huán)境污染加劇等因素，沙塘鱧自然產(chǎn)量明顯減少，據(jù)本課題組2008-2010年調(diào)查，江蘇省蘇北地區(qū)水域中已很難捕獲，并且有趨于滅絕的危險(xiǎn).本研究對(duì)河川沙塘鱧mtDNA cytb基因的遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)及變異水平進(jìn)行探討，為河川沙塘鱧的種質(zhì)資源評(píng)估提供基礎(chǔ)材料.本研究表明，5個(gè)湖泊的河川沙塘鱧種群具有較高的遺傳變異，過度捕撈、生態(tài)環(huán)境的破壞以及人工繁殖數(shù)代退化后的種苗流入自然水域，加之河川沙塘鱧的基因流動(dòng)較少，會(huì)造成野生資源的進(jìn)一步退化.因此，急需加強(qiáng)對(duì)河川沙塘鱧野生種質(zhì)資源的保護(hù)，建立規(guī)范的良種保種和選育基地，在保證種群自然擴(kuò)張、提高遺傳多樣性的同時(shí)，保護(hù)種質(zhì)資源，維護(hù)良種的純度和遺傳穩(wěn)定性，還能大量供應(yīng)市場(chǎng)，滿足廣大人民群眾的消費(fèi)需求.

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?2015 byJournalofLakeSciences

Genetic variation analysis ofOdontobutispotamophilafrom five lakes based on Mitochondrial DNA cytb

XU Yu1， ZHONG Liqiang1，2， LI Xiaoxuan1， ZHU Xihe1，WANG Chonghua1& SHI Yangbai1

(1：FreshwaterFisheriesResearchInstituteofJiangsuProvince，Nanjing210017，P.R.China)

(2： Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province，Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries，Huzhou 313001， P.R.China)

Abstract：The mtDNA cyt b gene of Odontobutis potamophila from five lakes was amplified and sequenced. Result showed that the average content of A+T(55.8%) was a little higher than that of G+C(44.2%)，in the aligned sequences of 1141bp. 806 variable sites were detected and 87 haplotypes were recovered. The haplotypes diversity and nucleotide diversity were 0.969±0.012 and 0.20081±0.00742， respectively. The genetic distance between Lake Taihu population and Lake Dazonghu population displayed the lowest， up to 0.137， while that between Lake Chaohu population and Lake Dazonghu population was the highest to 0.424.The fixation indices of analysis of molecular variance among populations was 0.531， The phylogenetic tree of cyt b built with MEGA 4.1 showed that five populations were clustered into clades based on genetic distance. There was little general flow between O. potamophila populations from five lakes.

Keywords：Odontobutis potamophila； Mitochondrial DNA； cyt b； genetic variation

通信作者**；E-mail：shiyangbai@126.com.

DOI10.18307/2015.0418