扶 雄,李湘師,游麗君,,*,劉 冬

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640;2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 深圳市發(fā)酵精制檢測(cè)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東深圳 518055)

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不同提取方法對(duì)海蒿子多糖性質(zhì)的影響研究

扶 雄1,李湘師1,游麗君1,2,*,劉 冬2

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640;2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 深圳市發(fā)酵精制檢測(cè)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東深圳 518055)

海蒿子多糖是存在于海洋褐藻植物海蒿子細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的一種天然大分子物質(zhì),具有多種生物活性。本研究比較了傳統(tǒng)水提法、檸檬酸提取法、超聲法、超聲波輔助水提法、超聲波輔助檸檬酸提取法五種方法提取海蒿子多糖的性質(zhì)區(qū)別。結(jié)果表明采用檸檬酸法提取海蒿子多糖得率最高,可達(dá)5.31%,是傳統(tǒng)水提法的1.8倍。并且,不同方法提取的海蒿子多糖分子量大小存在差異性,其中傳統(tǒng)水提法提取多糖的分子量為739.663ku,約是超聲法提取多糖分子量大小的19倍。通過(guò)不同抗氧化能力評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定表明傳統(tǒng)水提法提取多糖的DPPH·清除能力在濃度0.5mg/mL時(shí)為54.77%,ABTS+清除能力在濃度0.25mg/mL時(shí)為74.59%,還原力在濃度0.3mg/mL時(shí)為1.381,氧自由基吸收能力(ORAC)值可達(dá)5404.90μmol Trolox/g。且硫酸基含量最高,為12.28%,具有較好的抗氧化活性。因此,采用傳統(tǒng)水提法工藝來(lái)提取多糖更利于維持海蒿子多糖的功能活性,便于進(jìn)一步的深入研究。

海蒿子,多糖,檸檬酸提取,分子量,抗氧化

海蒿子(Sargassumpallidum)習(xí)稱“大葉海藻”,是生長(zhǎng)在暖溫帶水域的褐藻門(Brown algae)馬尾藻科(Sargassacean)植物,在我國(guó)的渤海、黃海、東海等區(qū)有廣泛的分布。顏色為暗褐色,是典型的海洋褐藻,性味苦咸,寒。入脾、腎、肺。功能主治利水,泄熱,疼痛核腫,慢性氣管炎等,在《本經(jīng)》《別錄》《藥性論》《海藥本草》等中均有記載,具有很高的藥用價(jià)值。對(duì)褐、紅、藍(lán)、綠海藻的多糖研究表明褐藻多糖具有比較顯著的生物活性,開(kāi)發(fā)前景十分廣闊。海蒿子作為歷代本草收錄的海洋褐藻之一,不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,如:蛋白質(zhì)(親糖蛋白)、藻膠酸、不飽和脂肪酸、鉀、碘外,而且含有大量的褐藻多糖,主要組成包括褐藻膠、褐藻糖膠和褐藻淀粉。褐藻多糖是一種水溶性活性多糖,是國(guó)內(nèi)外關(guān)于海洋藻類活性物質(zhì)研究的熱點(diǎn)之一。已發(fā)現(xiàn)的褐藻門馬尾藻科植物的活性多糖具有抗血栓[1]、抗病毒[2]、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)功能[3]等,但目前關(guān)于海蒿子活性多糖方面的研究有少量報(bào)道,內(nèi)容涉及抗氧化、抗腫瘤[4]、降血脂[5]等方面。因此,有必要進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)海蒿子活性多糖的提取和功效研究,以便開(kāi)發(fā)利用豐富的海洋藻類資源。

植物多糖的提取廣泛采用水溶劑,且在酸溶液或超聲波環(huán)境下可強(qiáng)化多糖的提取。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)水提法、檸檬酸提取法、超聲法、超聲波輔助水提法和超聲波輔助檸檬酸法五種方法提取海蒿子多糖,并比較不同方法對(duì)海蒿子多糖的得率、分子量、硫酸基含量以及抗氧化活性的影響,為海蒿子多糖的活性研究和開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海蒿子 購(gòu)自元真堂；ABTS(2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothia-zoline-6-sulfonic acid))、Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)、AAPH(2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)-dihydrochloride)、DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)、Fluorescein均購(gòu)自Sigma公司。磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水乙醇、95%乙醇、苯酚、檸檬酸、鐵氰化鉀、過(guò)硫酸鉀、硫酸鉀、三氯乙酸、明膠、氯化鋇、氯化鐵、葡萄糖均為分析純。VC為食品級(jí)。

中藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RV10數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 廣州市東南科創(chuàng)科技有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;721G可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精科;DL-5C型低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;Scient Z-18N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;熒光化學(xué)分析儀 Thermo公司;7890A GC System Agilent Technologies公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海蒿子原料預(yù)處理 將海蒿子飲片在45℃下烘干,粉碎后過(guò)32目篩,裝于密封袋中,置于干燥器中儲(chǔ)備。海蒿子粉末至于圓底燒瓶,按1∶8(g/mL)加入95%的乙醇,先浸泡0.5h,用電熱套加熱回流3h,真空抽濾(200目的濾布),棄去上清液,得濾渣(去除原料中的油脂、色素、低聚糖和小分子物質(zhì)等),40℃的烘箱中進(jìn)行干燥,儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 海蒿子多糖的提取

1.2.2.1 傳統(tǒng)水提法提取海蒿子多糖 取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的海蒿子粉末10g,按1∶20(g/mL)比例加入去離子水,100℃下提取2h,提取物抽濾得一次濾液,將濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,抽濾,合并濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮提取液,加入4倍體積的無(wú)水乙醇,置4℃冰箱中,靜置12h,離心,所得沉淀?yè)]發(fā)干乙醇,以水復(fù)溶,配制成海蒿子粗多糖溶液,為樣品TP。

1.2.2.2 檸檬酸法提取海蒿子多糖 取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的海蒿子粉末10g,按1∶20(g/mL)比例加入檸檬酸溶液(pH2)100℃提取2h,提取物抽濾,濾液用1mol/L NaOH調(diào)pH至中性,將濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,抽濾,調(diào)pH至中性,合并濾液,濃縮提取液,其余步驟同1.2.2.1,為樣品CP。

1.2.2.3 超聲法提取海蒿子多糖 取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的海蒿子粉末10g,按1∶20(g/mL)比例加入去離子水,于50℃下,功率250W下超聲提取20min,提取物抽濾,將濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,抽濾,合并濾液,濃縮提取液,其余步驟同1.2.2.1,為樣品UP。

1.2.2.4 超聲波輔助水提提取法 取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的海蒿子粉末10g,按1∶20(g/mL)比例加入去離子水,于50℃下,功率250W下超聲提取20min,提取物抽濾得一次濾液,將濾渣在100℃下水提2h,抽濾得二次濾液,合并濃縮提取液,其余步驟同1.2.2.1,為樣品UTP。

1.2.2.5 超聲波輔助檸檬酸提取法 取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的海蒿子粉末10g,按1∶20(g/mL)比例加檸檬酸(pH2)于50℃下,功率250W下超聲提取20min,提取物抽濾,濾液用1mol/L NaOH調(diào)pH至中性,將濾渣加檸檬酸(pH2)100℃下提取2h,抽濾,調(diào)pH至中性,合并濾液,濃縮提取液,其余步驟同1.2.2.1,為樣品UCP。

1.2.3 海蒿子多糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[6]測(cè)定海蒿子多糖的含量,葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4 海蒿子多糖得率的計(jì)算

多糖得率(%)=粗多糖質(zhì)量/海蒿子粉末質(zhì)量×100

1.2.5 海蒿子多糖分子量的測(cè)定 將已知分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分別用流動(dòng)相配制成2.0mg/mL的溶液,采用凝膠滲透色譜法(GPC)測(cè)定分子量。色譜條件:色譜柱為TSK-GEL G-5000PWXL凝膠柱和G-3000 PWXL凝膠柱(串聯(lián));流動(dòng)相為0.02mol/L KH2PO4溶液;流速0.6mL/min;進(jìn)樣量20μL;柱溫35℃;檢測(cè)器為Waters2414示差檢測(cè)器;標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖為Dextran系列(Dextran 5200、11600、23800、48600、14800、27300、410000、668000、1400000)。

1.2.6 海蒿子多糖硫酸基含量的測(cè)定 采用硫酸鋇比濁法[7]測(cè)定海蒿子多糖的硫酸基含量,并加以適當(dāng)改進(jìn)。精確稱量于105℃下干燥至恒重的硫酸鉀217.5mg,加1mol/L的鹽酸溶解定容至50mL,得硫酸基標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,硫酸基濃度為2.4mg/mL。取0,80,160,240,320,400μL標(biāo)準(zhǔn)溶液,用1mol/L鹽酸補(bǔ)至400μL,加入7.6mL的3%TCA和2mL氯化鋇明膠溶液,充分混合,室溫靜置反應(yīng)15min后,以無(wú)硫酸基的溶液按上述處理作為空白,于360nm處測(cè)吸光值。分別為以硫酸基含量和吸光值為坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)硫酸基含量曲線。

稱取20mg海蒿子多糖粉末于安培瓶中,加入2mL 1mol/L鹽酸,密封,沸水浴3h。量取反應(yīng)液400μL于10mL的試管中,加入7.6 mL的3%TCA和2mL氯化鋇明膠溶液,同樣條件反應(yīng)后,測(cè)吸光值為A1值;同時(shí),為了消除多糖樣品溶液中其它因素對(duì)紫外吸收的干擾,用明膠試劑替代氯化鋇明膠溶液,按上述步驟,測(cè)吸光值為A2值,得(A1-A2)值,以硫酸基含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算海蒿子多糖樣品中硫酸基含量。

1.2.7 海蒿子多糖抗氧化活性的測(cè)定

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參考Kargozler[8]等的方法,并作適當(dāng)修改。以無(wú)水乙醇為溶劑配制0.2mmol/L DPPH溶液,避光保存。取2mL的多糖樣品溶液(1～5mg/mL)與2mL的DPPH溶液乙醇溶液(0.2mmol/L)混合,震蕩,在30℃避光反應(yīng)30min,在517nm處測(cè)吸光值A(chǔ)sample。以2mL的多糖樣品溶液和2mL的無(wú)水乙醇溶液混合,在同樣的條件下測(cè)得的吸光度為Ablank。以2mL的無(wú)水乙醇和2mL的DPPH溶液乙醇溶液(0.2mmol/L)液混合,在同樣的條件下測(cè)得的吸光度為Acontrol。其中,樣品濃度分別為0.0625、0.125、0.25、0.5mg/mL,VC濃度分別為0.2、0.1、0.067、0.05、0.025、0.025mg/mL。DPPH自由基清除率按如下公式計(jì)算。

清除率(%)=1-(Asample-Ablank)/Acontrol×100

1.2.7.2 ABTS自由基清除能力測(cè)定 參考Re R[9]等的方法,并做適當(dāng)修改。配制ABTS儲(chǔ)備液:將濃度為4.9mmol/L K4S2O8溶液和14mmol/L ABTS溶液等體積混合,于避光條件下室溫反應(yīng)12～16h后,取適量ABTS儲(chǔ)備液,用50%乙醇稀釋至734nm波長(zhǎng)檢測(cè)其吸光度為(0.7±0.020)。將樣品稀釋至不同的濃度梯度,取0.1mL樣品稀釋液或VC,加2.9mL的ABTS自由基測(cè)定液,準(zhǔn)確混合震蕩30s,反應(yīng)20min后在734nm處測(cè)定得吸光值A(chǔ)樣品。對(duì)照組用去離子水替代樣品,按上述操作,測(cè)得吸光值為A對(duì)照。其中,樣品濃度分別為0.0625、0.125、0.25、0.5mg/mL,VC濃度分別為0.2、0.15、0.125、0.1、0.05、0.025、0.025mg/mL。ABTS自由基的清除率按如下公式計(jì)算。

ABTS+清除率(%)=(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照× 100

1.2.7.3 氧自由基吸收能力(ORAC)測(cè)定 參照Hua[10]等的方法,并作適當(dāng)修改。熒光素FL(終濃度70mmol/L)、自由基產(chǎn)生劑AAPH(12.8mmol/L,現(xiàn)配現(xiàn)用)、Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液(水溶性維生素E)和待測(cè)海蒿子多糖樣品均用磷酸鹽緩沖液(75mmol/L,pH7.40)溶解和梯度稀釋。具體操作為:在96多微孔板中依次加入20μL磷酸鹽緩沖溶液、20μL多糖樣品溶液后,每孔各加入20μL FL(70nmol/L)。用Ascent software version軟件設(shè)定程序,37℃下混勻孵育20min,迅速在各孔中加入140μL AAPH(12.8mmol/L),自動(dòng)混勻,開(kāi)始連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度值(激發(fā)波長(zhǎng)485nm,吸收波長(zhǎng)538nm),各孔測(cè)定熒光強(qiáng)度的時(shí)間間隔為2min,熒光強(qiáng)度分別記為f0、f1、f2…f60。循環(huán)次數(shù)一般根據(jù)熒光衰減至基線所需時(shí)間設(shè)定。用軟件統(tǒng)計(jì)熒光衰減曲線下面積(AUCsample)和(AUCblank)值,計(jì)算NetAUC=AUCsample-AUCblank值,按上述公式分別計(jì)算不同濃度Trolox(0-100μmol/L)和海蒿子多糖樣品的NetAUC值,AUCblank代表不含抗氧化劑存在時(shí)對(duì)氧自由基作用的對(duì)照AUC值。根據(jù)Trolox的線性回歸方程計(jì)算海蒿子多糖的ORAC值,ORAC值以μmolTrolox/g表示。

1.2.7.4 還原力的測(cè)定 參考Oyaizu[11]的方法,并作適當(dāng)修改。將海蒿子多糖樣品和VC梯度稀釋,取2mL海蒿子多糖樣品稀釋液,加入2mL磷酸緩沖液(0.2mol/L,pH6.6)和2mL的1%(w/w)鐵氰化鉀溶液,震蕩混合,50℃靜置20min后加入2mL 10%(w/w)TCA溶液,離心分離,移取2mL上清液于10mL的試管中,加入2mL蒸餾水和0.4mL 0.1%(w/w)FeCl3溶液,震蕩混合,靜置反應(yīng)10min,測(cè)吸光值(700nm),按同樣步驟測(cè)定VC還原力。其中,樣品濃度分別為0.0625、0.125、0.25、0.5mg/mL,VC濃度分別為0.2、0.15、0.125、0.1、0.05、0.025、0.025mg/mL。以濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法對(duì)海蒿子多糖得率的影響

如圖1所示,檸檬酸提取與超聲結(jié)合檸檬酸提取法多糖得率最高,兩者之間無(wú)顯著性差異;UP多糖得率最低;TP與UTP兩者之間無(wú)顯著性差異。CP多糖得率為5.31%±0.21%,是TP的1.8倍。UP多糖得率僅為1.04%±0.03%,可能由于僅采用超聲處理20min,物理破壞植物細(xì)胞后進(jìn)行多糖浸提的時(shí)間過(guò)短所致。從結(jié)果可看出CP和UCP可顯著提高多糖得率,這可能是因?yàn)闄幟仕崾且环N弱酸,在該弱酸環(huán)境下提取海蒿子多糖時(shí),可有效地降解海蒿子細(xì)胞壁組織,使胞間和胞內(nèi)的多糖溶出,提高得率。這與盧江虹等[12]的報(bào)道相一致。

圖1 不同提取方法所得海蒿子多糖的得率Fig.1 The extraction yield of Sargassum pallidum polysaccharides注:柱上方不同字母(a～c)代表顯著性差異(p<0.05),圖2同。

表1 不同提取方法所得海蒿子多糖的分子量分布Table1 The molecular weight distribution of Sargassum pallidum polysaccharides

2.2 不同提取方法所得海蒿子多糖的分子量

表1中可以看出,TP的分子量為739.663ku,約為UP的分子量大小的19倍;CP、UTP、UCP均洗脫出兩個(gè)峰,含有兩個(gè)組分。檸檬酸處理和超聲處理均可顯著降低多糖分子量。多糖鏈在酸提和超聲處理過(guò)程中會(huì)發(fā)生降解和結(jié)構(gòu)的變化。

2.3 不同提取方法對(duì)海蒿子多糖硫酸基含量的影響

如圖2所示,五種方法提取的海蒿子多糖硫酸基含量相互存在著顯著性差異,總體趨勢(shì)是TP>UTP>UP>UCP>CP。其中,TP硫酸基含量最高,為12.28%±0.67%,約是UTP的1.2倍,UP硫酸基含量的2.3倍,UCP硫酸基含量的3.7倍;CP的硫酸基含量的9.9倍。多糖中硫酸基的含量與多糖的抗氧化活性具有密切的相關(guān)性[13],一般硫酸基含量越高,多糖的抗氧化活性越好。此外,酸法和超聲處理可引起多糖鏈結(jié)構(gòu)的斷裂,破壞多糖結(jié)構(gòu)的完整性,造成多糖硫酸基的損失。由此,可能TP具有較好的抗氧化活性。

圖2 不同提取方法所得海蒿子多糖的硫酸基含量Fig.2 The extraction sulfate content of Sargassum pallidum polysaccharides

2.4 不同提取方法所得海蒿子多糖的抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基在517nm處有強(qiáng)吸收,抗氧化劑與其單電子配對(duì)而使吸收逐漸消失,可利用光化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行抗氧化能力的評(píng)價(jià)。由圖3可以看出,TP、UTP為0～0.2mg/mL、UP為0～0.1mg/mL的低濃度范圍內(nèi)隨濃度增加清除率反而降低,超過(guò)該濃度范圍后,則隨著濃度的升高清除率逐漸升高。而CP和UCP則一直是隨多糖濃度升高清除率升高?？傮w來(lái)看,UCP清除率較高,其次是CP,UP清除率最差。當(dāng)多糖濃度為0.5mg/mL時(shí),CP、UCP、TP、UTP、UP的清除率分別為72.57%、64.08%、54.77%、54.51%、48.43%。

圖3 不同提取方法所得海蒿子多糖的DPPH自由基清除能力Fig.3 The DPPH radical scavenging ability of Sargassum pallidum polysaccharides

2.4.2 ABTS+清除能力 由圖4可以看出,所有海蒿子多糖樣品ABTS+清除率都隨濃度的增大而增強(qiáng)。ABTS+清除能力由高到低依次為UTP>UP>TP>UCP>CP,當(dāng)多糖濃度為0.25mg/mL時(shí),分別達(dá)到81.62%、74.65%、74.59%、50.10%、29.32%。當(dāng)濃度低于0.0625mg/mL的范圍內(nèi),海蒿子多糖的清除率均略高于同等濃度的VC,當(dāng)高于0.14mg/mL濃度時(shí),VC的清除率超過(guò)海蒿子多糖,但與UTP、UP、TP相差不大。當(dāng)多糖濃度為0.45mg/mL時(shí),UTP的清除率可達(dá)0.18mg/mL VC的96.13%。ABTS自由基清除能力的方法可適用于評(píng)價(jià)脂溶性和水溶性樣品[14],因此,可較全面地評(píng)價(jià)不同提取方法所得多糖的抗氧化活性。盧江虹[12]采用傳統(tǒng)水提法提取海帶多糖,當(dāng)多糖濃度為3mg/mL,ABTS+清除能力為62.55%,低于本文TP的清除能力。

圖4 不同提取方法所得海蒿子多糖的ABTS+清除能力 Fig.4 The ABTS+radical scavenging ability of Sargassum pallidum polysaccharides

2.4.3 氧自由基吸收能力(ORAC) 氧自由基清除能力(ORAC)法,基于HAT機(jī)制,是一種生物相關(guān)性高的抗氧化性評(píng)價(jià)方法,現(xiàn)在普遍應(yīng)用于對(duì)各種物質(zhì)的抗氧化評(píng)價(jià)?；驹硎抢门嫉惢衔顰APH的過(guò)氧自由基攻擊下,FL熒光素的熒光特性逐漸消失的現(xiàn)象。評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力,關(guān)鍵在于抗氧化物質(zhì)存在下對(duì)過(guò)氧自由基的清除能力的大小,通常與氧自由基作用下熒光衰減曲線的延遲曲線面積直接相關(guān),即熒光自然衰減曲線下面積減去熒光衰減曲線下面積,最終結(jié)果以Trolox當(dāng)量來(lái)表示[15]。

由圖5可知,TP和UP之間氧自由基吸收能力無(wú)顯著性差異,總體趨勢(shì)是(TP或UP)>UTP>UCP>CP。其中,TP和UP的氧自由基吸收能力最強(qiáng),可達(dá)(5404.90±178.74)μmol Trolox/g和(5136.91±192.27)μmol Trolox/g。UTP、UCP、CP三者之間存在著顯著性差異,UTP和UCP分別是(4381.92±142.39)μmolTrolox/g和(1657.79± 148.49)μmol Trolox/g。CP的ORAC值最低,為(1051.51±175.05)μmol Trolox/g。

圖5 不同提取方法所得海蒿子多糖的ORAC值Fig.5 The ORAC value of Sargassum pallidum polysaccharides

2.4.4 還原力 由圖6可以看出,所有樣品都有一定的還原力,均隨多糖濃度的升高還原力逐漸增強(qiáng)。同等濃度下VC的OD值顯著高于其它樣品,0.15mg/mL時(shí)就達(dá)到1.562。在幾種不同方法提取的多糖樣品中,TP還原力最高,略強(qiáng)于UTP,在0.3mg/mL濃度時(shí)分別達(dá)到1.381,1.298。UP和UCP的還原力在濃度為0.3mg/mL時(shí)分別達(dá)到1.258,0.361。CP還原力最低,在0.3mg/mL時(shí)只有0.303。因此,還原力大小順序依次為:TP>UTP>UP>UCP>CP。還原力的測(cè)定是基于抗氧化物質(zhì)具有提供H·使Fe3+和Fe2+電子轉(zhuǎn)移的抗氧化性評(píng)價(jià)方法,通常還原力越大,所測(cè)樣品的抗氧化能力越好。由上述可知,顯示出較好的抗氧化活性的樣品可能是TP。

圖6 不同提取方法所得海蒿子多糖的還原力 Fig.6 The reducing power of Sargassum pallidum polysaccharides

研究表明,海洋藻類中的多糖物質(zhì)的生物活性與其結(jié)構(gòu)有十分密切的關(guān)系,如分子量、硫酸基含量、單糖組成、主鏈結(jié)構(gòu)等[16]。從本研究來(lái)看,不同的提取方法所得海蒿子多糖抗氧化活性有明顯差異,這可能與其分子量、單糖組成等有密切關(guān)系。海洋藻類生長(zhǎng)在浩瀚復(fù)雜的海水環(huán)境中,由于水質(zhì)的特殊,許多海洋藻類對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝的過(guò)程適應(yīng)了多組分(鹽分,氣體,營(yíng)養(yǎng)鹽,生源要素,微量元素,有機(jī)物質(zhì)等)水溶液環(huán)境。通常許多海藻多糖為硫酸化多糖,研究已發(fā)現(xiàn)硫酸基的含量與多糖的生物活性有顯著的關(guān)系[17]。這與本文研究結(jié)果相一致。Takashi[18]的報(bào)道褐藻中水溶性多糖具有較好抗氧化性的分子量分布在高分子量(>100ku),10～30ku,和低分子量(<5ku)組分,本研究中TP的分子量是739.663ku,UP分子量39.385ku,UTP分子量742.667ku(26.88%)和122.509ku(73.12%),其抗氧化活性也較強(qiáng)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)水提法、檸檬酸提取法、超聲法、超聲波輔助水提法、超聲波輔助檸檬酸提取法五種方法提取海蒿子多糖。其中采用檸檬酸進(jìn)行多糖的提取,可顯著地提高多糖的得率?？寡趸笜?biāo)評(píng)價(jià)中,DPPH·清除能力在低濃度范圍內(nèi)TP、UP、UTP要強(qiáng)于CP、UCP,高濃度反之;超聲波輔助水提法多糖的ABTS+清除能力0.25mg/mL濃度時(shí)為81.62%;而采用傳統(tǒng)水提法多糖的硫酸基含量為12.28%,還原力在0.3mg/mL濃度時(shí)可達(dá)到1.381,氧自由基吸收能力(ORAC)值可達(dá)5404.90μmol Trolox/g,并且傳統(tǒng)水提法和超聲波輔助水提法的多糖分子量較大。采用檸檬酸處理進(jìn)行多糖的提取雖可提高多糖得率,但其硫酸基含量和綜合抗氧化性卻不高,這可能與酸破壞多糖分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。整體而言,由于進(jìn)一步研究的重點(diǎn)在于海蒿子多糖的生物活性,因此,宜采用傳統(tǒng)水提法工藝來(lái)提取海蒿子多糖。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海蒿子作為褐藻的代表植物之一,其具有較好的抗氧化活性,可為海洋活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

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Study on characteristics ofSargassumPallidumpolysaccharides prepared by different methods

FU Xiong1,LI Xiang-shi1,YOU Li-jun1,2,*,LIU Dong2

(1.College of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Shenzhen Key Laboratory of Fermentation,Purification and Analysis,Shenzhen Polytechnic,Shenzhen 518055,China)

Polysaccharide extracted fromSargassumpallidum,as a cell polysaccharide,possesses a number of biological activities. Different extraction methods ofSargassumpallidumpolysaccharide,including hot water extraction,citric acid extraction,ultrasound extraction,ultrasonic wave complex hot water extraction and ultrasonic wave complex citric acid extraction,were compared in this paper. The results showed that the extracting yield increased largely by citric acid extraction,the experimental yield was 5.31%,1.8 fold of that of polysaccharides extracted by traditional hot water. At the same time,there were differences inSargassumpallidumpolysaccharide molecular weight. For example,the polysaccharide molecular weight by hot water extraction was 739.663ku,about 19 times than the method of ultrasound extraction. Through different evaluation tests of antioxidant capacity,it showed the polysaccharide extracted by traditional hot water,DPPH·radical scavenging ability was(54.77% at 0.5mg/mL). Its ABTS+scavenging ability was(74.59% at 0.25mg/mL). Its reducing power was(1.381 at 0.3mg/mL),and the oxygen radical absorbance capacity was(5404.90μmol Trolox/g). Moreover,its sulfate content was 12.28%,with best antioxidant activities. Therefore,the polysaccharide extracted by traditional hot water is more conducive to maintain the functional activity ofSargassumpallidumpolysaccharides,ease further in-depth research.

Sargassumpallidum;polysaccharides;citric acid extraction;molecular weight;antioxidant activity

2014-07-28

扶雄(1972-)，男，博士，教授，研究方向：功能碳水化合物。

*通訊作者:游麗君(1982-)，女，博士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與健康。

廣東省領(lǐng)軍人才項(xiàng)目(Rui Hai Liu)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31101222)；中央高?？蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2013ZM0049)；中美功能糖合作研發(fā)中心(2013J4500036)；深圳市發(fā)酵精制檢測(cè)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題。

TS201.2

A

:1002-0306(2015)09-0101-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.013