鄭棉海，陳 浩，朱曉敏，毛慶功，莫江明

1中國(guó)科學(xué)院華南植物園，中國(guó)科學(xué)院退化生態(tài)系統(tǒng)植被恢復(fù)與管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510650 2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039

礦質(zhì)養(yǎng)分輸入對(duì)森林生物固氮的影響

鄭棉海1,2，陳 浩1,2，朱曉敏1,2，毛慶功1,2，莫江明1,*

1中國(guó)科學(xué)院華南植物園，中國(guó)科學(xué)院退化生態(tài)系統(tǒng)植被恢復(fù)與管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510650 2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039

生物固氮是森林生態(tài)系統(tǒng)重要的氮素來(lái)源，并且在全球氮循環(huán)中占有重要的地位。近代以來(lái)，因人類活動(dòng)加劇而導(dǎo)致氮沉降的增加以及其它礦質(zhì)養(yǎng)分元素(如磷、鉬、鐵等)輸入的改變已成為影響森林生態(tài)系統(tǒng)生物固氮的重要因素之一，并引起了學(xué)術(shù)界的普遍關(guān)注。綜述了國(guó)內(nèi)外關(guān)于森林生物固氮對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分輸入的響應(yīng)及機(jī)理。主要內(nèi)容包括：(1)森林生物固氮的概念及主要的測(cè)定方法；(2)礦質(zhì)養(yǎng)分輸入對(duì)森林生物固氮的影響。整體上講，氮素輸入抑制了森林生物固氮，磷和其他營(yíng)養(yǎng)元素輸入則表現(xiàn)為促進(jìn)作用。氮和磷、磷和微量元素同時(shí)添加均提高了森林的固氮量；(3)礦質(zhì)養(yǎng)分改變森林生物固氮的機(jī)理。包括生物作用機(jī)制(如改變地表層固氮菌的數(shù)量或群落豐度、改變結(jié)瘤植物的根瘤生物量和附生植物的豐度或蓋度)和環(huán)境作用機(jī)制(如引起土壤酸化、改變碳源物質(zhì)的含量)；(4)探討了礦質(zhì)養(yǎng)分輸入對(duì)森林生物固氮影響研究中所存在的問(wèn)題，并對(duì)未來(lái)該領(lǐng)域的研究提出建議。

礦質(zhì)養(yǎng)分輸入；生物固氮；氮沉降；森林；固氮酶活性

生物固氮是森林生態(tài)系統(tǒng)重要的氮素來(lái)源。據(jù)估計(jì)，陸地生態(tài)系統(tǒng)每年通過(guò)生物固定的有效氮大約為110Tg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于閃電固氮(3Tg N/a)[1-2]。這意味著每年有超過(guò)97%的“新”氮素是通過(guò)生物固氮進(jìn)入陸地生態(tài)系統(tǒng)中[3]。值得注意的是，森林是固氮微生物分布最為廣泛的生態(tài)系統(tǒng)，如在土壤、凋落物、植物葉片、苔蘚、地衣和豆科植物的根瘤等均可以發(fā)現(xiàn)固氮菌的存在。地球上森林的覆蓋面積占整個(gè)陸地面積30%[4]，并且固氮量達(dá)到了陸地生態(tài)系統(tǒng)固氮總量的近一半[5]。通過(guò)生物固定的有效氮不僅可以提高森林的生產(chǎn)力，還會(huì)進(jìn)一步影響生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。因此，了解森林生物固氮的影響因素將有助于我們更好地認(rèn)識(shí)生物固氮對(duì)森林氮循環(huán)的影響。

一般認(rèn)為環(huán)境因子(如溫度、水分和光照等)的變化和礦質(zhì)養(yǎng)分的輸入均會(huì)影響生物固氮。其中礦質(zhì)養(yǎng)分的輸入，尤其是人類活動(dòng)引起的氮沉降增加已成為普遍關(guān)注的焦點(diǎn)[3,6]。近30年來(lái)，隨著工業(yè)的發(fā)展和人口增加，化石燃料的過(guò)度使用已經(jīng)悄然改變了全球氮循環(huán)的格局。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球多數(shù)地區(qū)的氮沉降速率已經(jīng)超過(guò)10kg N hm-2a-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生態(tài)系統(tǒng)的自然氮沉降(<0.5kg N hm-2a-1)[6]。許多研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期氮沉降可能通過(guò)增加森林土壤有效氮的含量而減弱固氮菌的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，或者通過(guò)改變固氮附生植物和結(jié)瘤植物的氮素獲取方式，從而減少對(duì)固氮菌的能量分配，進(jìn)一步降低森林的固氮量[7-8]。

此外，長(zhǎng)期氮沉降可能導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分失衡，進(jìn)而使固氮菌的生長(zhǎng)受到其他礦質(zhì)養(yǎng)分(如磷、鉬、鐵、鈷等)的限制。磷元素參與微生物(包括固氮菌)細(xì)胞膜的合成、酶的活化以及信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]，同時(shí)也是固氮菌能源物質(zhì)ATP的主要成分[10]，因此其含量的高低直接關(guān)系到固氮菌的生長(zhǎng)和繁殖。但土壤磷起源于巖石風(fēng)化，在沒(méi)有外來(lái)磷素輸入的情況下，會(huì)逐漸被生物吸收消耗或形成可溶性的有機(jī)磷而流失[11]。長(zhǎng)期氮沉降也會(huì)通過(guò)加劇土壤磷的限制[12]進(jìn)一步抑制森林的固氮能力。另外，其他營(yíng)養(yǎng)元素的限制，尤其是構(gòu)成固氮酶蛋白的重要微量元素(如鉬、鐵、鈷等)的缺乏，也可能會(huì)影響固氮酶蛋白的生物合成及相關(guān)功能的表達(dá)，進(jìn)而制約生物固氮的過(guò)程[13-15]。

我國(guó)作為全球氮沉降最嚴(yán)重的三大地區(qū)之一(歐洲、北美和中國(guó))，氮沉降以每年0.41kg/hm2的速率增加，且在2000年的記錄就達(dá)到了21.1kg N hm-2a-1[6,16]。大量的干、濕沉降勢(shì)必會(huì)威脅到我國(guó)森林的固氮能力，并通過(guò)加劇其他礦質(zhì)養(yǎng)分的失衡進(jìn)一步干擾森林生物固氮的進(jìn)行。但是，目前我國(guó)關(guān)于生物固氮的研究主要集中在農(nóng)業(yè)方面，而在森林方面的報(bào)道僅有5篇，且內(nèi)容主要集中在兩個(gè)方面：前者只是對(duì)森林中某種結(jié)瘤植物的固氮能力進(jìn)行初步報(bào)道[17-18]，缺乏對(duì)森林生物固氮的系統(tǒng)研究及影響因素的探索；后者主要關(guān)注環(huán)境因子(如溫度、濕度等)對(duì)森林附生植物[19]或結(jié)瘤植物[20-21]固氮的影響，卻忽視了礦質(zhì)養(yǎng)分在森林固氮中的重要性。因此，本文綜述國(guó)內(nèi)外關(guān)于礦質(zhì)養(yǎng)分輸入對(duì)森林生物固氮影響的研究現(xiàn)狀，同時(shí)歸納和總結(jié)相應(yīng)的機(jī)理，以期人們更好地認(rèn)識(shí)森林生物固氮在全球氮循環(huán)中的重要性，進(jìn)而為國(guó)內(nèi)開展森林生物固氮的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)和參考。

1 森林生物固氮的概念及研究方法

1.1 森林生物固氮的概念

生物固氮現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于豆科作物中，隨后主要被用于提高糧食的產(chǎn)量。到了1894年，林業(yè)上也開始進(jìn)行豆科樹種和其他結(jié)瘤固氮樹種的選育，并利用植物固氮的“施肥”作用來(lái)提高森林的生產(chǎn)力[22]。按照目前普遍的定義，生物固氮是指固氮微生物將大氣中的分子態(tài)氮固定下來(lái)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為可以被其他生物有效利用的化合態(tài)氮的過(guò)程[23]。在森林生態(tài)系統(tǒng)中，固氮微生物廣泛分布于不同的組織層次，如地表層的土壤和凋落物、豆科植物的根瘤及冠層的附生植物等。根據(jù)固氮方式的差異，森林生物固氮主要為共生固氮和自由固氮兩種形式。由于固氮微生物與植物之間存在復(fù)雜的關(guān)系，所以關(guān)于生物固氮的分類并沒(méi)有很明確的標(biāo)準(zhǔn)[24]。目前普遍把具有根瘤結(jié)構(gòu)的固氮植物歸入共生固氮的范疇，除此之外的其他固氮形式，如土壤、凋落物、植物葉片以及附生植物(苔蘚和地衣)等固氮菌進(jìn)行的固氮統(tǒng)稱為自由固氮[5,24]。

1.2 生物固氮的研究方法

衡量森林生物固氮的主要指標(biāo)為固氮酶活性，通過(guò)固氮酶活性可以進(jìn)一步計(jì)算森林的固氮量。隨著對(duì)生物固氮的深入研究，目前已有多種方法可以有效測(cè)定固氮酶活性。如，乙炔還原法、15N同位素稀釋法、15N自然豐度法、總氮差值法、酰脲估算法等[25-26]。在森林固氮的研究中，以采用15N同位素稀釋法和乙炔還原法較多，因此以下主要對(duì)這兩種方法進(jìn)行介紹。

15N同位素稀釋法主要用于固氮植物的研究。使用該方法首先需要選取生長(zhǎng)條件相近的非固氮植物作為參照植物。在相同條件下施加含有15N同位素的氮肥，同時(shí)保證沒(méi)有其他外源氮素的干擾。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，參照植物從土壤中吸收含15N的氮素，而固氮植物不僅吸收土壤中的15N，還通過(guò)固氮作用吸收來(lái)自大氣的14N。因?yàn)?4N的“稀釋”作用，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后固氮植物體內(nèi)15N /14N比例低于參照植物。通過(guò)兩種植物的15N原子百分比差值以及參照植物體內(nèi)的總N含量，即可計(jì)算出固氮植物的固氮量。但因?yàn)樵摲椒ㄐ枰x取參照植物，而參照植物選取的適當(dāng)與否直接關(guān)系到結(jié)果的精確性，再加上15N同位素價(jià)格昂貴，所以該方法使用并不多。相比之下，乙炔還原法具有操作簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)[27]。

早在20世紀(jì)60年代，Hardy等[27]通過(guò)室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)固氮酶不僅可以固定空氣中的氮?dú)?，還具有將乙炔(C2H2)還原為乙烯(C2H4)的能力。因此，利用固氮酶還原乙炔的能力，測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)乙炔減少量或者乙烯生成量即可得知固氮酶的活性。目前，在森林生物固氮的研究中普遍采用該方法，具體操作如下：將待測(cè)樣品置于密閉性良好的培養(yǎng)瓶中，用氣密注射器抽出10%的空氣，同時(shí)注入相應(yīng)體積的高純度乙炔。在室內(nèi)恒溫條件或者野外環(huán)境下培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，用注射器抽出部分氣體并收集于真空采氣管中。48h內(nèi)用氣相色譜儀測(cè)定待測(cè)氣體中C2H4生成量，然后計(jì)算得到固氮酶活性(nmol C2H4g-1h-1)。理想條件下，固氮酶每還原3mol C2H2與固定1mol N2等價(jià)，所以部分研究直接采用理想比例3∶1(C2H2∶N2)換算成生物固氮量(kg N hm-2a-1)[28-29]。但由于不同森林的環(huán)境條件及固氮菌種類存在差異，導(dǎo)致轉(zhuǎn)換比例也有所不同。因此，目前多數(shù)研究結(jié)合15N同位素方法對(duì)轉(zhuǎn)換值進(jìn)行校準(zhǔn)，從而得到實(shí)際的固氮量[30-31]。Anderson等[32]對(duì)乙炔還原法和15N同位素吸收法進(jìn)行比較，認(rèn)為只有通過(guò)15N同位素技術(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)才能精確地估算森林的固氮量。

2 礦質(zhì)養(yǎng)分輸入對(duì)森林生物固氮的影響

2.1 氮素輸入對(duì)森林生物固氮的影響

目前，關(guān)于氮素輸入影響森林固氮的研究主要集中在“富”氮的熱帶森林(表1)。多數(shù)施肥試驗(yàn)表明，長(zhǎng)期或短期施加氮肥均會(huì)降低固氮菌的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)(如降低固氮酶的活性)，從而減少森林的固氮量。例如，Barron等[15]在巴拿馬熱帶成熟林的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)達(dá)7a的氮肥添加(125kg N hm-2a-1)使土壤固氮酶活性降低了75%。Crews等[33]在熱帶3個(gè)鐵心木成熟林中的研究也發(fā)現(xiàn)，施加氮肥(100kg N hm-2a-1)降低了凋落物固氮酶活性，并且在年齡最老的成熟林中的抑制作用達(dá)到極顯著水平。在波多黎各熱帶森林中，Cusack等[34]對(duì)森林不同組織層次的生物固氮進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)短期施加氮肥(50kg N hm-2a-1)同時(shí)降低了土壤、凋落物、附生植物葉片和苔蘚的固氮酶活性。在溫帶森林的研究也有類似的結(jié)論，如在瑞典一個(gè)火燒后355a的溫帶成熟林中，短期內(nèi)施加不同水平的氮肥(0.56kg N hm-2周-1或 3.18kg N hm-2周-1)分別使苔蘚(Pleuroziumschreberi)固氮量降低為2.8μmol m-2d-1和3.0μmol m-2d-1，且作用均達(dá)到極顯著水平(P<0.001)[30]。但也有少數(shù)研究結(jié)果表示施加氮肥對(duì)生物固氮的影響不大[13,35]。

2.2 磷素輸入對(duì)森林生物固氮的影響

關(guān)于磷素對(duì)生物固氮起重要作用的認(rèn)識(shí)主要來(lái)源于熱帶森林的研究。因?yàn)闊釒侄鄶?shù)表現(xiàn)為磷素限制[44]，因此研究磷素輸入對(duì)熱帶森林生物固氮的影響具有重要的意義。目前，許多研究認(rèn)為磷素輸入促進(jìn)了固氮細(xì)菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而提高熱帶森林的固氮酶活性或固氮量(表1)。例如，Barron等[15]在巴拿馬熱帶成熟林的研究發(fā)現(xiàn)，7a的磷肥添加(50kg P hm-2a-1)使土壤固氮酶活性增加了約2倍(P<0.007)。在熱帶合歡成熟林中，Binkley等[45]利用乙炔還原法和15N同位素稀釋法均證實(shí)了施加磷肥(5g/盆 CaHPO4)顯著增加結(jié)瘤植物(Facaltariamoluccana)的固氮量。在哥斯達(dá)黎加熱帶成熟林，Reed等在2010年[46]和2013年[23]先后報(bào)道了不同磷肥試驗(yàn)(長(zhǎng)期施肥150kg P hm-2a-1和單次施肥844μg P g-1)的結(jié)果：施加磷肥的凋落物固氮酶活性分別是對(duì)照的3倍和2倍。Grove和Malajczuk[28]在澳大利亞一個(gè)紅桉樹林進(jìn)行3年的磷肥試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，施加低濃度(30kg P hm-2a-1)和高濃度(200kg P hm-2a-1)磷肥使林下層豆科植物的根瘤固氮量分別增加了59%和99%。此外，在熱帶其他成熟林[33,35,47]和次生林[48]的研究中也都得出了類似的結(jié)論。除了熱帶地區(qū)，少數(shù)溫帶地區(qū)的研究同樣發(fā)現(xiàn)磷素輸入可以提高森林的固氮量。如在克拉馬斯溫帶森林，Yelenik等[31]發(fā)現(xiàn)2a施加磷肥(150kg P hm-2a-1)不同程度地提高了土壤和凋落物層的固氮量。在瑞典一個(gè)赤松和云杉混合成熟林(355a)中，短期施加磷肥(0.42kg P hm-2周-1)也會(huì)輕微提高苔蘚(Pleuroziumschreberi)的固氮量[30]。

盡管大多數(shù)研究結(jié)果均表明施加磷肥可以提高森林的生物固氮，但仍有少部分研究認(rèn)為添加磷肥對(duì)生物固氮的影響不大。如在熱帶地區(qū)，Vitousek和Hobbie[13]通過(guò)對(duì)鐵心木成熟林進(jìn)行長(zhǎng)期(>10a)的磷肥添加試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)來(lái)自對(duì)照樣方的凋落物置于施加磷肥的樣方中其固氮酶活性并沒(méi)有增加，這與Silvester[49]研究結(jié)論一致。在溫帶地區(qū)，也有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為施加磷肥不一定會(huì)提高結(jié)瘤植物[31]或者苔蘚[50]的固氮量。

2.3 其他礦質(zhì)養(yǎng)分輸入對(duì)森林生物固氮的影響

除氮素和磷素以外，有研究表明其他礦質(zhì)養(yǎng)分(尤其是微量營(yíng)養(yǎng)元素)的輸入也會(huì)影響森林的生物固氮，并且多數(shù)表現(xiàn)為促進(jìn)作用(表1)。礦質(zhì)養(yǎng)分(除N和P外)輸入促進(jìn)森林固氮的現(xiàn)象在熱帶地區(qū)和溫帶地區(qū)均可以發(fā)現(xiàn)。在熱帶地區(qū)，如Barron等[15]對(duì)巴拿馬一個(gè)成熟林進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)元素(包括Mo, S, Cu, B, Fe, Mn, Zn, Ca, Mg等)添加處理，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施肥(25kg hm-2a-1)的土壤固氮酶活性大約是對(duì)照的2倍(P<0.013)。Vitousek[47]在美國(guó)一個(gè)鐵心木(Metrosiderospolymorpha)成熟林的研究證明，施加混合營(yíng)養(yǎng)元素(除N、P外的所有營(yíng)養(yǎng)元素)同時(shí)提高了根瘤和凋落物的固氮酶活性。通過(guò)對(duì)3個(gè)不同土壤年齡的熱帶森林進(jìn)行研究，Crews等[33]也發(fā)現(xiàn)施加營(yíng)養(yǎng)元素均增加了3個(gè)森林的凋落物固氮酶活性，其中在土壤年齡最小(300a)和年齡最大(4100000a)的森林中促進(jìn)作用均達(dá)到極顯著水平(P<0.001)。在溫帶森林的研究也有類似的結(jié)論，如Silvester[49]也發(fā)現(xiàn)添加微量營(yíng)養(yǎng)元素可以促進(jìn)凋落物固氮，其中施肥處理的固氮酶活性(15.2nmol C2H4g-1h-1)顯著高于對(duì)照(4.1nmol C2H4g-1h-1)。此外，也有少數(shù)研究得出添加微量營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)森林固氮影響不顯著的結(jié)論[13,23,50]。

在影響生物固氮的眾多微量營(yíng)養(yǎng)元素中，鉬(Mo)成為關(guān)注的焦點(diǎn)。微量元素鉬和鐵共同參與合成固氮酶蛋白中的鉬固氮酶(也稱鉬鐵蛋白)[10,14]。而鉬固氮酶幾乎存在于所有的固氮細(xì)菌中，且參與生物固氮的過(guò)程[51]。在熱帶和溫帶森林的研究均表明，添加鉬元素促進(jìn)了土壤或凋落物的固氮酶活性。在熱帶森林，如Barron等[15]發(fā)現(xiàn)鉬肥添加提高了土壤固氮酶活性，并且高濃度(504μg Mo/kg)比低濃度(42μg Mo/kg)的促進(jìn)作用更加明顯；而長(zhǎng)達(dá)7a的鉬添加試驗(yàn)進(jìn)一步證明，施加鉬肥(0.01kg hm-2a-1)的土壤固氮酶活性比對(duì)照增加了4倍。同樣在巴拿馬熱帶森林，Wurzburger等[14]對(duì)6個(gè)具有不同磷含量的森林進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在磷飽和的森林中施加鉬肥(667mg Mo/kg)可以使土壤的固氮酶活性增加3倍。Vitousek[47]也認(rèn)為，添加營(yíng)養(yǎng)元素引起凋落物固氮酶活性的增加很可能與鉬元素有關(guān)。鉬元素輸入對(duì)溫帶森林固氮的影響研究甚少，目前僅有Silvester[49]進(jìn)行過(guò)相關(guān)的報(bào)道，即鉬添加處理使黃杉成熟林的凋落物固氮酶活性增加2—3倍。

2.4 氮、磷及其他礦質(zhì)養(yǎng)分的交互作用

總體上講，單獨(dú)施加氮肥會(huì)抑制森林生物固氮，施加磷肥則起到促進(jìn)作用。氮肥和磷肥同時(shí)施加對(duì)森林固氮的影響僅在熱帶地區(qū)進(jìn)行過(guò)報(bào)道，且氮素和磷素之間可能不存在交互作用。例如，在巴拿馬科羅拉多島的一個(gè)露天溫室中，Batterman等[52]進(jìn)行了不同梯度氮肥(0, 30, 60g N m-2a-1)和磷肥(0, 20, 40g P m-2a-1)的析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)施加氮肥或者磷肥對(duì)印加(Ingapunctata)的根瘤固氮分別起到抑制(P<0.001)和促進(jìn)作用(P<0.001)，而氮肥和磷肥同時(shí)施加雖然也促進(jìn)了印加的根瘤固氮，但其交互作用并不顯著。Binkley等[45]在夏威夷熱帶森林中的研究也發(fā)現(xiàn)，同時(shí)施加氮肥和磷肥(5g/盆 NH4NO3+ 5g/盆 CaHPO4)對(duì)豆科樹種(Facaltariamoluccana)的根瘤固氮沒(méi)有交互作用，但卻提高了根瘤固氮酶活性和單位植株的根瘤固氮量。此外，Reed等[35]在哥斯達(dá)黎加熱帶森林中的研究也得到類似的結(jié)論，即同時(shí)施加氮肥和磷肥(150kg N hm-2a-1+ 150kg P hm-2a-1)也會(huì)提高凋落物和土壤的固氮酶活性。這表明磷素對(duì)生物固氮的促進(jìn)作用可能比氮素的抑制作用更加強(qiáng)烈。

相比之下，磷和其他礦質(zhì)養(yǎng)分同時(shí)添加對(duì)熱帶森林固氮的影響表現(xiàn)出交互作用。如，在美國(guó)熱帶森林中，Vitousek和Hobbie[13]通過(guò)凋落物分解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，來(lái)自對(duì)照樣方的凋落物置于單獨(dú)施加磷肥或T肥(T肥: 除N、P外的所有營(yíng)養(yǎng)元素)的樣方中，其固氮酶活性沒(méi)有發(fā)生顯著變化；但置于同時(shí)施加磷肥和T肥的樣方后固氮酶活性顯著增加，并且磷和T的交互作用達(dá)到極顯著水平(P<0.001)。Silvester[49]通過(guò)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析也發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照(1.0—1.6nmol C2H4g-1h-1)，單獨(dú)施加磷肥對(duì)凋落物固氮酶活性沒(méi)有影響(1.1—1.2nmol C2H4g-1h-1)，施加除氮以外的所有營(yíng)養(yǎng)元素(包括磷等)卻可以顯著提高固氮酶活性(4.6—5.1nmol C2H4g-1h-1)。Wurzburger等[14]在巴拿馬兩個(gè)磷受限的熱帶森林(Zetek和Rio Paja)進(jìn)行了鉬和磷的添加試驗(yàn)，結(jié)果也表明同時(shí)添加鉬(667mg Mo/kg)和磷(283mg P/kg)會(huì)使土壤固氮酶活性增加1.5—4倍，并且鉬和磷的交互作用達(dá)到顯著水平。此外，Vitousek[47]和Reed等[23]通過(guò)研究也先后得到類似的結(jié)論，這說(shuō)明熱帶森林生物固氮可能同時(shí)受到磷素和其他礦質(zhì)養(yǎng)分的限制。而溫帶森林目前僅有Markham[50]進(jìn)行過(guò)相關(guān)報(bào)道，即磷和微量營(yíng)養(yǎng)元素同時(shí)添加對(duì)兩種苔蘚(Sphagnumcapillifolium和Pleuroziumschreberi)固氮的影響均不存在交互作用。

3 礦質(zhì)養(yǎng)分輸入影響森林生物固氮的機(jī)理

綜合目前國(guó)內(nèi)外的研究，礦質(zhì)養(yǎng)分(主要為氮素和磷素)輸入影響森林生物固氮的機(jī)理可以分成生物作用機(jī)制和環(huán)境作用機(jī)制兩個(gè)部分。

3.1 生物作用機(jī)制

森林的不同組織層次均有固氮菌的分布，然而它們對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分輸入的響應(yīng)機(jī)制卻存在差異。因此，本文將從森林地表的土壤及凋落物層、結(jié)瘤植物和冠層附生植物3個(gè)不同層次闡述礦質(zhì)養(yǎng)分輸入對(duì)森林固氮的影響機(jī)制。

3.1.1 改變地表層固氮菌的數(shù)量或群落豐度

自由固氮菌主要分布于森林的土壤和凋落物層，所以其數(shù)量或群落豐度很容易受到土壤氮、磷等養(yǎng)分的影響。

長(zhǎng)期的氮素輸入可能通過(guò)減少固氮菌的數(shù)量或者群落豐度，進(jìn)而降低森林的固氮量。目前普遍認(rèn)為，固氮菌在氮素限制的森林中具備較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，所以固氮酶活性比較高[33]。然而，長(zhǎng)期的氮素輸入不斷提高了土壤的氮素含量和生物總量[54]，并加劇微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)。此時(shí)繼續(xù)通過(guò)耗能方式進(jìn)行固氮將不利于固氮菌的生存[10]，因此固氮菌的數(shù)量逐漸減少。如在Harvard森林，Compton等[55]研究認(rèn)為長(zhǎng)期施加氮肥增加了松林土壤固氮基因(nifH)擴(kuò)增的困難性。這意味著施加氮肥可能減少了土壤固氮菌的數(shù)量，進(jìn)而抑制固氮基因的表達(dá)。Kolb和Martin[56]通過(guò)研究也發(fā)現(xiàn)，施加氮肥降低了土壤根際固氮菌與總細(xì)菌的比例，同時(shí)也顯著降低了固氮酶的活性。此外，長(zhǎng)期的氮素輸入可能不利于對(duì)高氮環(huán)境耐受性較弱的固氮菌生存，從而降低了固氮菌的群落豐度。如，Piceno和Lovell[57]通過(guò)氮肥添加試驗(yàn)研究土壤固氮基因的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施加氮肥使土壤中原本具有的優(yōu)勢(shì)固氮基因消失，同時(shí)也降低了土壤的生物固氮量。在長(zhǎng)期的增溫和施加氮肥控制試驗(yàn)中，Berthrong等[58]發(fā)現(xiàn)施加氮肥降低了松林土壤固氮基因的豐度和多樣性。Freedman等[59]同樣發(fā)現(xiàn)氮沉降降低了北方闊葉林土壤固氮基因的豐度。這表明氮素的輸入通過(guò)減少固氮菌的群落豐度，進(jìn)而抑制森林的生物固氮。

相反，磷素的輸入可能促進(jìn)固氮菌的生長(zhǎng)并增加其群落的豐度，群落豐度的增加可以提高森林的固氮總量。如在哥斯達(dá)黎加熱帶雨林，Reed等[46]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施加磷肥(150kg P hm-2a-1)使凋落物產(chǎn)生新的固氮基因。這表明磷素的輸入導(dǎo)致新的固氮菌(如喜磷固氮菌等)出現(xiàn)。此外，Reed等[46]研究還證明了磷肥添加可以顯著地提高凋落物固氮基因的豐度和固氮量，且固氮基因的豐度與固氮量之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(P=0.025，r2=0.35)。

3.1.2 改變結(jié)瘤植物的根瘤生物量

根瘤固氮是結(jié)瘤植物最主要的氮素來(lái)源[8]，因此根瘤的生長(zhǎng)很大程度上受到結(jié)瘤植物的調(diào)控。礦質(zhì)養(yǎng)分的輸入可能會(huì)引起土壤養(yǎng)分的失衡，進(jìn)而改變結(jié)瘤植物對(duì)氮素的需求，導(dǎo)致根瘤的生物量和固氮量發(fā)生變化。

長(zhǎng)期的氮素輸入可能會(huì)減少結(jié)瘤植物對(duì)根瘤的生物量分配，從而降低根瘤的固氮量。對(duì)于結(jié)瘤植物而言，通過(guò)根瘤固氮方式獲取氮素需要消耗能量[10]。當(dāng)大量氮素進(jìn)入土壤時(shí)，固氮植物會(huì)減少對(duì)根瘤的生物量分配，部分轉(zhuǎn)向耗能較少的獲取方式，即土壤有效氮素的吸收[8,31]。雖然有研究表明，在土壤氮含量豐富的情況下，單位根瘤的固氮酶活性并沒(méi)有發(fā)生顯著變化，但是植物總的根瘤固氮量卻降低了[60]。這說(shuō)明在共生固氮系統(tǒng)中，外來(lái)氮素的輸入可能是通過(guò)減少根瘤的生物量來(lái)降低植物的固氮總量。例如，Ekblad和Huss-Danell[61]通過(guò)溫室實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)添加氮素使榿木(Alnusincana)的根瘤生物量和固氮量同時(shí)降低。Barron等[37]采用時(shí)間序列的方法也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)論，即成熟林(有效氮含量高)的印加樹根瘤生物量和固氮量均低于次生林，這表明土壤有效氮的增加會(huì)抑制根瘤的生長(zhǎng)和固氮。

磷素的輸入可能增加了結(jié)瘤植物對(duì)氮素的需求，因此結(jié)瘤植物通過(guò)增加根瘤的生物量(如根瘤的數(shù)量、干重和密度等)來(lái)提高根瘤的固氮總量。例如，Yang[62]通過(guò)磷添加試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加磷素(0.1—1.0μmol/L KH2PO4)促進(jìn)了木麻黃(Casuarinacunninghamiana)及其根瘤的生長(zhǎng)。通過(guò)溫室實(shí)驗(yàn)的研究，Hingston等[48]發(fā)現(xiàn)不同濃度的磷添加(4mg P/kg土或10mg P/kg土)雖然都降低了兩種結(jié)瘤植物(Acaciapulchella和Kennediaprostrate)的根瘤固氮酶活性，但均提高了單位植株的根瘤數(shù)量、干重和固氮量。Grove和Malajczuk[28]的研究也表明，不同的施肥量(30kg P hm-2a-1或200kg P hm-2a-1)分別使豆科植物(Bossiaealaidlawiana)的根瘤固氮量提高了59%和99%，并認(rèn)為固氮量的增加主要是因?yàn)槭┘恿追曙@著增加了根瘤的密度。因此，磷是限制結(jié)瘤植物生長(zhǎng)及固氮的主要原因[60]。

3.1.3 改變附生植物的豐度或蓋度

冠層附生植物(苔蘚和地衣)的營(yíng)養(yǎng)元素主要來(lái)源于大氣環(huán)境[63]，或者間接通過(guò)寄主植物葉片和樹皮的淋溶析出獲得[64]。所以，短期的林下層施肥對(duì)附生植物沒(méi)有直接影響，但長(zhǎng)期的礦質(zhì)養(yǎng)分輸入可能通過(guò)改變寄主植物的營(yíng)養(yǎng)狀況，進(jìn)一步影響附生植物的生長(zhǎng)和固氮。

相比之下，長(zhǎng)期的磷素輸入反而促進(jìn)了附生植物的生長(zhǎng)并提高其豐度或者蓋度，進(jìn)而增加森林的固氮量。如，在夏威夷熱帶雨林，Benner等[68]進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)14a的磷肥(100kg P hm-2a-1)添加試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)施加磷肥顯著提高了固氮地衣(Pseudocyphellariacrocata)的豐度和固氮酶活性；通過(guò)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期施加磷肥使地衣的固氮量增加了將近30倍，并認(rèn)為這是由于地衣的豐度增加所導(dǎo)致的[53]。Gordon等[67]發(fā)現(xiàn)8a施加磷肥(5kg P hm-2a-1)使苔蘚(Dicranumscoparium和Polytrichumjuniperinum)的蓋度增加13%—16%，并且在植物功能群中的比例也增加了1倍。附生植物蓋度的增加很可能與寄主植物磷含量的提高有關(guān)。如，Benner[69]在夏威夷森林的研究中發(fā)現(xiàn)，固氮地衣蓋度較高的寄主喬木，其葉片和樹皮的磷含量也相對(duì)較高(P<0.001)。這暗示了磷的輸入可能通過(guò)提高寄主植物磷的含量，進(jìn)而增加附生植物的蓋度。附生植物蓋度的增加也會(huì)提高森林的固氮總量。

3.2 環(huán)境作用機(jī)制

3.2.1 引起土壤酸化

長(zhǎng)期的氮素輸入除了降低土壤pH，還會(huì)導(dǎo)致土壤中的大量交換性陽(yáng)離子(K+, Ca2+, Mg2+等)流失，同時(shí)增加了土壤可交換性Al3+的濃度[76]。大量Al3+累積引起的鋁毒效應(yīng)也會(huì)進(jìn)一步抑制豆科植物的生長(zhǎng)和根瘤固氮的進(jìn)行[77]。例如，Wood等[78]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH<5.0時(shí)，根瘤菌的生長(zhǎng)和根瘤的形成都會(huì)受到抑制，而在酸性條件下同時(shí)進(jìn)行添加鋁處理則使兩者在pH<6.0就開始受到抑制。Igual等[79]也發(fā)現(xiàn)添加鋁處理(>440μmol/L Al)會(huì)降低木麻黃(Casuarinacunninghamiana)的根瘤干重，并且在高鋁處理下(880μmol/L Al)的固氮效率降低為原來(lái)的一半。

此外，氮素輸入引起土壤酸性的增加還可能影響土壤Mo的含量。一般在酸性條件下土壤Mo含量很低[15,49]，而微量元素Mo限制生物固氮的結(jié)論在許多研究中[14-15,49]也已經(jīng)得到證明。

3.2.2 改變碳源物質(zhì)的含量

多數(shù)固氮微生物在生長(zhǎng)和固氮過(guò)程均需要從環(huán)境中獲取有效的碳源，因此碳源物質(zhì)的含量也是影響森林地表層(土壤和凋落物)生物固氮的重要因素。在森林生態(tài)系統(tǒng)中，礦質(zhì)養(yǎng)分(如氮素)的輸入主要通過(guò)影響凋落物的分解，進(jìn)而改變有效碳源物質(zhì)的含量[80]。

長(zhǎng)期的氮素輸入減少了凋落物中纖維素和半纖維素的含量，同時(shí)導(dǎo)致木質(zhì)素累積，進(jìn)而減少了可被固氮微生物有效利用的碳源。目前已有多數(shù)研究證明，當(dāng)外源氮素進(jìn)入土壤時(shí)，微生物會(huì)提高纖維素水解酶(如β-1,4-葡萄糖苷酶和纖維素二糖水解酶等)的活性，并降低木質(zhì)素氧化酶(如多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶等)的活性，導(dǎo)致纖維素、半纖維素等可被利用的碳源物質(zhì)越來(lái)越少[81-82]。有效碳源的減少不僅影響了固氮微生物的生理代謝，還會(huì)阻礙其生物固氮的過(guò)程。

雖然沒(méi)有證據(jù)表明碳源物質(zhì)的減少會(huì)直接抑制森林地表層的生物固氮，但目前已有許多研究認(rèn)為土壤或凋落物的固氮酶活性與有機(jī)碳含量之間存在正相關(guān)性。例如，在哥斯達(dá)黎加熱帶森林中，Reed等[35]發(fā)現(xiàn)土壤和凋落物固氮量在夏季最高，認(rèn)為這可能是夏季濕度較高的情況下，凋落物層的可溶性有機(jī)碳增加，從而提供給固氮菌豐富的有效碳源。Wurzburger等[14]通過(guò)研究土壤剖面不同深度的固氮酶活性，發(fā)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)含量豐富并且含氮量較低(也即有最高的C/N)的土壤表層固氮酶活性最高。在夏威夷熱帶森林，Vitousek[42]的研究也發(fā)現(xiàn)凋落物的自由固氮酶活性與其獲取的能量(碳源)有關(guān)。Pérez等[83]在溫帶成熟林中的研究也表明，若凋落物含有較高的C/N，相應(yīng)的固氮酶活性也比較高。

4 問(wèn)題與展望

4.1 空間尺度的局限性

從現(xiàn)有的研究來(lái)看，多數(shù)森林固氮的研究對(duì)象只是局限于某些固氮能力較強(qiáng)的植物，而這種局部性的研究并不能代表整個(gè)森林或者區(qū)域的固氮情況[3]。其次，在森林的不同組織層次均有固氮植物或者固氮微生物分布，但多數(shù)研究的對(duì)象只是局限于森林中某個(gè)類群，比如苔蘚、地衣、豆科固氮植物，或者局限于某個(gè)組織層次，如土壤層、凋落物層，而缺乏對(duì)整個(gè)森林的系統(tǒng)估算。目前，國(guó)外如Cusack等[34]對(duì)森林生物固氮進(jìn)行過(guò)比較系統(tǒng)的報(bào)道，而國(guó)內(nèi)還未在該領(lǐng)域進(jìn)行系統(tǒng)的研究。從全球尺度上講，目前有關(guān)陸地生態(tài)系統(tǒng)生物固氮的報(bào)道主要集中在歐洲和北美等少數(shù)地區(qū)，在豆科植物廣泛分布的亞洲、非洲和南美洲等地區(qū)的研究卻相當(dāng)缺乏[5]。中國(guó)固氮植物資源豐富，因此加強(qiáng)和開展國(guó)內(nèi)森林共生固氮和自由固氮的研究將有助于我們認(rèn)識(shí)全球變化(如氮沉降等)對(duì)我國(guó)森林氮循環(huán)的影響。

4.2 時(shí)間尺度的局限性

森林生物固氮會(huì)呈現(xiàn)一定的日變化或者季節(jié)變化，因此某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的采樣結(jié)果并無(wú)法代表森林的實(shí)際固氮量[29]。其次，短時(shí)間尺度的研究也可能會(huì)誤導(dǎo)我們對(duì)森林固氮的認(rèn)識(shí)。比如短期添加營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)某些附生植物的影響可能不明顯，但長(zhǎng)期施肥通過(guò)間接方式改變了附生植物的固氮速率[68,84]。所以，目前多數(shù)短期施肥的控制性試驗(yàn)的研究(特別是溫室實(shí)驗(yàn))無(wú)法完全反映森林的真實(shí)固氮。在美國(guó)、瑞典、智利等部分區(qū)域采用空間代替時(shí)間的方法研究大時(shí)間尺度下的森林固氮差異，然而這樣的研究方法在其他地區(qū)(如亞洲地區(qū))的應(yīng)用卻非常少。我國(guó)具備從熱帶至寒帶不同氣候條件的森林生態(tài)系統(tǒng)，隨著中國(guó)生態(tài)系統(tǒng)研究網(wǎng)絡(luò)(CERN)的建立和逐步完善，該網(wǎng)絡(luò)體系將有助于我們實(shí)現(xiàn)不同區(qū)域或年齡段森林生物固氮的合作研究，更好地理解森林生物固氮的機(jī)理。

4.3 研究方法的局限性

關(guān)于固氮酶活性的測(cè)定方法有很多種，但是不同的方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。例如，15N同位素稀釋法雖然可以比較精確地測(cè)定固氮酶活性，但該方法主要運(yùn)用在固氮植物的研究，對(duì)土壤或者凋落物等自由固氮并不適用。乙炔還原法雖然操作簡(jiǎn)單，但其測(cè)定值只能反映固氮酶在理想條件下的最高活性，因此可能會(huì)高估森林實(shí)際的固氮量[85]。其次，在森林固氮量的換算中，部分研究直接采用理想比例(3∶1)進(jìn)行計(jì)算無(wú)法反映實(shí)際的固氮情況。此外，方法上的不統(tǒng)一，如不同的培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)條件(溫室或野外)、轉(zhuǎn)換比例(理想比例或?qū)嶋H比例)等，也會(huì)使不同森林固氮量之間缺乏可比性。因此，加強(qiáng)我國(guó)生物固氮相關(guān)測(cè)定方法的研究并與國(guó)際上的新方法接軌，可以更為精確地估算不同森林類型的生物固氮量。

4.4 研究的深度不足

國(guó)內(nèi)外對(duì)森林固氮的研究仍然停留在固氮酶活性的分析。引起固氮酶活性變化的更深層次機(jī)理還不清楚，尤其在固氮菌群落結(jié)構(gòu)和功能方面的研究甚少。目前，國(guó)際上已有部分研究利用分子生物學(xué)的方法，證明了養(yǎng)分添加影響森林固氮菌群落的豐度[55,58-59]，但在國(guó)內(nèi)仍未見到相關(guān)的報(bào)道。其次，養(yǎng)分的輸入究竟是影響了森林中哪些類群的固氮菌生長(zhǎng)，以及哪些固氮菌對(duì)森林固氮量的貢獻(xiàn)最大等都還沒(méi)有得到有效的鑒定。隨著我國(guó)分子生物學(xué)的發(fā)展，基于PCR技術(shù)的RFLP、t-RFLP、DGGE和基因探針雜交等方法將有助于我們對(duì)固氮菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析。因此，利用分子技術(shù)研究森林生物固氮將是研究的重點(diǎn)。

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Effects of the addition of mineral nutrients on biological nitrogen fixation in forest ecosystems

ZHENG Mianhai1,2, CHEN Hao1,2, ZHU Xiaomin1,2, MAO Qinggong1,2, MO Jiangming1,*

1KeyLaboratoryofVegetationRestorationandManagementofDegradedEcosystems,SouthChinaBotanicalGarden,ChineseAcademyofSciences,Guangzhou510650,China2UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100039,China

Biological nitrogen fixation (BNF) in forest ecosystems plays a very important role in global nitrogen (N) cycling, because forest ecosystems cover 30% of the global land area and represent nearly half of the N fixation that occurs in terrestrial ecosystems.Additionally, these ecosystems harbor abundant N-fixation microbes, including both symbiotic and free-living N-fixation bacteria.It is generally believed that environmental conditions (e.g.temperature, moisture, and light intensity) and nutrient availability are the most important factors regulating BNF in ecosystems.Among these factors, the effects of nutrient availability have recently received increasing attention.In the last several decades, anthropogenic activities have greatly modified the global biogeochemical cycles of N and other mineral nutrients.For example, the quantity of global N deposition increased from 41Tg N /a in 1950to 103Tg N /a in 2000.Long-term N deposition may exert direct effects on forest BNF by reducing the competitive advantage of free-living N-fixation bacteria or by reducing the energy allocated to symbiotic N-fixation bacteria.N deposition may also lead to imbalances in mineral nutrient proportions that play vital roles in the growth of N-fixation bacteria.Phosphorus (P), for example, is thought to be a major component of microbial cell membranes and also to be directly related to the formation of adenosine triphosphate (ATP), which is very important for nitrogenase function.In addition, many rock-derived nutrients (e.g.Ca, K, Mo, and Fe) are depleted and their availability becomes poor during forest succession.Deficiency of these mineral nutrients may consequently influence forest BNF by limiting the growth of N-fixation bacteria.In recent decades, mineral nutrient addition experiments (in the lab orinsitu) have been widely used in Europe and North America to investigate how nutrient availability influences forest BNF.However, little information on how forest BNF responds to nutrient addition is available from China, although N deposition is projected to increase with the rapid growth of the Chinese economy in the future.In this paper, we review the impacts and underlying mechanisms of mineral nutrient addition on forest BNF, based on the available literature.The objectives were to enhance our understanding of how mineral nutrient addition regulates forest BNF and to provide scientific data for sustainable forest management.This review focuses on the following four aspects: (1) The concept of forest BNF and the principal measuring methods;(2) The effects of mineral nutrient addition on forest BNF, including the N fixation by free-living organisms occurring in the upper soil, the lichens and mosses growing on the litter layer, and symbiotic N fixation via relationships with root nodule plants (e.g., legumes).In general, N addition decreases forest BNF, whereas addition of P or other nutrients has a positive impact.In addition, the combined addition of N and P, or P and other mineral nutrients, increases forest BNF;(3) The mechanisms underlying forest BNF can be divided into biotic (e.g., variance in the abundance or richness of N-fixing bacteria, the cover or richness of epiphytes, and the biomass of root nodule plants) and abiotic mechanisms (e.g., soil acidification and changes in the available carbon content);(4) The limitations of the current research and our suggestions for further research on forest BNF.

mineral nutrient addition;biological nitrogen fixation;nitrogen deposition;forest;nitrogenase activity

國(guó)家自然科學(xué)基金(41273143);國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃973項(xiàng)目(2011CB403204)

2014-04-24; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期:

日期:2015-05-20

10.5846/stxb201404240810

*通訊作者Corresponding author.E-mail: mojm@scib.ac.cn

鄭棉海，陳浩，朱曉敏，毛慶功，莫江明.礦質(zhì)養(yǎng)分輸入對(duì)森林生物固氮的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(24):7941-7954.

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