欒 婷，王海峰（綜述），王劍松（審校）

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科 云南省泌尿外科研究所，昆明 650101）

膀胱癌絕大多數(shù)來自上皮組織，其中90%以上為移行上皮腫瘤［1］。膀胱癌的病因復(fù)雜，與環(huán)境因素、遺傳因素、癌基因的激活和抑癌基因的失活等的作用有關(guān)，但具體的發(fā)生機制尚不清楚。目前膀胱癌的治療多數(shù)仍然采用手術(shù)為主放化療為輔的綜合治療方案，但該治療方案還存有很多問題，如手術(shù)創(chuàng)傷大、患者耐受性差、化療多重耐藥現(xiàn)象、術(shù)后復(fù)發(fā)普遍（復(fù)發(fā)率50%～70%）等，這些問題促使人們尋求更有效的治療方法、提高患者的生存率，這是泌尿外科研究的重要課題。如果能明確膀胱癌的發(fā)生機制并從基因水平對其進(jìn)行治療，就能從根本上逆轉(zhuǎn)了腫瘤的發(fā)展，從而可能達(dá)到治愈的目的，給腫瘤治療帶來新的希望。近年來基因的研究一直是膀胱癌研究的熱點問題，在動物實驗和臨床試驗中均顯示出了巨大的潛力和良好的前景。尋求一種有效的技術(shù)方法作用于目的基因一直是基因研究中的一大難題。

小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)是指利用長度為21～25 nt的小的雙鏈RNA降解同源信使 RNA（messenger RNA，mRNA）以引起特定mRNA的沉默，從而使其失去作用［2］。siRNA技術(shù)因其具備高特異性、高效性、簡便易行等特點，并且具有強大的基因阻斷作用，現(xiàn)已廣泛地用于各種疾病的基因功能研究、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因治療等方面，成為醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的研究熱點，并有望成為一種新的治療癌癥的有效途徑。利用RNA干擾沉默異常的基因的表達(dá)是在癌癥治療中新出現(xiàn)的方法，具有潛在臨床應(yīng)用價值，也為膀胱癌的基因治療開辟了一條新道路。通過查閱近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對siRNA技術(shù)在膀胱癌研究中的應(yīng)用和進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 siRNA技術(shù)的發(fā)展

1990 年 Jorgensen等為了加深矮牽牛花的紫色，向其中導(dǎo)入了一個含有強啟動子的色素基因，但結(jié)果卻是矮牽?；ǔ霈F(xiàn)顏色變淺甚至白色，研究發(fā)現(xiàn)這是因為導(dǎo)入的基因和同源的內(nèi)源基因的表達(dá)均被抑制了，這個現(xiàn)象稱為共抑制現(xiàn)象［3］。1995年，Guo 和 Kempheus［4］在研究 秀 麗線蟲中par-1基因的功能時發(fā)現(xiàn)不論是反義RNA還是作為對照的正義RNA都能阻斷par-1基因的表達(dá)。這種現(xiàn)象與當(dāng)時認(rèn)為的反義RNA技術(shù)的機制不符。1998年，F(xiàn)ire等［5］在研究華麗新小桿線蟲基因組計劃時發(fā)現(xiàn)了雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）能特異性和選擇性地抑制目的基因的表達(dá)，他們將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾。這個發(fā)現(xiàn)澄清了此前一系列令人們困惑的實驗現(xiàn)象。隨后RNA干擾在全球展開了廣泛的研究和應(yīng)用，并在動物中相繼證實。2001年，Elbashir等［6］發(fā)現(xiàn)，人工合成的長度為 21～23 nt的 dsRNA，即小片段siRNA，能觸發(fā)哺乳動物細(xì)胞的特異性RNA干擾，對哺乳動物細(xì)胞中特定的基因表達(dá)進(jìn)行抑制，從而為siRNA技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

2 siRNA技術(shù)的作用機制

在RNA干擾的起始階段，由外源導(dǎo)入的dsRNA在胞質(zhì)被dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶（dsRNA specific endonuclease，Dicer）在依賴ATP的作用下逐步切割為21～23 nt長的siRNA，又稱為引導(dǎo)RNAs。Dicer可特異識別 dsRNA，將 dsRNA降解為3'端有2個堿基突出的21～23 nt的siRNA。在RNA干擾的效應(yīng)階段，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）同時識別降解mRNA。RISC是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過與目標(biāo)mRNA完全或者部分的互補配對來實施切割或者翻譯抑制功能。在腺苷三磷酸的作用下可將雙鏈siRNA解開變?yōu)榛罨问降膯捂渟iRNA，通過堿基配對定位到同源mRNA上，特異性降解與siRNA序列互補的mRNA而引發(fā)RNA沉默，影響mRNA的穩(wěn)定性，使其失活［2］。此外，研究表明［7］RISC與mRNA結(jié)合后，在RNA依賴性RNA多聚酶的作用下可形成新的dsRNA;而切斷后的mRNA被核酸外切酶降解后，在RdRP作用下也可形成 dsRNA，新形成的dsRNA又循環(huán)上述過程，再次被Dicer酶識別、切割，形成新的siRNA并作用于靶向mRNA，這種放大的瀑布式作用能在短時間內(nèi)迅速有效地使靶向mRNA完全降解，從而抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。

與其他基因沉默的技術(shù)相比，siRNA技術(shù)有著顯著的特點和優(yōu)勢［8］:①特異性強，只能特異地降解靶基因的mRNA;且單個堿基的改變，就有可能導(dǎo)致RNA干擾作用的減弱乃至于消失;②高效性，由于siRNA技術(shù)的過程中有瀑布式放大效應(yīng)，siRNA能在低濃度下顯著抑制基因表達(dá)甚至完全敲除;③siRNA有濃度依賴性和時間依賴性;④dsRNA長度限制性，dsRNA為21～23 nt及dsRNA＞30 nt，特異性顯著降低;⑤可傳播性，siRNA可擴(kuò)散到整個機體并可傳遞給子一代。

3 siRNA技術(shù)在膀胱癌研究中的應(yīng)用

膀胱癌的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移與癌基因和抑癌基因表達(dá)的失調(diào)密切相關(guān)。如果能將失調(diào)基因的發(fā)生機制研究清楚，并對其進(jìn)行靶向治療，就能提高腫瘤治療的特異性，減少或避免治療過程中對正常組織細(xì)胞造成損害，是非常有希望的腫瘤治療方法。因此，腫瘤的靶向基因治療是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點之一，而尋找膀胱癌基因治療的靶點成為有待解決的問題。

3.1 研究膀胱癌相關(guān)基因的功能 膀胱癌的發(fā)病機制仍然不清楚，是多種因素共同作用的結(jié)果。Bc1-2基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要的促進(jìn)作用，它通過抑制細(xì)胞凋亡、促血管生成因子的分泌促進(jìn)新生血管形成、使腫瘤細(xì)胞對許多化療藥物和放療的殺傷作用產(chǎn)生耐受促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［9］。許可慰等［10］通過針對 Bcl-2基因的1009、1147、1210位點設(shè)計并合成表達(dá)siRNA的正、反義鏈DNA模板，再與帶有綠色蛋白熒光基因的pSIH1.H1-copGFP載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的目的片段在H1啟動子的作用下不斷表達(dá)shRNA，剪切生成siRNA形成RISC，持續(xù)作用于Bc1-2 mRNA切割靶轉(zhuǎn)錄體，從而抑制Bcl-2基因的表達(dá)和功能，構(gòu)建的表達(dá)人膀胱癌Bcl-2-siRNA的慢病毒載體及建立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為后期研究Bcl-2在膀胱癌發(fā)病中的作用機制提供了實驗基礎(chǔ)。

整合素連接酶（integrin-linked kinase，ILK）是控制細(xì)胞對脂多糖反應(yīng)的一個普遍表達(dá)的蛋白激酶，通過整合誘導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)來介導(dǎo)細(xì)胞的生長、運動、遷移、侵襲和血管生成［11-12］。ILK在浸潤性膀胱癌中高表達(dá)并促進(jìn)裸鼠膀胱癌移植瘤的生長。高娟等［13］通過siRNA技術(shù)沉默膀胱癌ILK基因檢測其對細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ILK siRNA通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，如Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶3，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。該結(jié)果表明ILK有望成為膀胱癌臨床診斷和治療的一個新的靶點。

3.2 在膀胱癌治療中的應(yīng)用 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種可促進(jìn)新生血管的生成和腫瘤的生長的生長因子。膀胱癌患者血清樣本中VEGF高表達(dá)與病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，同時也預(yù)示著預(yù)后差和易復(fù)發(fā)［14］。這些特點使VEGF成為膀胱癌抗血管生成療法的理想靶點，RNA干擾技術(shù)則能有效抑制VEGF的表達(dá)并降低其生物活性。Alnylam研發(fā)了一種siRNA藥物——ALN-VSP02，通過靜脈給藥來治療肝癌及其他實體瘤，并于2009年4月進(jìn)入了Ⅰ期臨床試驗，該藥靶向作用于腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的紡錘體驅(qū)動蛋白和VEGF，通過抑制兩者的表達(dá)從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，據(jù)2010年11月發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，ALN-VSP02在大部分受試者中耐受性良好［15］，這給siRNA技術(shù)應(yīng)用于膀胱癌的臨床治療帶來了希望。

凋亡抑制因子存活蛋白是一個新近克隆的凋亡抑制基因，它只存在于人的各種胚胎組織中，除胸腺和生殖腺外，在正常分化成熟組織中檢測不到它的表達(dá)，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生惡變時又重新表達(dá)。由于存活蛋白只在惡變的組織中表達(dá)，因此檢測膀胱腫瘤患者尿液中的存活蛋白，可為腫瘤的早期診斷、監(jiān)測復(fù)發(fā)以及預(yù)測預(yù)后提供幫助［16-17］。Ku等［18］利用 RNA干擾研究存活蛋白基因?qū)θ税螂装㏕24細(xì)胞的生長和對細(xì)胞周期的影響時發(fā)現(xiàn)，存活蛋白表達(dá)的增加抑制了T24細(xì)胞胱天蛋白酶3活性，從而引起細(xì)胞凋亡，說明RNA干擾能有效地抑制存活蛋白表達(dá)的T24細(xì)胞。Seth等［19］將靶向作用于存活蛋白的siRNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入膀胱癌KU-7-1uc細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)半抑制濃度僅為29 pmol/L，轉(zhuǎn)染后96 h細(xì)胞生長抑制率達(dá)40%，胱天蛋白酶3/7活性增長7～8倍:而向種植該細(xì)胞的荷瘤鼠注射0.5或1.0 mg/kg脂質(zhì)體后腫瘤體積分別下降5或10倍，均P＜0.01，表明膀胱內(nèi)灌注存活蛋白的siRNA可作為潛在治療膀胱癌的治療方式。

人源性長壽保障基因Ⅱ型（homo sapiens longevity assurance homologue2，LASS2）是我國新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、增殖、凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移中起重要作用［20］。王海峰等［21］研究膀胱癌 BIU-87、EJ、T24和EJ-M3細(xì)胞的增殖和侵襲能力時，運用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)法和蛋白質(zhì)印跡（Western blot法）檢測4株細(xì)胞中LASS2基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨著膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的增強，LASS2的表達(dá)水平降低。徐曉艷等［22-23］通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將特異性沉默LASS2基因的siRNA轉(zhuǎn)染入前列腺癌 PC-3M-2B4細(xì)胞，檢測 LASS2 siRNA對細(xì)胞LASS2基因和蛋白表達(dá)的抑制作用，結(jié)果顯示siRNA能顯著抑制PC-3M-2B4細(xì)胞LASS2基因mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制率分別為84.5%和60%。LASS2 siRNA-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過提高囊泡型V-ATP酶 （vacuolar-H+-ATPase，V-ATPase）的活性使細(xì)胞外氫離子濃度顯著升高，同時分泌活性形式的基質(zhì)金屬蛋白酶2水平增加，且細(xì)胞的體外遷移及侵襲能力明顯高于空白對照組。這些結(jié)果表明特異性siRNA沉默LASS2是通過激活V-ATPase使細(xì)胞外氫離子濃度升高，從而激活基質(zhì)金屬蛋白酶2，促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞的體外侵襲能力。因此，LASS2基因可作為一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因來用于膀胱癌的治療中。

3.3 逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥 膀胱癌目前以手術(shù)為主化療為輔的治療為主要方案，但多年來腫瘤細(xì)胞的耐藥現(xiàn)象一直困擾著臨床醫(yī)師，對抗腫瘤藥物耐藥仍然是導(dǎo)致化療患者治療失敗主要原因。隨著對分子機制研究的深入，對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象的相關(guān)基因研究也逐漸受到了人們的關(guān)注。siRNA技術(shù)作為一種基因表達(dá)沉默途徑，其應(yīng)用有望有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥現(xiàn)象。Eissa等［24］報道他們構(gòu)建了一種能下調(diào)VEGF表達(dá)水平的腺病毒載體，與化療藥物聯(lián)合使用時顯著延緩了裸鼠移植膀胱癌的生長，與單獨應(yīng)用化療藥物相比具有明顯差異，并且耐受性很好。徐曉艷等［23］利用RNA干擾技術(shù)在體外沉默JWA基因抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，發(fā)現(xiàn)還顯著增強了吉西他濱化療的敏感性。多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）指腫瘤細(xì)胞除了對作用于它的藥物產(chǎn)生耐藥，也對未作用于它的不同種類的藥物產(chǎn)生耐藥，其分子基礎(chǔ)是MDR編碼的糖蛋白過度表達(dá)，它是腫瘤細(xì)胞免受化療藥物攻擊的重要防御機制，也是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一［26］。陳從波等［27］研究設(shè)計以人膀胱癌細(xì)胞系/阿霉素細(xì)胞株MDR1基因為靶標(biāo)的siRNA，觀察其對MDR1基因表達(dá)及細(xì)胞株耐藥性的影響，結(jié)果顯示siRNA能下調(diào)MDR1基因的mRNA及蛋白表達(dá)，從而抑制該基因編碼的糖蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累量顯著增加。本實驗結(jié)果說明siRNA可能成為逆轉(zhuǎn)MDR的新方法，如果能聯(lián)合應(yīng)用多種耐藥機制的siRNA，腫瘤細(xì)胞的耐藥性將會得到更有效的逆轉(zhuǎn)。

4 問題與展望

近年來siRNA技術(shù)得到日新月異的發(fā)展，作為新的基因治療手段，siRNA技術(shù)的研究成果已經(jīng)引起了巨大反響，成為基因功能與治療研究中最有效的工具，siRNA技術(shù)具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。但在實際應(yīng)用領(lǐng)域，仍然存在一些問題有待解決:①目前siRNA分子設(shè)計面臨的主要難題是脫靶問題，人工合成的siRNA會引起非靶標(biāo)基因的沉默，這也是阻礙siRNA臨床治療發(fā)展的主要障礙［28］。②siRNA在體內(nèi)時轉(zhuǎn)染效率偏低，將siRNA靶向轉(zhuǎn)運至靶器官和靶細(xì)胞同時保證有效的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是阻礙siRNA技術(shù)用于臨床上的重要難題。目前已有研究將腺病毒作為載體在體內(nèi)實現(xiàn)RNAi［29］，但其高效性和安全性仍有待商榷，目前還需要尋找更為高效、低毒的適于人體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。③siRNA在體內(nèi)穩(wěn)定性差，作用時間短。④膀胱癌的發(fā)病機制是癌基因、抑癌基因等多種因素共同作用的結(jié)果，但目前siRNA技術(shù)的研究主要局限于對單一基因功能的沉默，這不能使膀胱癌的治療達(dá)到滿意的結(jié)果。⑤目前的研究和所得成果主要局限于動物實驗，要想應(yīng)用于臨床實踐還有很長的一段路要走。但隨著siRNA技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和生命生物工程領(lǐng)域研究的不斷深入，各個問題將被一一擊破。相信在不久的將來，通過基礎(chǔ)和臨床眾多學(xué)者的共同努力，siRNA技術(shù)必將為膀胱癌患者帶來新的希望。

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