姜樹朋(綜述)，李　艷(審校)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 武漢 430060)

檢測(cè)醫(yī)學(xué)

糾正EDTA依賴性假性血小板減少的方法學(xué)研究進(jìn)展

姜樹朋△(綜述)，李艷※(審校)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 武漢 430060)

摘要：乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)是國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)建議的血細(xì)胞計(jì)數(shù)抗凝劑，其在應(yīng)用過程中偶爾會(huì)發(fā)生EDTA依賴性假性血小板減少癥(EDTA-PTCP)。為了防止臨床誤診誤治，導(dǎo)致不必要的血小板輸注，必須對(duì)血小板計(jì)數(shù)進(jìn)行糾正。目前糾正方法主要有稀釋模式法、替代抗凝劑法、微量離心管法、藥物穩(wěn)定法、網(wǎng)織紅細(xì)胞通道法、血小板計(jì)數(shù)參考方法等。

關(guān)鍵詞：乙二胺四乙酸二鉀依賴性假性血小板減少癥；乙二胺四乙酸二鉀；血小板計(jì)數(shù)

乙二胺四乙酸二鉀(ethylene diamine tetraacetic acid dipotassium，EDTA-K2)作為血細(xì)胞計(jì)數(shù)抗凝劑，對(duì)血細(xì)胞計(jì)數(shù)影響小，其抗凝的原理是與血液中的鈣離子結(jié)合形成螯合物，進(jìn)而使鈣離子失去活性，從而阻止血液凝固[1]。但是，在偶然的情況下，EDTA-K2可誘導(dǎo)血小板中的特殊蛋白使血小板發(fā)生凝集，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀不能識(shí)別，導(dǎo)致檢測(cè)的血小板計(jì)數(shù)明顯低于實(shí)際數(shù)值，這就是EDTA依賴性假性血小板減少癥(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP)[2-5]。EDTA-PTCP本身雖無任何病理學(xué)意義，但由于發(fā)生率低而極易被忽視，導(dǎo)致臨床誤診誤治，甚至有可能進(jìn)行不必要的血小板輸注。同時(shí)，EDTA-PTCP的存在可以掩飾真正的血小板減少。因此，選擇科學(xué)可行的糾正檢測(cè)方法是十分必要的?，F(xiàn)對(duì)目前國內(nèi)外糾正EDTA-PTCP的方法學(xué)研究進(jìn)展予以綜述。

1EDTA-PTCP的臨床特點(diǎn)

臨床上，EDTA-PTCP的發(fā)生率低，為0.09%~0.21%[6]，雖然患者EDTA抗凝血在血細(xì)胞分析儀上檢測(cè)時(shí)，血小板計(jì)數(shù)明顯低于正常值，但是其凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間等凝血功能以及可引起血小板減少的疾病的相關(guān)檢查指標(biāo)(如血尿酸、肌酐、抗核抗體、抗心磷脂抗體以及補(bǔ)體C3、C4等)均在正常范圍內(nèi)。同時(shí)，患者并無出血、嘔血、黑便、血便等出血傾向，無任何自身免疫系統(tǒng)疾病、血小板疾病家族史以及使用抗血小板藥物、輸血、放療、化療等相關(guān)病史。

臨床上，若患者符合上述特點(diǎn)，應(yīng)考慮EDTA-PTCP的可能性。實(shí)驗(yàn)室檢查時(shí)，如出現(xiàn)人工血小板計(jì)數(shù)高于血細(xì)胞分析儀測(cè)定值的3~10倍，且血細(xì)胞分析儀檢測(cè)的血小板減少隨標(biāo)本抽取時(shí)間的延長而持續(xù)下降，則應(yīng)高度懷疑EDTA-PTCP。此時(shí)應(yīng)立即行顯微鏡檢查，若發(fā)現(xiàn)血小板聚集成堆，可以診斷為EDTA-PTCP[7]。 EDTA-PTCP可見于腫瘤、自身免疫性疾病、肺源性心臟病(肺心病)、晚期妊娠、肝病、毒血癥及一些不明原因的疾病患者[8]。

2EDTA-PTCP的發(fā)生機(jī)制

目前，EDTA-PTCP的發(fā)生機(jī)制仍未完全明確，其中相對(duì)確定的是，EDTA-K2作為抗凝劑，可出現(xiàn)免疫介導(dǎo)的冷抗血小板自身抗體，這種EDTA抗凝劑依賴的冷抗血小板抗體可直接作用于血小板的膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，這種抗體的FC端可與單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞膜上的FC受體結(jié)合，出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象，時(shí)間越長聚集越嚴(yán)重[9-10]。因此，在全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀上進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)會(huì)出現(xiàn)血小板假性減少。

3EDTA-PTCP情況下血小板計(jì)數(shù)的糾正方法

當(dāng)出現(xiàn)EDTA-PTCP時(shí)，須對(duì)血小板計(jì)數(shù)進(jìn)行糾正。國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的糾正方法，目前常用的糾正方法主要有以下幾種。

3.1稀釋模式法對(duì)疑似EDTA-PTCP樣本再取樣：采靜脈血40 μL置于360 μL的血細(xì)胞分析儀稀釋液中，用10×75的塑料試管盛裝，血細(xì)胞分析儀稀釋模式檢測(cè)，需注意的是從采血到檢測(cè)須在5 min內(nèi)完成[11]，否則隨時(shí)間的延長，血小板檢測(cè)值逐漸下降。該方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單，且費(fèi)用低，但是在實(shí)際工作中，住院患者如要在抽血后5 min 內(nèi)完成血常規(guī)檢查有一定的困難。

3.2替代抗凝劑法對(duì)發(fā)生EDTA-PTCP的樣本，大部分的觀點(diǎn)是改用枸櫞酸鈉抗凝，以排除血小板聚集的影響，進(jìn)而得到準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)。鄺妙歡等[12]采用枸櫞酸鈉抗凝，在10 min內(nèi)觀察血涂片，有76.9%血小板未發(fā)生聚集，采用儀器測(cè)量的血小板的平均值較手工法檢測(cè)的更符合美國臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正法規(guī) 88的標(biāo)準(zhǔn)[13]。因此，對(duì)于存在EDTA-PTCP 的樣本，可用枸櫞酸鈉抗凝樣本后，在10 min內(nèi)用儀器計(jì)數(shù)血小板數(shù)值。但是，有報(bào)道EDTA-PTCP患者的血液標(biāo)本用枸櫞酸鈉抗凝后，個(gè)別病例還是會(huì)發(fā)生聚集[14]。

3.3微量離心管法外周靜脈血瑞姬染色觀察到血小板聚集，未見血小板散在分布后，將少量用真空管采集的標(biāo)本混勻后倒入微量離心管中，適度振蕩并保持平均血紅蛋白水平、紅細(xì)胞平均血紅蛋白水平以及紅細(xì)胞平均體積變化不超過1.5%，重新測(cè)定血小板[15]，所得數(shù)據(jù)用SPSS分析。該方法雖然可以得出較為準(zhǔn)確的結(jié)果，但步驟繁瑣、可控性差。

3.4藥物穩(wěn)定法文獻(xiàn)報(bào)道，在EDTA抗凝血中加入氨基糖苷類抗生素、磷酸吡哆醛、氨茶堿等可能防止血小板凝集[16-19]。

阿米卡星，又稱丁胺卡那霉素，是一種氨基糖苷類抗生素。巫小莉等[20]研究證實(shí)，在2 mg/mL的EDTA-K2抗凝血中加入5 mg/mL丁胺卡那霉素能使患者的血小板在4 h內(nèi)保持穩(wěn)定，血涂片中的血小板無聚集現(xiàn)象。

趙麗艷等[21]亦證明，氨基糖苷類抗生素硫酸阿米卡星具有防止EDTA-PTCP患者血小板聚集以及解離已聚集的血小板的作用，并進(jìn)一步指出：硫酸阿米卡星加入到EDTA-K2樣本的時(shí)間不同，其對(duì)血小板的解離作用也是不同的，30 min內(nèi)加入硫酸阿米卡星能完全解離已聚集的血小板，涂片鏡檢可見血小板散在分布且形態(tài)正常；而30 min后加入，隨采血后時(shí)間的延長，血小板聚集的程度加重，解離效果減弱，檢測(cè)顯示血小板數(shù)逐漸減少。該實(shí)驗(yàn)提示阿米卡星加入的時(shí)機(jī)十分重要，超過30 min再加入，則不能使聚集的血小板發(fā)生解離。這樣的處理適用于臨床血常規(guī)標(biāo)本的檢測(cè)，且對(duì)正常血標(biāo)本的血小板、白細(xì)胞及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯影響。但以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅是對(duì)1例EDTA-PTCP患者進(jìn)行1年多的隨訪研究得來，樣本量太小、可靠性差。

近來又出現(xiàn)EDTA-PTCP患者應(yīng)用阿米卡星無效的病例[22]，張景全等[22]對(duì)2例EDTA-PTCP患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，將6.5 mg/mL的阿米卡星加入到2 mg/mL的EDTA-K2抗凝血中進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)糾正時(shí)，阿米卡星并不能立即解離2例患者聚集的血小板。但是，隨著時(shí)間的延長，聚集的血小板緩慢解離，在4 h后達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定，在1 h內(nèi)加入阿米卡星可以獲得理想結(jié)果。在放置時(shí)間很短的情況下，EDTA使血小板的形態(tài)發(fā)生改變，形成可逆性凝集體，全血細(xì)胞分析儀檢測(cè)時(shí)，血小板計(jì)數(shù)下降；隨著放置時(shí)間延長，EDTA使纏繞的血小板解散， 此時(shí)檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)增加。其中1例患者的抗凝血在4 h后顯微鏡檢測(cè)時(shí)，仍能觀察到部分血小板聚集，考慮為放置時(shí)間依賴合并溫度依賴的假性血小板減少。

綜上所述，阿米卡星并非對(duì)所有的EDTA-PTCP均會(huì)立即起效，需區(qū)別對(duì)待。

3.5網(wǎng)織紅細(xì)胞通道法EDTA-K2抗凝血在XE-2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀網(wǎng)織紅細(xì)胞通道檢測(cè)的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果較為可靠[23]。這是由于核酸染液在對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞中的顆粒進(jìn)行染色時(shí)，也對(duì)血小板進(jìn)行了染色，再經(jīng)散射光和熒光判斷，即可得到血小板的數(shù)量。這種方法既不會(huì)把大血小板劃入紅細(xì)胞中，也不易將紅細(xì)胞碎片誤認(rèn)為是血小板。因此，經(jīng)網(wǎng)織紅細(xì)胞通道檢測(cè)的血小板計(jì)數(shù)可作為EDTA-PTCP患者實(shí)際血小板數(shù)量，但檢測(cè)費(fèi)用會(huì)有所增加。

3.6參考方法目前國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的血小板計(jì)數(shù)的參考方法為流式細(xì)胞儀法[24]，其原理是利用免疫熒光素標(biāo)記特異的血小板單克隆抗體，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)血小板。該方法雖然精確，但是步驟復(fù)雜、檢測(cè)費(fèi)用高，不宜臨床推廣應(yīng)用。

4小結(jié)

EDTA-K2作為抗凝劑應(yīng)用于全血細(xì)胞的分析已日益普遍，但其不適用于計(jì)數(shù)臨床確診的EDTA-PTCP患者的血小板。對(duì)于血小板的糾正檢測(cè)，應(yīng)具體問題具體分析，在保證檢測(cè)質(zhì)量的前提下，使用不同的糾正方法，及時(shí)給臨床最可靠以及最有價(jià)值的檢驗(yàn)結(jié)果。另外，引起EDTA-PTCP的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究，以明確EDTA-PTCP的原因。血小板計(jì)數(shù)方法相關(guān)流程的改進(jìn)以及避免誤診的發(fā)生是檢驗(yàn)科未來應(yīng)該考慮的問題和研究方向。

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Research Development of Correction Methodology of EDTA-dependent PseudothrombocytopeniaJIANGShu-peng,LIYan.(DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Abstract:EDTA-K2 is taken as the proposed anticoagulant in blood count by International Council for Standardization in Hematology(ICSH).However,occasionally EDTA-dependency pseudothrombocytopenia (EDTA-PTCP) occurs.In order to prevent clinical misdiagnosis,mistherapy and unnecessary platelets transfusion,it is necessary to correct the platelet count.At present the main correction methods are dilution model method,alternative anticoagulant method,micro centrifuge tube method,drug stability method,reticulocyte count method,channel PLT reference method etc.

Key words:EDTA-dependent pseudothrombocytopenia; Ethylene diamine tetraacetic acid dipotassium-K2; Platelet count

收稿日期：2015-01-04修回日期：2015-01-28編輯：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.045

中圖分類號(hào)R446.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)17-3194-02