鄭偉偉 楊 民

關(guān)節(jié)軟骨是一種透明軟骨，由特殊的致密結(jié)締組織膠原纖維構(gòu)成基本框架，在這些纖維之間，散在分布著軟骨細(xì)胞，而這些軟骨細(xì)胞的功能則是維持關(guān)節(jié)軟骨的正常代謝。關(guān)節(jié)軟骨承受力學(xué)負(fù)荷，沒(méi)有神經(jīng)、血管支配，一旦損傷后難以自行修復(fù)。目前軟骨修復(fù)的治療主要是自體軟骨移植，但其來(lái)源有限，不能用于廣泛修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞的出現(xiàn)為再生組織工程提供了新了視野。研究證實(shí)，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovial mesenchymal stem cells，SMSC)較其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的成軟骨能力［1］，越來(lái)越引起人們的重視。

一、SMSCs 的來(lái)源及形態(tài)學(xué)特征

滑膜組織中間充質(zhì)干細(xì)胞含量豐富，僅需少量滑膜即可收集SMSC，研究表明，將滑膜組織移種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)兩周后，1mg 滑膜組織可收集到21000 個(gè)細(xì)胞［1］?；そM織除可在健康人體內(nèi)獲取外，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)或退行性骨關(guān)節(jié)病(OA)患者也可成為其來(lái)源，并且滑膜組織可再生，可通過(guò)關(guān)節(jié)鏡獲取。

相差顯微鏡下，SMSC 呈均一的小梭形細(xì)胞狀，胰酶消化后細(xì)胞直徑為10 ～15μm，細(xì)胞核較大，圓形，有明顯的核仁。低密度培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣。SMSC 體外培養(yǎng)分為動(dòng)態(tài)培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)在更短的間內(nèi)可分離出更多的SMSC，但其缺點(diǎn)是可能會(huì)夾雜其他間充質(zhì)干細(xì)胞［2］。根據(jù)形態(tài)，滑膜細(xì)胞主要分兩種:巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞［3］。巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞可能與先天性獲得性免疫有關(guān)，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞則產(chǎn)生滑液。SMSC 來(lái)源于成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞［4］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，培養(yǎng)兩周后細(xì)胞群中幾乎全部都是B 型細(xì)胞。

二、SMSC 的生物學(xué)特征及免疫表型

SMSC 做為成體干細(xì)胞的一種，具有自我增殖能力和多向分化潛能。SMSC 在體外傳至10 代以上仍保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，屬穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系［5］。SMSC 可向成脂、成骨、成軟骨、成肌腱纖維分化，尤其是向軟骨分化方面更具潛力。

SMSC 免疫表型與BMSC 相似，均表達(dá)CD10、CD13、CD14、CD34、CD44、CD45、CD49a、CD62e、CD73的表達(dá)均為陽(yáng)性;但第1 代細(xì)胞CD14、CD34、CD45、CD62e 和HLA-DRA 表達(dá)為陰性［6］。張正政等［7］研究發(fā)現(xiàn)人第2 ～6 代SMSC 具有相似的免疫表型，均表達(dá)CD90、CD44、CD105，不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原CD34、CD45。此外SMSC 均不表達(dá)HLA - DR 以及CD14。但以上研究并未發(fā)現(xiàn)SMSC 的特異性標(biāo)志物。

三、SMSC 向軟骨分化的優(yōu)勢(shì)

Yoshimura 等［5］通過(guò)比較肌肉、脂肪、滑膜、骨膜和骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SMSC 較其他間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，在向軟骨分化的能力上，SMSC 也明顯優(yōu)于其他間充質(zhì)干細(xì)胞。并且，滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞均來(lái)源于共同的祖細(xì)胞群，當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨存在部分缺失時(shí)，鄰近的滑膜組織會(huì)向缺損處生長(zhǎng)覆蓋，有助于軟骨修復(fù)。另外，MSC 體外培養(yǎng)后具有免疫抑制效應(yīng)，可用于MSC 的同種異體移植［8］。

四、SMSC 與誘導(dǎo)因子

近年來(lái)的研究顯示，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF -beta)超家族、骨形成發(fā)生蛋白(BMP)家族、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF -1)等均能促進(jìn)SMSC 增殖和向軟骨細(xì)胞分化，其中TGF -beta 和BMP-2 協(xié)同促進(jìn)SMSC 成軟骨的作用尤為突出［9］。有研究表明，Rho A/Rho 激酶通路的激活調(diào)控了TGF-beta 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的形成，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于體外誘導(dǎo)SMSC 分化為軟骨細(xì)胞具有重要指導(dǎo)作用［10］。此外，Kim 等［11］認(rèn)為TGF- beta1 可上調(diào)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)是通過(guò)增強(qiáng)Sox9 基因的表達(dá)，他們將TGF -beta1 通過(guò)重組反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染入SMSC，轉(zhuǎn)染后的SMSC 持續(xù)表達(dá)TGF-β1，通過(guò)流式和RT -PCR 證實(shí)過(guò)量的表達(dá)的TGF-β1 不能引起細(xì)胞表面發(fā)生改變。在體外誘導(dǎo)成軟骨，發(fā)現(xiàn)持續(xù)表達(dá)的TGF-β1 不但增強(qiáng)了SMSC增殖能力還提高了SMSC 成軟骨能力。

除生長(zhǎng)因子外，培養(yǎng)基中的離子含量也影響著間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及向軟骨組織分化。Dry 等［12］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)提高培養(yǎng)基中的Ca2+，可提高SMSC 增殖率，但不能促進(jìn)其向成骨、成軟骨、成脂方向分化。然而，在Ca2+＞1.8mmol/L 時(shí)，兔的BMSC增殖率不受其影響［13］。當(dāng)Ca2+＞0.6mmol 時(shí)，Ca2+對(duì)小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖不產(chǎn)生影響［14］。Ca2+＜5.0mmol/L 時(shí)，其對(duì)豬成骨細(xì)胞增殖率無(wú)影響，但Ca2+＞5.0mmol/L 時(shí)起抑制作用［15］。但與當(dāng)前研究相反的是，人類ADSC 在Ca2+＜0.9mmol/L 時(shí)，表現(xiàn)出增強(qiáng)的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)［16］。盡管多項(xiàng)研究表明Ca2+可以增強(qiáng)很多哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，但Ca2+對(duì)細(xì)胞的影響并不一致，這可能與細(xì)胞的類型和細(xì)胞來(lái)源有關(guān)。

此外，軟骨細(xì)胞上清液也可誘導(dǎo)SMSC 的成軟骨分化。邵博等［17］通過(guò)將軟骨細(xì)胞上清液加入微團(tuán)培養(yǎng)的SMSC 管中，微團(tuán)培養(yǎng)21 天后可見(jiàn)似軟骨樣組織，免疫組化、real time -PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的微團(tuán)表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖，誘導(dǎo)的產(chǎn)生可能與軟骨細(xì)胞分泌的一些細(xì)胞因子有關(guān)。

五、SMSC 與載體材料

將SMSC 種入材料上固定在軟骨缺損部位，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞和基質(zhì)的生成。然而，植入材料修復(fù)與天然組織相比仍具有較大的差異。軟骨基質(zhì)富含Ⅱ型膠原蛋白和硫酸糖胺聚糖，SMSC 通過(guò)誘導(dǎo)能合成大量的軟骨基質(zhì)。將SMSC 種植在含有纖維蛋白凝膠的聚乙醇酸網(wǎng)中培養(yǎng)1 個(gè)月，產(chǎn)生了大量軟骨細(xì)胞特異性的Ⅱ型膠原蛋白和硫酸糖胺聚糖［18］。

Chang 等［19］發(fā)現(xiàn)將人的SMSC 與人脫細(xì)胞關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)(ACM)混合培養(yǎng)，通過(guò)RT-PCR 發(fā)現(xiàn)ACM單獨(dú)可誘導(dǎo)SMSC 表達(dá)Ⅱ型膠原，加入誘導(dǎo)因子的ACM 可改善SMSC 成軟骨后的過(guò)度增殖導(dǎo)致再生組織肥大等問(wèn)題。ACM 可成為軟骨組織工程的載體材料，這一發(fā)現(xiàn)可能為SMSC 種入體內(nèi)過(guò)度增殖而引起再生組織肥大等問(wèn)題提供解決思路。Pei 等［20］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)SMSC 來(lái)源的去細(xì)胞基質(zhì)(DSCM)不但可以在體內(nèi)、體外促進(jìn)SMSC 增殖，還可以促進(jìn)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。此外，富血小板血漿(PRP)也可成為軟骨缺損的組織工程支架，Lee 等［21］將SMSC 植入PRP內(nèi)，種入兔軟骨缺損模型，24 周后成功修復(fù)兔軟骨缺損模型。但Lee 等［22］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)富血小板血漿(PRP)對(duì)SMSC 三系分化起著負(fù)面作用，并證實(shí)PRP 單獨(dú)應(yīng)用不能誘導(dǎo)SMSC 分化。而Elder 等［23］也證實(shí)，PRP單獨(dú)應(yīng)用不能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨。

Lee 等［24］將SMSC 植入Ⅰ型膠原/透明質(zhì)酸/纖維蛋白原(COL/ HA/ FG)復(fù)合凝膠中，注射入兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中，24 周后通過(guò)番紅O 和免疫組化染色復(fù)合凝膠產(chǎn)生透明軟骨結(jié)構(gòu)，這項(xiàng)研究表明Ⅰ型膠原/透明質(zhì)酸/纖維蛋白原(COL/ HA/ FG)復(fù)合凝膠是一個(gè)很好的用于修復(fù)軟骨缺損的材料。Shao等通過(guò)噬菌體展示技術(shù)證實(shí)了一個(gè)含有7 個(gè)氨基酸的肽序列與SMSC 具有很高的親和力，他們將這種肽序列通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)結(jié)合聚己內(nèi)酯電紡網(wǎng)格和人類脫鈣骨支架材料表面，將其與SMSC 共培養(yǎng)24h，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中的SMSC 數(shù)量較對(duì)照組有明顯增加，這項(xiàng)研究廣泛適用于SMSC 為種子細(xì)胞的組織工程。

盡管通過(guò)MSC 進(jìn)行體內(nèi)修復(fù)已達(dá)到可接受的臨床效果，但修復(fù)后的組織相較于天然組織而言，其機(jī)械性仍然較差［25］。將種子細(xì)胞誘導(dǎo)成為與正常軟骨組織相當(dāng)?shù)墓こ探M織尚需時(shí)日。種子細(xì)胞的過(guò)度增殖是再生組織工程經(jīng)常遇到的問(wèn)題，在缺損部位植入更多的細(xì)胞會(huì)收到更好的效果，因?yàn)橛行┘?xì)胞會(huì)被吸收或不能分化。將人的SMSC 種植在人脫細(xì)胞關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)(ACM)誘導(dǎo)成軟骨也可降低細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致再生軟骨肥大等問(wèn)題［19］。

六、SMSC 與相關(guān)疾病

在半月板修復(fù)中，Moriquchi 等將高密度的豬滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞在抗壞血酸的培養(yǎng)液中，通過(guò)懸浮培養(yǎng)構(gòu)建了細(xì)胞三維支架(TEC)，將MSC 植入TEC 再固定在半月板缺損處，6 個(gè)月后材料整合到相鄰半月板內(nèi)。證實(shí)SMSC 衍生的TEC 可以成為一種修復(fù)半月板缺損的再生載體材料。另外，有研究證實(shí)，源于滑膜的成纖維細(xì)胞能通過(guò)遷移增殖和分化對(duì)半月板修復(fù)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

在骨關(guān)節(jié)炎(OA)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)模型中，Ryu 等將SMSC 于硝普鈉刺激的軟骨細(xì)胞(RA 或OA模型)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，此外共培養(yǎng)后細(xì)胞能產(chǎn)生胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-1)，抑制炎性因子(NO、IL -6、CCL2/MCP -1 和CCL3/MIP-1α)的產(chǎn)生。在肌腱、韌帶的修復(fù)領(lǐng)域，SMSC 較其他MSC 在肌腱纖維分化的能力上有明顯優(yōu)勢(shì)。

七、展 望

盡管在SMSC 的體外增殖、多向分化潛能、免疫特性等方面已有了廣泛的研究，但目前還有許多尚未解決的問(wèn)題，未能篩選出SMSC 表面特異性的標(biāo)志分子。對(duì)于SMSC 的鑒定缺乏公認(rèn)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，軟骨分化的相關(guān)研究多局限于體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)，仍存在很多不足，如未找到理想的SMSC 支架材料、種植材料的過(guò)度增殖和血管翳形成等等問(wèn)題尚需要完善。此外，由于MSC 體外培養(yǎng)后具有免疫抑制效應(yīng)，可能存在潛在的激發(fā)惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，也給再生組織工程提出了更深層次的難題。

由于SMSC 具有明顯的可塑性、容易獲取、體外增殖能力強(qiáng)、來(lái)源不受患者年齡限制以及免疫調(diào)節(jié)、免疫原性弱等諸多優(yōu)點(diǎn)，被視為一種很有前景的種子細(xì)胞和生物治療藥物。因此，SMSC 已取代BMSC 成為軟骨組織工程最有潛力的種子細(xì)胞，改進(jìn)細(xì)胞三維支架，改進(jìn)誘導(dǎo)方法，提高細(xì)胞誘導(dǎo)效率，誘導(dǎo)出接近人體正常軟骨的組織工程軟骨是目前研究的重要任務(wù)之一。

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