李宗輝，孔慶濤綜述，桑 紅審校

0 引 言

微生物在環(huán)境中大多以浮游細(xì)胞形式生長(zhǎng)繁殖，但在復(fù)合體和浮游細(xì)胞密集的群體中，超過(guò)80%的微生物以群體整合的方式存活。這些群體是一種呈膜樣生長(zhǎng)的微生物集落，即生物膜，外表面被其自身分泌的富含多糖的細(xì)胞外多聚基質(zhì)(extracellular maxtrix，ECM)覆蓋，對(duì)抗菌因子有高度抵抗性［1］。由于致病真菌生物膜的形成對(duì)臨床及治療產(chǎn)生重大影響，因此對(duì)真菌生物膜的研究有重要意義［2-3］。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)多種真菌在致病過(guò)程中可形成生物膜，如白念珠菌，新生隱球菌，煙曲霉等，真菌生物膜的形成過(guò)程錯(cuò)綜復(fù)雜，受多種調(diào)控機(jī)制的影響。現(xiàn)從常見人類致病真菌生物膜形成對(duì)臨床的影響、生物膜的結(jié)構(gòu)及形成過(guò)程中的分子機(jī)制等方面進(jìn)行綜述，以期為真菌生物膜的研究提供新思路。

1 真菌生物膜的形成和結(jié)構(gòu)

生物膜是由細(xì)胞菌群及細(xì)胞外基質(zhì)組成的復(fù)雜的有機(jī)體，它的形成與表面相關(guān)，與浮游細(xì)胞相比其擁有不同的表型［4］。生物膜的形成與營(yíng)養(yǎng)素、菌群傳感分子、表面接觸等因素有關(guān)。

1.1 生物膜的形成過(guò)程 真菌生物膜形成的主要過(guò)程包括真菌細(xì)胞到達(dá)適當(dāng)?shù)奈恢?、黏附、定植、?xì)胞外基質(zhì)的形成、生物膜的成熟和分散。

以白念珠菌為例，酵母和菌絲的形態(tài)使其形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜而密集的生物膜。生物膜的形成是連續(xù)的過(guò)程，首先酵母細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞表面配體黏附到相關(guān)物體表面，隨后微菌落形成、酵母細(xì)胞經(jīng)形態(tài)轉(zhuǎn)換成菌絲，迅速形成一個(gè)由菌絲纏繞的網(wǎng)狀組織并散布芽殖的酵母細(xì)胞。隨著生物膜的成熟，富含葡聚糖的ECM 逐漸積累并包裹住生物膜，從而抵抗對(duì)宿主及一些抗真菌藥物的殺傷作用，并可能對(duì)生物膜的黏附起到一定的作用［5-6］。酵母細(xì)胞在周圍液體如血液流動(dòng)等物理壓力下從生物膜形成的位點(diǎn)播散，黏附到新底物上，形成新的生物膜［5，7］。其他念珠菌，如熱帶念珠菌、近平滑念珠菌及光滑念珠菌等均能形成包含ECM 的生物膜但不產(chǎn)生菌絲［8］。

曲霉最初以孢子形式黏附到基底，菌絲體(菌絲形式)隨生物膜的成熟而生長(zhǎng)，隨后ECM 將生物膜結(jié)合成一體。煙曲霉生物膜感染存在2 種形式:曲霉腫和曲霉病。曲霉腫感染表現(xiàn)為互相纏繞的菌絲球，而曲霉病感染是單獨(dú)分離的菌絲［9］。

阿薩希毛孢子菌、粗球孢子菌所形成的生物膜中均包含酵母和菌絲細(xì)胞兩種形式。而新生隱球菌生物膜僅含酵母細(xì)胞，及其分泌的莢膜多糖形成的ECM。雖然新生隱球菌能在交配過(guò)程中形成菌絲，但是尚未發(fā)現(xiàn)新生隱球菌生物膜中存在菌絲。肺孢子菌生物膜也不含菌絲結(jié)構(gòu)。由此可見，真菌生物膜中菌絲形成的特點(diǎn)并非一致。

1.2 生物膜細(xì)胞特異性 生物膜中的細(xì)胞(固著細(xì)胞)與非黏附細(xì)胞(浮游細(xì)胞)在表現(xiàn)型和生理學(xué)上都存在差異。與浮游細(xì)胞相比，殺滅成熟生物膜中的固著細(xì)胞需要更高濃度的抗菌藥物［10］，生物膜中脫落的細(xì)胞致病力更強(qiáng)［7］。生物膜的形成是治療失敗的主要原因。與生物膜的耐受力和抵抗力增加的相關(guān)機(jī)制包括抗菌因子滲透入生物膜的速度緩慢，生物膜中引起局部緩慢生長(zhǎng)或不生長(zhǎng)的化學(xué)微環(huán)境的改變，適應(yīng)壓力反應(yīng)，小部分極度耐受性的存留細(xì)胞的出現(xiàn)［11-13］。此外，與浮游細(xì)胞相比生物膜細(xì)胞間的水平基因轉(zhuǎn)移比率明顯偏高［14］。

2 真菌生物膜形成的臨床意義

生物膜對(duì)人類健康有重要影響，且大多影響是有害的。研究顯示大于65%的人類感染與生物膜的形成相關(guān)。此外，每年超過(guò)50 萬(wàn)患者的死亡是由生物膜相關(guān)感染引起的［15］。隨著內(nèi)置導(dǎo)管、的廣泛應(yīng)用，如靜脈留置管、導(dǎo)尿管，人工心臟瓣膜等，真菌生物膜引起的相關(guān)感染引起了人們的關(guān)注［7］。內(nèi)置醫(yī)療裝置，可作為一種基質(zhì)使真菌定植黏附其上生長(zhǎng)成為生物膜結(jié)構(gòu)，并且在一定條件下細(xì)胞能脫離引起嚴(yán)重的真菌血癥和/或播散感染。這些植入相關(guān)感染本身就難以解決并可能需要長(zhǎng)期抗真菌治療和移除植入物來(lái)控制感染。由此，真菌生物膜成為一種日益重要的臨床和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題，了解真菌生物膜在感染中的作用將有助于臨床抗感染治療。

2.1 念珠菌 白念珠菌是一種人類黏膜表面的正常共棲菌，同時(shí)也是免疫低下患者的機(jī)會(huì)致病菌，是形成生物膜的所有病原真菌中最常見的致病菌之一。而白念珠菌是血管內(nèi)導(dǎo)管相關(guān)感染的第三大原因，因此人們對(duì)其能形成生物膜的特性進(jìn)行了深入研究［16］。在義齒口腔炎中，宿主的生物黏膜和義齒的非生物表面都存在生物膜。其他非白念珠菌種也與生物膜形成、導(dǎo)管相關(guān)的血液感染、器械相關(guān)感染有關(guān)，如光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌等［7，17］?；旌系哪钪榫N生物膜也可能通過(guò)相互作用引起感染［1］。

2.2 其他酵母和絲狀菌 其他酵母和絲狀真菌也能引起生物膜相關(guān)感染，包括新生隱球菌、紅酵母、曲霉菌、厚皮馬拉色菌、毛孢子菌、莢膜組織胞漿菌、粗球孢子菌、芽生裂殖菌等［7］。

2.2.1 新生隱球菌 新生隱球菌是一種含莢膜的條件性致病菌，廣泛存在于自然界。在免疫缺陷患者中，能引起致命的腦膜腦炎［18］。新生隱球菌可在血管分流器、腹膜透析瘺、假體髖關(guān)節(jié)、心臟瓣膜上定植并形成生物膜［7］。

2.2.2 紅酵母 Nunes 等［19］對(duì)分離得到的多種紅酵母進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)紅酵母也可在其相關(guān)感染過(guò)程中形成生物膜。Canabarro 等［20］從慢性牙周炎患者的齦下生物膜感染中分離出了紅酵母。

2.2.3 曲霉 曲霉也能形成醫(yī)學(xué)上重要的生物膜［21］。曲霉菌主要在遺傳肺功能異常的患者中定植并形成生物膜，如纖維癥或慢性阻塞性肺疾?。?2］。曲霉可以在多種底物上形成生物膜，如導(dǎo)管、假體、心臟起搏器、關(guān)節(jié)置換裝置、心臟瓣膜和乳房植入物等［1，23］。此外，曲霉還能在呼吸道、尿道及輸尿管支架上以菌絲的球狀團(tuán)塊形式形成曲霉腫，這也與曲霉生物膜的形成密切相關(guān)［15］。

2.2.4 厚皮馬拉色菌 體外研究發(fā)現(xiàn)厚皮馬拉色菌能在常規(guī)應(yīng)用的醫(yī)療裝置上形成生物膜，如聚苯乙烯平板和聚氨基甲酸乙酯導(dǎo)管［15］。厚皮馬拉色菌是一種在健康貓狗黏液中存在的共棲酵母，但近年研究發(fā)現(xiàn)其已成為ICU 病房中患者真菌血癥的重要病原菌，并有學(xué)者已從患病的早產(chǎn)兒、兒童和成人中分離出。這些感染與接受有脂質(zhì)成分胃腸外營(yíng)養(yǎng)的導(dǎo)管形成的生物膜直接相關(guān)［7］。

2.2.5 其他真菌 毛孢子菌是一種機(jī)會(huì)性致病真菌，不僅能在心臟移植瓣、插入的導(dǎo)管及乳房移植物等表面形成生物膜，引起相關(guān)感染，還能導(dǎo)致威脅生命的播散性感染。莢膜組織胞漿菌，是系統(tǒng)性真菌病組織胞漿菌病的致病菌，也能在無(wú)生命表面形成生物膜［17，24］。此外，粗球孢子菌可在腦室腹膜分流管尖端的形成生物導(dǎo)致復(fù)發(fā)性腦膜炎，芽生裂殖菌與導(dǎo)管有關(guān)的真菌血癥相關(guān)。另有研究從口腔炎的義齒中分離出釀酒酵母菌［7］。

3 真菌生物膜形成的相關(guān)分子機(jī)制

近年來(lái)對(duì)于真菌生物膜在人類醫(yī)學(xué)中的作用研究越來(lái)越多，對(duì)真菌生物膜形成過(guò)程中基因的表達(dá)研究也日益增多，主要包括:與生物膜形成相關(guān)的主要基因、與對(duì)抗真菌藥物抵抗相關(guān)的基因以及黏附及細(xì)胞壁合成基因等方面。

3.1 真菌生物膜形成的基因決定因素 轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面蛋白而在調(diào)節(jié)生物膜的形成中發(fā)揮基礎(chǔ)作用，這些細(xì)胞表面蛋白能調(diào)節(jié)菌絲形成和黏附功能［25］。BCR1 是C2H2 鋅指轉(zhuǎn)錄因子，是白念珠菌生物膜形成的重要決定因子［26］。ACE2 也是C2H2 鋅指轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)其在白念珠菌黏附及菌絲形成中的作用而影響白念珠菌生物膜的形成［27］。白念珠菌增強(qiáng)菌絲生長(zhǎng)基因(enhanced filamentous growth，EFG1)是細(xì)胞表面蛋白基因和菌絲形成的調(diào)節(jié)因子，對(duì)生物膜的至關(guān)重要［25］。在光滑念珠菌、近平滑念珠菌、煙曲霉生物膜形成過(guò)程中特異性表達(dá)或上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子中，發(fā)現(xiàn)存在與BCR1、ACE2、EFG1 有相似作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，這提示BCR1、ACE2、EFG1 可能是生物膜形成的保守基因［17］。Fox 等［16］鑒定出調(diào)控白念珠菌生物膜生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)，這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)由EFG1、TEC1、BCR1、NDT80、ROB1 和BRG1 等主要轉(zhuǎn)錄因子組成。煙曲霉轉(zhuǎn)錄因子LAEA，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞表型和次級(jí)代謝基因簇，在生物膜中持續(xù)高表達(dá)［28］。

細(xì)胞壁蛋白對(duì)生物膜的形成有重要作用，不僅在黏附中起作用，可能還在促進(jìn)黏附誘導(dǎo)反應(yīng)中起到傳感作用［29］。在白念珠菌和煙曲霉中，許多細(xì)胞壁蛋白基因都在其生物膜形成的早期上調(diào)［30-31］。與浮游細(xì)胞相比，以生物膜形式生長(zhǎng)的煙曲霉表面蛋白中疏水蛋白R(shí)odA、RodB、RodD、RodE 的表達(dá)增加超過(guò)4000 倍，它們?cè)谏锬ぶ杏兄鴺O其重要的作用［29］。Gibbons 等［30］于2012 年通過(guò)對(duì)煙曲霉轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn)了10 種可能的黏附素，這些蛋白可能與白念珠菌的黏附素具有相似的作用。

3.2 真菌生物膜的基因表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)真菌生物膜細(xì)胞的基因表達(dá)與浮游細(xì)胞不同。對(duì)白念珠菌和煙曲霉生物膜形式細(xì)胞和浮游細(xì)胞基因表達(dá)譜的比較研究，揭示了生物膜形式的細(xì)胞基因表達(dá)發(fā)生重要變化［30，32］。在白念珠菌體內(nèi)外生物膜中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的特異性表達(dá)，表明生物膜的形成是受到高度調(diào)節(jié)的過(guò)程［32］。同樣在煙曲霉中，與浮游細(xì)胞相比，生物膜中近50%轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)均上調(diào)，包括許多在生殖中起作用的因子。

雖然生物膜含有休眠細(xì)胞，但白念珠菌和煙曲霉的生物膜中蛋白合成基因的表達(dá)均發(fā)生了上調(diào)。這些基因編碼核糖體蛋白、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、轉(zhuǎn)錄因子等，表明蛋白轉(zhuǎn)錄和核糖體的增加均是生物膜的特征［30-32］。在營(yíng)養(yǎng)受限的條件下，生物膜中這些特殊基因的表達(dá)特點(diǎn)可使細(xì)胞組分以最優(yōu)方式循環(huán)。

3.3 藥物抵抗基因 在真菌體外生物膜模型研究中發(fā)現(xiàn)多個(gè)與藥物抵抗相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，如煙曲霉中的多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)基因MDR1、MDR2、MDR4 ，白念珠菌的耐藥抵抗(candida drug resistance，CDR)基因CDR1、CDR2、MDR1［30］。白念珠菌MDR1 和CDR2 在體內(nèi)生物膜中表達(dá)上調(diào)，爾在對(duì)氟康唑耐藥的酵母細(xì)胞中不僅CDR1 和CDR2 過(guò)表達(dá)而且PDR16 也上調(diào)。在體內(nèi)還存在這種時(shí)相依賴性轉(zhuǎn)錄因子，如白念珠菌的CDR1、煙曲霉的MDR4［31］。此外，麥角固醇基因的表達(dá)也增加了生物膜對(duì)藥物的抵抗性。在白念珠菌和煙曲霉生物膜中，麥角固醇合成相關(guān)的基因表達(dá)均上調(diào)［30-31］。從患者分離的白念珠菌標(biāo)本中，ERG基因表達(dá)及多種藥物抵抗轉(zhuǎn)錄因子的增加與菌株對(duì)唑類藥物抵抗性的增加一致，然而它們?cè)诔墒焐锬ぶ械谋磉_(dá)對(duì)唑類藥物抵抗的影響仍有待研究［28］。

3.4 黏附基因 黏附基因表達(dá)的增加也是生物膜細(xì)胞的一個(gè)特性。在白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌中均存在凝集素樣序列家族(agglutinin-like sequence，ALS)，其編碼細(xì)胞表面黏附素糖蛋白并在生物膜形成中起重要作用［33］。在已知的黏附基因中，ALS1 在白念珠菌生物膜狀態(tài)下上調(diào)最明顯［34］，Garcia-Sanchez 等［32］指出ALS 基因在生物膜中特異性表達(dá)，在生物膜轉(zhuǎn)錄組序列中自主調(diào)控。白念珠菌ALS 家族包括8 個(gè)基因(ALS1-ALS7 和ALS9)，編碼多種表面糖蛋白［34］。Nett 等［31］觀察到生物膜形成的不同階段ALS 基因的表達(dá)不同，并可能在體內(nèi)有重疊的功能。在生物膜形成過(guò)程中ALS3 基因高度表達(dá)，并與白念珠菌菌絲的形成明顯相關(guān);ALS2 蛋白表達(dá)的降低會(huì)降低生物膜的菌體量，主要在生物膜生長(zhǎng)的后期階段起作用［33-34］。煙曲霉體外生物膜中的凝集素有相似的表達(dá)形式。以上提示生物膜黏附基因的誘導(dǎo)表達(dá)與基本生理過(guò)程及治療進(jìn)程密切相關(guān)。此外，白念珠菌黏附編碼基因EAP1介導(dǎo)其向表皮細(xì)胞的黏附。EAP1 的表達(dá)受正負(fù)調(diào)控，Sir 介導(dǎo)的沉默使其在細(xì)胞間表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性。而在光滑念珠菌中，EPA6 也起到黏附功能［33］。

3.5 氨基酸合成基因 與白念珠菌浮游細(xì)胞相比，在生物膜合成過(guò)程中合成大量氨基酸，特別是硫氨基酸合成與核酸合成等基礎(chǔ)代謝基因的表達(dá)均上調(diào)［31］。許多氨基酸是由生物膜形成所需要的轉(zhuǎn)錄活化因子GCN4 調(diào)節(jié)。在煙曲霉生物膜中，氨基酸透酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨基肽酶等蛋白的代謝基因也上調(diào)。在煙曲霉生物膜中次級(jí)代謝基因上調(diào)明顯，這可能與次級(jí)代謝調(diào)節(jié)因子LAEA 的上調(diào)有關(guān)［30］。

3.6 細(xì)胞壁合成基因 在誘導(dǎo)生物膜形成的條件下，可表達(dá)許多細(xì)胞壁合成基因。FKS1、BGL2、PHR1、XOG1 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外多糖的產(chǎn)生，在生物膜中特異性表達(dá)，對(duì)β1，3 葡聚糖的遞呈和成熟、細(xì)胞外基質(zhì)的積累較為重要［35］。在生長(zhǎng)至24 h 的白念珠菌生物膜中可觀察到β1，3 葡聚糖降解酶的表達(dá)下調(diào)，然而在煙曲霉中并未發(fā)現(xiàn)α 和β1，3 葡聚糖合成基因表達(dá)的改變［31］。菌絲體細(xì)胞外基質(zhì)中α1，3 葡聚糖、胺基半乳糖、半乳甘露聚糖的出現(xiàn)與煙曲霉菌絲的氣生生長(zhǎng)直接相關(guān)［29］。在已發(fā)現(xiàn)的煙曲霉細(xì)胞壁基因中50%以上的基因在生物膜中表達(dá)改變，包括ROD 基因的上調(diào)。因此，雖然機(jī)制可能不同，但白念珠菌和煙曲霉生物膜中的細(xì)胞表面都發(fā)生了重建。

真菌生物膜的含蓋面較廣，其形成所涉及的調(diào)節(jié)因子能在不同的生物膜結(jié)構(gòu)中保存。如白念珠菌和煙曲霉的生物膜相關(guān)基因，均能在其他形成生物膜的菌種中發(fā)現(xiàn)。這些表達(dá)增加的特異性生物膜相關(guān)基因，不僅包括菌絲基因，還包括轉(zhuǎn)錄因子和蛋白合成基因。與黏附中的基因表達(dá)不同，生物膜中細(xì)胞壁及基礎(chǔ)代謝相關(guān)基因的表達(dá)均增加。此外，生物膜中高度耐藥細(xì)胞的持續(xù)出現(xiàn)對(duì)整體生物膜也有著重要作用［28］。

4 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，隨著真菌感染患者的不斷增加及真菌生物膜相關(guān)感染對(duì)治療手段的抵抗，真菌生物膜導(dǎo)致的感染成為一個(gè)亟需解決的臨床問(wèn)題。盡管人們對(duì)真菌生物膜尤其是白念珠菌生物膜的生長(zhǎng)、特異性的生物學(xué)過(guò)程以及分子機(jī)制等進(jìn)行了較為詳盡的研究，但能否利用這些研究來(lái)研發(fā)新的治療策略仍需進(jìn)一步深入研究。

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