劉吉星，侯博儒，楊文楨(綜述)，任海軍(審校)

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，蘭州 730030)

神經(jīng)干細(xì)胞移植治療創(chuàng)傷性顱腦損傷的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展

劉吉星△，侯博儒，楊文楨(綜述)，任海軍※(審校)

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，蘭州 730030)

摘要：神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，是一類具有永生增殖能力和多向分化潛能的細(xì)胞。動物實(shí)驗(yàn)表明，創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)后行NSCs移植治療可改善受損的運(yùn)動、感覺等神經(jīng)的功能以及認(rèn)知功能，還能在一定程度上抑制早期神經(jīng)炎癥和病情的進(jìn)展。NSCs在TBI的治療中應(yīng)用前景廣闊，但其作用機(jī)制復(fù)雜，仍面臨著來源、增殖分化調(diào)控、安全性、神經(jīng)環(huán)路重建等問題，還有待進(jìn)一步的研究。

關(guān)鍵詞：創(chuàng)傷性顱腦損傷；神經(jīng)干細(xì)胞；動物模型；移植

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科常見疾病之一，是導(dǎo)致<45歲個體死亡的首要原因，并有著較高的致殘率。最近一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，兒童和青少年TBI后致殘率>20%[1]。目前，對TBI所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損害的治療主要是采用神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)康復(fù)，但由于TBI后受損神經(jīng)元難以自我修復(fù)，且機(jī)體很難產(chǎn)生新的功能性神經(jīng)元，因而難以取得理想療效。在過去的30年中，人們建立TBI動物模型觀察并分析TBI后的病理生理變化，以探索行之有效的治療方法，但在TBI動物實(shí)驗(yàn)中被認(rèn)為有效的神經(jīng)保護(hù)劑，大部分在后續(xù)的Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)中失敗，由此需要重新考慮TBI的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并適時調(diào)整研究策略和治療方法[2]。近年來神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)移植治療TBI逐漸成為熱點(diǎn)之一，現(xiàn)對NSCs治療TBI的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展予以綜述。

1NSCs移植治療實(shí)驗(yàn)中常采用的TBI動物模型

1.1 液體沖擊傷(fluid percussion injury，F(xiàn)PI)模型 模型液壓裝置由有機(jī)玻璃管、鐘擺打擊裝置、示波器以及壓力傳感器組成，有機(jī)玻璃管接活塞，另一端接打擊管和壓力傳感器，管道內(nèi)用37 ℃生理鹽水密封，調(diào)整打擊錘下落高度，撞擊活塞推動液體前進(jìn)，經(jīng)打擊管傳導(dǎo)至顱。打擊使腦組織出現(xiàn)短暫的移位和變形，損傷的嚴(yán)重程度取決于壓力脈沖的強(qiáng)度。FPI可復(fù)制無顱骨骨折的TBI，中度至重度TBI往往與顱骨骨折和挫傷跨多個腦回相聯(lián)系，而FBI不能復(fù)制這些，但FPI能復(fù)制TBI病理生理學(xué)特征性變化，如：局灶性皮質(zhì)挫傷和彌漫性的(如海馬和丘腦)皮質(zhì)下神經(jīng)元損傷、顱內(nèi)出血、腦腫脹以及進(jìn)行性灰質(zhì)損傷[3]。多次輕微的PFI可導(dǎo)致長期累積效應(yīng)——慢性神經(jīng)炎癥、皮質(zhì)缺失，并產(chǎn)生神經(jīng)行為和認(rèn)知功能障礙如運(yùn)動障礙、記憶障礙、癲癇以及精神異常等[4]。FPI通常選擇在大鼠前囟與人字縫間、矢狀縫外側(cè)>3.5 mm的位置進(jìn)行，相比其他模型，F(xiàn)PI具有較高的死亡率，這可能是因?yàn)楦咭簤鹤饔糜谠搮^(qū)域引起下丘腦綜合征或波及腦干而發(fā)生呼吸暫停[5]。FPI模型的腦損傷機(jī)制與人TBI不盡一致，無法全面反映人TBI，不適于TBI的生物力學(xué)研究。

1.2自由落體撞擊模型 自由落體撞擊傷模型由Scott于1940年建立并用于腦損傷研究[6]，后經(jīng)改良而常用于復(fù)制閉合性加速性顱腦創(chuàng)傷，其中Feeney模型和Marmarou模型應(yīng)用較為廣泛。自由落體模型需要暴露顱骨，腦損傷程度可通過調(diào)整自由落體的重物重量和高度控制[7]。Feeney模型需要開顱去除打擊部位的顱骨，使自由落體的撞擊力傳遞到完整的硬腦膜，并造成皮質(zhì)挫傷。形態(tài)學(xué)上，這些損傷在傷后1 h表現(xiàn)為挫傷皮質(zhì)下白質(zhì)區(qū)的出血，并在未來24 h內(nèi)直接進(jìn)展為壞死腔，在接下來的2周內(nèi)壞死腔可能會向周圍擴(kuò)展。Marmarou等[8]創(chuàng)建了彌散性軸突損傷(diffuse axonal injury，DAI)模型——Marmarou撞擊加速模型以模仿人類高處墜落或交通事故引起的DAI。在這一模型中，大鼠被置于海綿床上，沿正中線切開頭皮顯露顱骨，不銹鋼墊片固定于顱骨中央、人字點(diǎn)與前囪之間。Marmarou模型可引起雙側(cè)大腦廣泛的神經(jīng)元、軸突、樹突、微血管系統(tǒng)損傷，尤其是胼胝體、內(nèi)囊、視束、大腦腳、腦干的長束等部位，其缺點(diǎn)是損傷程度存在相對較高的變異性，但因成本低、簡單易行，能產(chǎn)生不同分級的DAI，且與人TBI高度類似，因而得到廣泛應(yīng)用[2]。

1.3控制性皮質(zhì)撞擊損傷(controlled cortical injury，CCI)模型 CCI模型使用氣壓、電磁等裝置驅(qū)動剛性活塞撞擊暴露的硬腦膜，模仿皮質(zhì)損傷、急性硬膜下血腫、軸突損傷、腦震蕩、血腦屏障功能障礙甚至昏迷等[9]。CCI在研究損傷程度較輕的TBI中具有較大優(yōu)勢，在嚙齒類動物腦震蕩模型中，輕微CCI后腦灌注及腦血流量降低，但無腦脊液漏；病理組織學(xué)研究證實(shí)，輕度CCI后，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞Fluoro Jade染色陽性率增加，皮層神經(jīng)元、樹突棘及突觸的數(shù)量減少[10]。CCI腦損傷程度與打擊速度、變形深度有關(guān)，當(dāng)撞擊速度>4.3 m/s、腦組織變形>1 mm時可引起廣泛性神經(jīng)元損傷，且損傷能夠擴(kuò)散，造成急性皮質(zhì)、海馬、丘腦的變性，皮層下白質(zhì)、內(nèi)囊、腦干等部位可見DAI表現(xiàn)[11]。相對于其他TBI模型，CCI模型可對機(jī)械因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，如速度、時間、撞擊深度，適用于TBI生物力學(xué)研究[12-13]。同自由落體撞擊模型相比，CCI模型避免了撞擊反彈引起二次傷害風(fēng)險。對CCI模型進(jìn)行調(diào)控可滿足特定實(shí)驗(yàn)的需求，因而被廣泛用于分析神經(jīng)元壞死和神經(jīng)缺陷的代謝、分子、遺傳機(jī)制的研究，但其設(shè)備昂貴、復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)精度要求高，操作較為復(fù)雜。

2NSCs治療TBI

2.1NSCs的定義 NSCs是一類可生成神經(jīng)組織或來源于神經(jīng)系統(tǒng)，具有自我更新能力，可通過不對稱細(xì)胞分裂產(chǎn)生除自我子代以外的其他類型的細(xì)胞。NSCs不僅存在于胚胎期的腦組織中，在發(fā)育成熟的腦組織也有NSCs的存在，其主要分布在前腦的室管膜下區(qū)和海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞下層。Dash等[14]發(fā)現(xiàn)，TBI后嚙齒類動物海馬區(qū)顆粒細(xì)胞層神經(jīng)細(xì)胞再生增加，但大部分神經(jīng)再生形成了星形膠質(zhì)細(xì)胞，說明自體NSCs在神經(jīng)組織損傷后能進(jìn)行自我代償修復(fù)，但是能力有限。

2.2自體和異體NSCs移植自體NSCs經(jīng)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后移植避免了移植后免疫排斥反應(yīng)。相對而言，自體移植的NSCs具有較高的存活率，但自體NSCs的提取是有創(chuàng)的，會加重?fù)p傷甚至直接導(dǎo)致死亡[15]?？寺〖夹g(shù)的發(fā)展似乎帶來了解決這一問題的曙光，但該技術(shù)復(fù)雜、耗時長、成本高，且存在醫(yī)學(xué)倫理限制，因而目前難以廣泛應(yīng)用。目前異體NSCs移植的研究較多，但異體移植后存活率低，這可能與免疫排斥以及增殖分化受機(jī)體微環(huán)境影響有關(guān)。異體NSCs移植能改善運(yùn)動功能，但是對認(rèn)知功能的改善作用并不明顯[16]。

2.3植入時間和部位的選擇 目前關(guān)于最佳移植時間和移植部位尚無統(tǒng)一結(jié)論，還需要更多的研究加以證實(shí)。TBI后腦組織可發(fā)生水腫、神經(jīng)元細(xì)胞死亡及炎癥反應(yīng)，尤其是TBI早期小膠質(zhì)細(xì)胞的活化可產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，其可發(fā)揮巨噬細(xì)胞樣功能，并產(chǎn)生炎性介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后可通過多種方式對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行更改，包括促進(jìn)神經(jīng)元死亡，影響神經(jīng)環(huán)路信息傳遞、神經(jīng)修復(fù)性重組以及突觸剝離[17]。急性期(傷后3 h~3 d)炎性介質(zhì)、促炎因子、興奮毒性神經(jīng)遞質(zhì)以及自由基的大量釋放可產(chǎn)生神經(jīng)毒性和氧化應(yīng)激反應(yīng)，這些均可能影響植入NSCs的生長和存活[18]。Lee等[19]將NSCs直接植入到腦出血模型大鼠的病灶部分發(fā)現(xiàn)，NSCs具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，超急性期(傷后2 h)植入可減少早期神經(jīng)元的凋亡、降低腦水腫的形成、減少炎性浸潤；早期植入(傷后24 h)可減少腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和核因子κB的生成。雖然小膠質(zhì)細(xì)胞的激活影響植入NSCs的增殖、分化、存活以及遷移，但相應(yīng)的NSCs也會調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的功能和活動，兩者相互作用、相互影響[20]。Shear等[21]以CCI動物模型為基礎(chǔ)，分別在傷后第2 、7、14 天將NSCs立體定向移植到受傷側(cè)紋狀體或?qū)?cè)皮質(zhì)區(qū)，在移植后第1周、2周、7周時對小鼠的運(yùn)動能力進(jìn)行評估，在移植后第5周對空間學(xué)習(xí)能力進(jìn)行評估，在移植后第8周對NSCs的存活、移位、分化進(jìn)行組織學(xué)檢查，以觀察最佳的移植條件。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①外傷后2~7 d是最優(yōu)的移植時間窗；②移植時間并不影響短期的表型分化；③移植部位影響NSCs的表型和功效，移植到鄰近損傷灶皮質(zhì)區(qū)或紋狀體的NSCs具有更高的存活率、更強(qiáng)的遷移能力，大鼠的運(yùn)動功能也能得到更迅速的部分恢復(fù)；⑤NSCs的調(diào)控功能不因NSCs遷移和分化表型的差異而改變。

大鼠TBI后急性期，部分神經(jīng)環(huán)路中的主神經(jīng)元、γ-氨基丁酸(gamma-amino butyric acid，GABA)能中間神經(jīng)元數(shù)量減少，同時小膠質(zhì)細(xì)胞激活，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子出現(xiàn)，異常神經(jīng)元發(fā)生或新生神經(jīng)元異常遷移[22]。TBI急性期齒狀回表達(dá)reelin蛋白的中間神經(jīng)元數(shù)量減少，而reelin蛋白被認(rèn)為與皮質(zhì)的發(fā)育及形成密切相關(guān)[23]。TBI急性期NSCs移植干預(yù)調(diào)制了這些不利影響，NSCs分化形成的GABA能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF)、成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)、胰島素樣生長因子1、血管內(nèi)皮生長因子等[24]，其中BDNF、GNDF和FGF-2能抑制海馬損傷后癲癇的發(fā)生。若TBI導(dǎo)致海馬神經(jīng)元受損，GABA能阻止海馬神經(jīng)元軸突內(nèi)淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)蓄積。APP增多導(dǎo)致的軸突腫脹進(jìn)而影響軸漿運(yùn)輸被認(rèn)為是TBI后神經(jīng)元變性發(fā)展為認(rèn)知功能障礙的原因之一[25]?？傊?，TBI急性期NSCs移植在一定程度上能改善受損的記憶、認(rèn)知和精神障礙，并抑制癲癇的發(fā)生或減輕發(fā)作的頻率和強(qiáng)度[26]。

2.4TBI中NSCs神經(jīng)修復(fù)的潛在機(jī)制 近年來，NSCs的特性及神經(jīng)修復(fù)作用已被公認(rèn)，但是NSCs移植治療TBI的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。到目前為止，關(guān)于NSCs移植治療TBI的修復(fù)機(jī)制有兩大主流“學(xué)說”：①“細(xì)胞替換” 移植的NSCs進(jìn)入受體后成活、分化后替換受損或凋亡的神經(jīng)元并重建受體受損的突觸回路；②“旁觀者效應(yīng)” 移植的外源性NSCs進(jìn)入受體后分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗炎物質(zhì)、抗氧化應(yīng)激分子等拯救受損的受體細(xì)胞，啟動受體NSCs內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，使受損區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)得以恢復(fù)[27]。最近Tajiri等[28]提出了“干細(xì)胞生物橋梁”的概念：移植的干細(xì)胞在宿主體內(nèi)形成一個生物通路，這個通路富含基質(zhì)金屬蛋白酶，它將室管膜下區(qū)的內(nèi)源性NSCs擺渡到受損傷的腦組織區(qū)域以完成修復(fù)。

3NSCs移植治療TBI存在的問題

雖然大量動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NSCs移植對TBI有一定的治療作用，但其作用機(jī)制復(fù)雜，仍需進(jìn)一步研究。未來的研究應(yīng)著重于以下幾個問題：①如何對植入的NSCs進(jìn)行調(diào)控，使其有更高的存活率，并向損傷區(qū)遷移、發(fā)生定向分化以修復(fù)受損的神經(jīng)；②探索最佳的植入手段、植入時間、植入部位、植入數(shù)量以及移植治療持續(xù)的療程；③移植后產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)、致瘤性等。

4小結(jié)

總之，NSCs移植作為治療TBI的新方法，能從細(xì)胞水平上對受損的神經(jīng)進(jìn)行修復(fù)和保護(hù)。隨著對NSCs研究的進(jìn)一步深入，相信不久的將來NSCs移植治療定會翻開嶄新的一頁，實(shí)現(xiàn)從動物實(shí)驗(yàn)到臨床治療的轉(zhuǎn)化，使其成為治療TBI的重要方法之一。

參考文獻(xiàn)

[1]Thurman DJ.The Epidemiology of Traumatic Brain Injury in Children and Youths:A Review of Research Since 1990[J].J Child Neurol,2014,10(1177):1-8.

[2]Xiong Y,Mahmood A,Chopp M.Animal models of traumatic brain injury[J].Nat Rev Neurosci,2013,14(2):128-142.

[3]Alder J,Fujioka W,Lifshitz J,etal.Lateral fluid percussion:model of traumatic brain injury in mice[J].J Vis Exp,2011,22(54):1-6.

[4]Shultz SR,Bao F,Omana V,etal.Repeated mild lateral fluid percussion brain injury in the rat causes cumulative long-term behavioral impairments,neuroinflammation,and cortical loss in an animal model of repeated concussion[J].J Neurotrauma,2012,29(2):281-294.

[5]Cernak I.Animal models of head trauma[J].Neuro Rx,2005,2(3):410-422.

[6]Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury:I.Methodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211(1):67-77.

[7]Morales DM,Marklund N,Lebold D,etal.Experimental models of traumatic brain injury:do we really need to build a better mousetrap?[J].Neuroscience,2005,136(4):971-989.

[8]Marmarou A,Foda MA,van den Brink W,etal.A new model of diffuse brain injury in rats.Part I:Pathophysiology and biomechanics[J].J Neurosurg,1994,80(2):291-300.

[9]Washington PM,Forcelli PA,Wilkins T,etal.The effect of injury severity on behavior:a phenotypic study of cognitive and emotional deficits after mild,moderate,and severe controlled cortical impact injury in mice[J].J Neurotrauma,2012,29(13):2283-2296.

[10]Petraglia AL,Dashnaw ML,Turner RC,etal.Models of mild traumatic brain injury:translation of physiological and anatomic injury[J].Neurosurgery,2014,75 Suppl 4:S34-49.

[11]Chauhan NB,Gatto R,Chauhan MB.Neuroanatomical correlation of behavioral deficits in the CCI model of TBI[J].J Neurosci Methods,2010,190(1):1-9.

[12]Wang HC,Ma YB.Experimental models of traumatic axonal injury[J].J Clin Neurosci,2010,17(2):157-162.

[13]Mao H,Zhang L,Yang KH,etal.Application of a finite element model of the brain to study traumatic brain injury mechanisms in the rat[J].Stapp Car Crash J,2006,50:583-600.

[14]Dash PK,Mach SA,Moore AN.Enhanced neurogenesis in the rodent hippocampus following traumatic brain injury[J].J Neurosci Res,2001,63(4):313-319.

[15]Poser SW,Androutsellis-Theotokis A.Spicing up endogenous neural stem cells:aromatic-turmerone offers new possibilities for tackling neurodegeneration[J].Stem Cell Res Ther,2014,5(6):127.

[16]Harting M,Jimenez F,Pati S,etal.Immunophenotype characterization of rat mesenchymal stromal cells[J].Cytotherapy,2008,10(3):243-253.

[17]Cao T,Thomas TC,Ziebell JM,etal.Morphological and genetic activation of microglia after diffuse traumatic brain injury in the rat[J].Neuroscience,2012,225:65-75.

[18]Wang LQ,Lin ZZ,Zhang HX,etal.Timing and Dose Regimens of Marrow Mesenchymal Stem Cell Transplantation Affect the Outcomes and Neuroinflammatory Response After Ischemic Stroke[J].CNS Neurosci Ther,2014,20(4):317-326.

[19]Lee ST,Chu K,Jung KH,etal.Anti-inflammatory mechanism of intravascular neural stem cell transplantation in haemorrhagic stroke[J].Brain,2008,131(3):616-629.

[20]Su P,Zhang J,Zhao F,etal.The interaction between microglia and neural stem/precursor cells[J].Brain Res Bull,2014,109:32-38.

[21]Shear DA,Tate CC,Tate MC,etal.Stem cell survival and functional outcome after traumatic brain injury is dependent on transplant timing and location[J].Restor Neurol Neurosci,2011,29(4):215-225.

[22]Shetty AK,Hattiangady B,Rao MS.Vulnerability of hippocampal GABA-ergic interneurons to kainate-induced excitotoxic injury during old age[J].J Cell Mol Med,2009,13(8B):2408-2423.

[23]Feng L,Allen NS,Simo S,etal.Cullin 5 regulates Dab1 protein levels and neuron positioning during cortical development[J].Genes Dev,2007,21(21):2717-2730.

[24]Wang E,Gao J,Yang Q,etal.Molecular mechanisms underlying effects of neural stem cells against traumatic axonal injury[J].J Neurotrauma,2012,29(2):295-312.

[25]Miltiadous P,Kouroupi G,Stamatakis A,etal.Subventricular zone-derived neural stem cell grafts protect against hippocampal degeneration and restore cognitive function in the mouse following intrahippocampal kainic acid administration[J].Stem Cells Transl Med,2013,2(3):185-198.

[26]Shetty AK.Hippocampal injury-induced cognitive and mood dysfunction,altered neurogenesis,and epilepsy:Can early neural stem cell grafting intervention provide protection?[J].Epilepsy Behav,2014,38:117-124.

[27]Butti E,Cusimano M,Bacigaluppi M,etal.Neurogenic and non-neurogenic functions of endogenous neural stem cells[J].Front Neurosci,2014,8:92.

[28]Tajiri N,Duncan K,Antoine A,etal.Stem cell-paved biobridge facilitates neural repair in traumatic brain injury[J].Front Syst Neurosci,2014,8:116.

Neural Stem Cells Transplantation in Treatment of Traumatic Brain InjuryLIUJi-xing,HOUBo-ru,YANGWen-zhen,RENHai-jun.(DepartmentofNeurosurgery,theSecondHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730030,China)

Abstract：Neural stem cells (NSCs) is defined the cells having the ability of immortalization proliferation and multi-directional differentiation potential located in the nervous system.In animal models of traumatic brain injury(TBI),NSCs transplantation is affirmed as an efficient therapeutic method which can improve and protect neural function such as the motor,sensory and cognitive ability,which could also inhibit the neuroinflammation at early time and pathogenetic condition development to some degree.The application of NSCs in TBI has broad prospects despite the problems of complicated functioning mechanisms,sourcing,regulation of proliferation and differentiation,safety,neural circuits renewal and so on.

Key words：Traumatic brain injury； Neural stem cells； Animal models； Transplantation

收稿日期：2015-04-01修回日期：2015-06-30編輯：辛欣

基金項(xiàng)目：甘肅電信萃英科研基金(lzudxcy-2014-8)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.004

中圖分類號：R651.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)24-4426-03