朱 麗，朱華英，徐玲娣，陳廷美，劉頌平

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；2. 江蘇大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院/鎮(zhèn)江市婦幼保健院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

論 著

子癇前期患者胎盤(pán)中miRNA-21及Th17相關(guān)因子的表達(dá)及其關(guān)系

朱 麗1，朱華英2，徐玲娣2，陳廷美2，劉頌平2

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；2. 江蘇大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院/鎮(zhèn)江市婦幼保健院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

目的探討胎盤(pán)中Th17細(xì)胞相關(guān)因子IL-17、IL-21、RORc、人類(lèi)白細(xì)胞抗原-G(HLA-G)蛋白及胎盤(pán)中微小RNA(micro-ribonucleic acid,miRNA)-21在子癇前期發(fā)病中的作用。方法選擇孕33～37周行剖宮產(chǎn)分娩的子癇前期產(chǎn)婦20例作為子癇前期組，選擇孕38周以上自愿要求行剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦20例作為正常對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)胎盤(pán)組織中IL-17、IL-21、RORc 、HLA-G蛋白以及miRNA-21的表達(dá)量。結(jié)果子癇前期組胎盤(pán)中IL-17、IL-21及miRNA-21相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常對(duì)照組(P均<0.01)，RORc和HLA-G相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)。2組胎盤(pán)組織中IL-17、IL-21及miRNA-21表達(dá)均呈正相關(guān),RORc和HLA-G表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論子癇前期患者胎盤(pán)組織中miRNA-21表達(dá)升高，促使Th17細(xì)胞激活，導(dǎo)致IL-17和IL-21分泌增加；同時(shí)miRNA-21表達(dá)升高，使得RORc mRNA和HLA-G mRNA的穩(wěn)定性降低，產(chǎn)生基因沉默影響轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致RORc和HLA-G表達(dá)減少。IL-17、IL-21、RORc 、HLA-G蛋白以及miRNA-21可能與子癇前期發(fā)病有關(guān)。

子癇前期；miRNA-21；Th17細(xì)胞相關(guān)因子

懷孕前血壓正常的孕婦在妊娠20周以后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿稱(chēng)為子癇前期或前兆子癇(preeclampsia,PE)，其是妊娠期孕婦的并發(fā)癥之一，有2%～7%首次受孕的健康孕婦深受其害[1]。子癇前期常伴隨早產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限、圍生期胎兒死亡以及子女成年后長(zhǎng)期健康問(wèn)題等[2]，并會(huì)增加孕產(chǎn)婦和嬰兒在未來(lái)患心血管疾病以及2型糖尿病(T2DM)的危險(xiǎn)[3]。目前子癇前期的致病機(jī)制尚未闡明[4]。隨著對(duì)表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控在多種復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其中微小RNA(micro-ribonucleic acid,miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的最重要的表觀遺傳調(diào)控現(xiàn)象之一[5]。本研究探討了子癇前期患者胎盤(pán)中miRNA-21及Th17相關(guān)因子IL-17、IL-21、RORc、HLA-G的表達(dá)情況及其相關(guān)性，旨在為子癇前期針對(duì)性治療提供新的想法和依據(jù)。

1 臨床資料

1.1研究對(duì)象 選擇2012年3月—2014年5月在鎮(zhèn)江市婦幼保健院行剖宮產(chǎn)分娩的孕33～38周子癇前期孕婦20例作為子癇前期組，年齡25～29(28.5±2.2)歲。孕前子癇前期診斷參照《婦產(chǎn)科學(xué)》[6]標(biāo)準(zhǔn)：BP≥160/110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；尿蛋白≥2.0 g/24 h或定性試驗(yàn)≥()；血清肌酐>106 μmol/L，除非以前就已有升高；血小板<100×109L-1；毛細(xì)血管病性溶血(LDH升高)；ALT或AST升高；持續(xù)性頭痛或其他大腦或視覺(jué)障礙；持續(xù)性上腹痛。選擇孕38周以上自愿要求行剖宮產(chǎn)正常產(chǎn)婦20例作為正常對(duì)照組，年齡25～28(27.9±3.0)歲。2組產(chǎn)婦均無(wú)高血壓、心臟病、腎病、糖尿病、血小板減少等病史，無(wú)近期感染證據(jù)，未經(jīng)生殖技術(shù)幫助，無(wú)免疫性疾病，未經(jīng)免疫藥物治療，2組產(chǎn)婦年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2標(biāo)本的采集 待胎盤(pán)娩出后，于胎盤(pán)正中母體面避開(kāi)鈣化灶取1 cm×1 cm×1 cm大小的全層胎盤(pán)組織1塊，經(jīng)無(wú)菌生理鹽水反復(fù)漂洗后置入無(wú)RNA酶的EP管中，保存于-80 ℃冰箱待PCR成批檢測(cè)。

1.3檢測(cè)方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)檢測(cè)2組胎盤(pán)組織中miRNA-21的相對(duì)表達(dá)量: ①Tiangen Biotech提取胎盤(pán)組織總RNA，按說(shuō)明書(shū)操作。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20 ℃保存。③PCR擴(kuò)增：試劑盒(FP401)購(gòu)自日本Toyobo公司，采用U6 RNA(一種小核RNA，參與前體RNA剪接體的構(gòu)成)作為內(nèi)參照。所用引物由試劑公司設(shè)計(jì)合成。熒光定量PCR條件設(shè)置：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用PCR技術(shù)檢測(cè)2組絨毛和蛻膜中目的基因IL-17、IL-21、RORc及HLA-G表達(dá)量：①Tiangen Biotech提取細(xì)胞總RNA,按說(shuō)明書(shū)操作。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20 ℃保存。③PCR擴(kuò)增：采用ABI 7500 PCR 系統(tǒng)及SYBRgreen I染料法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，采用β-actin作為內(nèi)參照。所用引物由試劑公司設(shè)計(jì)合成，PCR條件設(shè)置:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,61 ℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1胎盤(pán)組織中miRNA-21表達(dá)情況 子癇前期組胎盤(pán)中miRNA-21相對(duì)表達(dá)量為0.155±0.01，正常對(duì)照組為0.087±0.01，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.360,P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 2組胎盤(pán)組織中miRNA-21相對(duì)表達(dá)量散點(diǎn)圖

2.2胎盤(pán)組織中IL-17、IL-21、RORc以及HLA-G表達(dá)情況 子癇前期組胎盤(pán)組織中IL-17和IL-21相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)，RORc和HLA-G相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)，見(jiàn)表1，2組各指標(biāo)相對(duì)表達(dá)量散點(diǎn)圖見(jiàn)圖2～5。

表1 2組產(chǎn)婦胎盤(pán)組織中IL-17、IL-21、RORc以及HLA-G表達(dá)情況

圖2 2組胎盤(pán)組織中IL-17相對(duì)表達(dá)量散點(diǎn)圖

圖3 2組胎盤(pán)組織中IL-21相對(duì)表達(dá)量散點(diǎn)圖

圖4 2組胎盤(pán)組織中RORc相對(duì)表達(dá)量散點(diǎn)圖

圖5 2組胎盤(pán)組織中HLA-G相對(duì)表達(dá)量散點(diǎn)圖

2.3miRNA-21、IL-17、IL-21、RORc及HLA-G表達(dá)的關(guān)系 2組產(chǎn)婦胎盤(pán)組織中IL-17、IL-21及miRNA-21表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.490 6，0.471 3，0.413 6，P<0.05),2組RORc和HLA-G表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.380 9，-0.409 3，P<0.05)。

3 討 論

子癇前期是正常孕婦在妊娠20周后出現(xiàn)，并伴隨血管內(nèi)皮發(fā)生功能障礙和血管痙攣的一類(lèi)免疫系統(tǒng)疾病。子癇前期在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率高達(dá)4%～18%，同時(shí)它也成為發(fā)展中國(guó)家造成死產(chǎn)以及早產(chǎn)兒死亡的第二大元兇[7]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道Th17細(xì)胞參與了子癇前期的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[8]，也有文獻(xiàn)提及miRNA家族可能促進(jìn)子癇前期的發(fā)病[9]，但這三者之間的聯(lián)系以及子癇前期發(fā)病的確切機(jī)制尚未完全闡明。故本研究通過(guò)對(duì)miRNA-21以及Th17相關(guān)因子相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)來(lái)探索三者間的關(guān)系。

miRNA家族是一類(lèi)長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過(guò)與靶基因mRNA的3’端非翻譯去相互作用，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而廣泛地作用于生長(zhǎng)發(fā)育、衰老凋亡、腫瘤發(fā)生、免疫應(yīng)答等各種生物學(xué)過(guò)程[10]。本研究發(fā)現(xiàn)子癇前期組孕產(chǎn)婦的胎盤(pán)血中miRNA-21的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組，提示miRNA-21與子癇前期的發(fā)病成正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明miRNA-21在子癇前期的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用。

最近有研究表明，Th17細(xì)胞可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥等的發(fā)生發(fā)展，其可以通過(guò)產(chǎn)生IL-17、IL-6、IL-21和其他炎癥遞質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)促炎反應(yīng)過(guò)程[11]。另有報(bào)道稱(chēng)，除了Th1/Th2之間的平衡，Th17，Treg細(xì)胞之間的比例失衡也會(huì)導(dǎo)致子癇的發(fā)生[12]。本研究結(jié)果顯示子癇前期組產(chǎn)婦的胎盤(pán)組織中IL-17和IL-21的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，提示子癇前期產(chǎn)婦體內(nèi)Th17細(xì)胞曾被激活，導(dǎo)致Th17，Treg細(xì)胞之間的比例失衡，IL-17和IL-21釋放增加。

RORc1或RORc2屬于RTK家族，是被廣泛研究的非典型Wnt受體成員，和人類(lèi)幾種疾病息息相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)RORc1或RORc2的缺失是致命的，將會(huì)導(dǎo)致骨骼、肺臟和心臟的發(fā)育缺陷[9]。HLA-G首次在母胎界面的滋養(yǎng)層細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，在病毒性感染和幾種自身免疫性疾病中也會(huì)特異性表達(dá)。有研究表明，HLA-G可以通過(guò)激活細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞從而防止角化細(xì)胞的破壞[13]；而且其在胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞中高度表達(dá)，在孕期調(diào)節(jié)免疫耐受和繼續(xù)妊娠方面發(fā)揮著重要的作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)子癇前期組產(chǎn)婦胎盤(pán)組織中RORc和HLA-G的相對(duì)表達(dá)量都低于正常對(duì)照組，表明子癇前期產(chǎn)婦體內(nèi)調(diào)控RORc和HLA-G的基因的穩(wěn)定性降低，產(chǎn)生基因沉默影響轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致RORc和HLA-G表達(dá)減少，從而導(dǎo)致了一系列子癇前期患者現(xiàn)有的表現(xiàn)如早產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限、圍生期胎兒死亡等。

綜上所述，子癇前期的發(fā)病可能是激活了miRNA-21的過(guò)表達(dá)，促使Th17細(xì)胞激活，從而導(dǎo)致IL17和IL21分泌增加，引起全身免疫性炎癥反應(yīng)。同時(shí)可能由于miRNA-21在子癇前期患者胎盤(pán)組織中表達(dá)升高,從而使得RORc mRNA和HLA-G mRNA的穩(wěn)定性降低，產(chǎn)生基因沉默影響轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致RORc和HLA-G表達(dá)減少，有待試驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。目前人們對(duì)于子癇前期的研究還處于起步階段，深入研究子癇前期的生理、病理變化以及其發(fā)病機(jī)制，對(duì)日后子癇前期的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療具有重大的理論和實(shí)際意義。

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Expression of miRNA-21 and correlation factors associated with Th17 cells and analysis their relations in placenta of patients with preeclampsia

ZHU Li1, ZHU Huaying2, XU Lingdi2, CHEN Tingmei2, LIU Songping2

(1.Medical College of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu, China; 2.The Fourth People’s Hospital of Jiangsu University/Zhenjiang Maternal and Child Care Hospital, Zhenjiang 212000, Jiangsu, China)

Objective It is to study the predictive value of IL-17, IL-21, RORc, HLA-G associated with Th17 cells and micro-ribonucleic acid-21(miRNA-21) in placenta on the pathogenesis of preeclampsia. Methods 20 pregnant women with preeclampsia with 33-37weeks’ gestation undergoing cesarean section were selected as preeclampsia group, 20 healthy pregnant women with more than 38 weeks’ gestation volunteered for cesarean section as normal control group. Expression of IL-17,IL-21,RORc ,HLA-G and miRNA-21 in placenta were measured by Polymerase Chain Reaction (PCR). Results The relative expressions of IL-17 and IL-21 in placenta were higher, while that of RORc and HLA-G were lower in preeclampsia group than those in normal control group (P<0.01 or <0.05).The relative expressions of IL-17, IL-21 and miRNA-21 in placenta in both groups were positively correlated,.the relative expressions of RORc and HLA-G in placenta were negatively correlated. Conclusion We found that the relative expressions of miRNA-21in placenta was more higher in preeclampsia group.Higher expression of miRNA-21 may make Th17 cells activated, then increased IL-17 and IL-21 secretion. At the same time ,higher expression of miRNA-21 may influence the RORc mRNA and HLA-G mRNA stability, then reduced the expression of RORc and HLA-G.

preeclampsia; miRNA-21; correlation factors associated with Th17 cells

朱麗，女，在讀研究生，研究方向?yàn)橛跋襻t(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)。

朱華英，E-mail:zhuhuaying1@163.com

江蘇省衛(wèi)生廳重大項(xiàng)目(H201249)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.29.001

R0714.245

A

1008-8849(2015)29-3193-04

2015-05-10