趙學(xué)濤，楊從容，任曉亮，李 明，解曉元，巨紅妹

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

懸浮紅細(xì)胞對(duì)異體T淋巴細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

趙學(xué)濤，楊從容，任曉亮，李 明，解曉元，巨紅妹

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

目的體外觀察懸浮紅細(xì)胞對(duì)異體T淋巴細(xì)胞增殖的影響并探討其可能機(jī)制。方法采用Ficoll低密度離心法和免疫磁珠法從人外周血中分離純化出CD3+T淋巴細(xì)胞，給予CD3/CD28抗體共刺激，并分別與異體非去白懸浮紅細(xì)胞或去白懸浮紅細(xì)胞混合培養(yǎng)72h。采用H3-胸腺嘧啶核苷摻入法檢測(cè)各組T淋巴細(xì)胞增殖的情況。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組培養(yǎng)體系中CD4+/CD8+及CD4+CD25+/CD4+細(xì)胞亞群比例。結(jié)果與陰性對(duì)照組(細(xì)胞培養(yǎng)液組)對(duì)比，非去白懸浮紅細(xì)胞組和去白懸浮紅細(xì)胞組T淋巴細(xì)胞增殖明顯受到抑制，CD4+/CD8+細(xì)胞亞群比例下降(P<0.01)，而CD4+CD25+/CD4+細(xì)胞亞群比例明顯增加(P<0.01)。與去白懸浮紅細(xì)胞相比，非去白懸浮紅細(xì)胞的作用更明顯(P<0.05)。結(jié)論懸浮紅細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例抑制異體T淋巴細(xì)胞增殖，而這種作用可能主要取決于懸浮紅細(xì)胞內(nèi)殘留的白細(xì)胞。

懸浮紅細(xì)胞；異體T淋巴細(xì)胞；CD4+/CD8+細(xì)胞亞群；CD4+CD25+Treg

臨床研究證實(shí)，同種異體血輸注(allogenic blood transfusion，ABT)可以誘導(dǎo)受血者產(chǎn)生免疫抑制，并由此可增加術(shù)后感染率和惡性腫瘤的復(fù)發(fā)率[1-2]。目前，這種輸血相關(guān)免疫抑制的確切機(jī)制仍不清楚。CD4+CD25+T細(xì)胞是最近才被人們認(rèn)識(shí)的一類免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)，高表達(dá)CD25和CD4，參與機(jī)體的免疫抑制和免疫無(wú)能。成分血中何種因素引起了免疫抑制，以及這種免疫抑制機(jī)制是否與CD4+CD25+Treg有關(guān)目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以懸浮紅細(xì)胞為研究對(duì)象，探討其中哪種成分可影響異體T淋巴細(xì)胞的增殖，并從CD4+CD25+Treg角度進(jìn)一步分析其可能的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自挪威AXIS SHIELD公司；CD3+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒購(gòu)自Miltenyi Biotec公司；抗CD3單克隆抗體、抗CD28單克隆抗體購(gòu)自Becton Dickinson公司；抗CD4-FITC、抗CD8-PE和抗CD25-PE熒光抗體均購(gòu)自eBioscience公司。

1.2血液樣品 外周全血取自健康自愿獻(xiàn)血者。去白懸浮紅細(xì)胞和非去白懸浮紅細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院輸血科提供。

1.3方法

1.3.1外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離 取無(wú)菌肝素鈉抗凝全血，用生理鹽水將其等倍稀釋，稀釋后的血標(biāo)本緩慢加入人淋巴細(xì)胞分離液液面上，比例為1∶1，4℃下2000r/min離心15min，輕輕吸取第2層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層，以PBS液洗滌2次，所得白色細(xì)胞沉淀即為PBMC，計(jì)數(shù)細(xì)胞后備用。

1.3.2磁珠分離純化T淋巴細(xì)胞 取1×107個(gè)PBMC，用PBS調(diào)整細(xì)胞溶液體積至50μL；加入CD3抗體磁珠溶液10μL，混勻，4～8℃孵育20min；加入150μL PBS洗滌細(xì)胞，4℃下3000r/min離心10min；收集細(xì)胞，重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞懸液體積至500μL；將分選柱固定于磁柱上，用500μL PBS預(yù)濕分選柱；將結(jié)合磁珠的細(xì)胞懸液加入分選柱內(nèi)，洗滌3次，每次1000μL PBS；將分選柱從磁柱分開(kāi)，加入1000μL PBS，收集流出液，4℃下3000r/min離心10min，所得沉淀物即為富集的T淋巴細(xì)胞，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)備用。

1.3.3混合培養(yǎng) 取上述T淋巴細(xì)胞懸液加入到含有CD3抗體(2μg/mL)和CD28抗體(5μg/mL)包被的96孔板中[1×105個(gè)/(100μL·孔)]，然后分為3組：A組于上述T細(xì)胞懸液中加入細(xì)胞培養(yǎng)液100μL/孔作為陰性對(duì)照，B組加入非去白懸浮紅細(xì)胞2×105個(gè)/(100μL·孔)，C組加入去白懸浮紅細(xì)胞2×105個(gè)/(100μL·孔)，每組終體積200μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用H3-胸腺嘧啶核苷摻入(3H-TdR)法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖情況。將上述各組細(xì)胞混合培養(yǎng)72h，在終止培養(yǎng)前16h每孔加入3H-TdR 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)16h，用多頭細(xì)胞收集器將每孔培養(yǎng)物分別吸收于直徑24mm的玻璃纖維濾紙上，抽氣過(guò)濾并用蒸餾水充分洗滌。將濾紙片放在80℃烘干約1h，然后將濾紙片浸入加了10mL脂溶性閃爍液的閃爍杯中，置于β-液體閃爍記數(shù)儀中測(cè)定每個(gè)樣品的每分鐘脈沖數(shù)(cpm值)。

1.3.5CD4+/CD8+細(xì)胞亞群比例檢測(cè) 混合培養(yǎng)72h后，收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整每管細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)，分別加入抗CD4-PE和抗CD8-FITC熒光抗體及相應(yīng)同型對(duì)照，4℃避光孵育30min，用PBS洗滌3次，將細(xì)胞重懸至200μL，采用BD LSRⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.6CD4+CD25+/CD4+細(xì)胞亞群比例檢測(cè) 混合培養(yǎng)72h后，收集各組細(xì)胞，調(diào)整每管細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)，分別加入抗小鼠CD25+-FITC熒光抗體、抗小鼠CD4+-PE熒光抗體及相應(yīng)同型對(duì)照，冰上孵育30min，加入2% FBS-PBS液洗滌去除未結(jié)合抗體，1300r/min離心6min，洗2次，將細(xì)胞重懸至200μL，采用BD LSRⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1各組異體T淋巴細(xì)胞增殖情況 3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)顯示，A、B、C組T淋巴細(xì)胞數(shù)分別為2718±63.20，1584±46.88，1878±82.35，與A組相比，B組和C組均顯著地抑制了CD3/CD28刺激引起的T淋巴細(xì)胞增殖(P均<0.01)，且B組較C組抑制作用更明顯(P<0.05)。

2.2各組CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比例比較 流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示：與A組相比，B組和C組CD4+及CD4+/CD8+比例均明顯降低(P均<0.01)，且B組低于C組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群情況比較

注：①與A組比較，P<0.01；②與C組比較，P<0.05。

2.3各組CD4+CD25+/CD4+比例比較 流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示：B組和C組CD4+CD25/CD4+比例均高于A組(P均<0.01)，B組高于C組(P<0.05)。見(jiàn)圖1～3。

圖1 A組CD4+CD25+/CD4+流式細(xì)胞圖

圖2 B組CD4+CD25+/CD4+流式細(xì)胞圖

圖3 C組CD4+CD25+/CD4+流式細(xì)胞圖

3 討 論

同種異體輸血發(fā)揮臨床治療作用的同時(shí)，也會(huì)并發(fā)免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如惡性腫瘤復(fù)發(fā)率增加、術(shù)后感染率上升、慢性病毒感染急性發(fā)作等，這些輸血引起的一系列涉及免疫調(diào)節(jié)的反應(yīng)稱為輸血相關(guān)性免疫調(diào)節(jié)(transfusion-associated immunomodulation,TRIM)[3]。目前，引起TRIM的具體機(jī)制仍不明確。Vamvalas等[4]認(rèn)為白細(xì)胞(WBC)、血小板分泌并隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)而蓄積的可溶性生物反應(yīng)遞質(zhì)可能是引起TRIM的機(jī)制。Dzik等[5]也指出TRIM非特異性效應(yīng)的產(chǎn)生可能是血液制品中的WBC引起的。如果TRIM效應(yīng)確實(shí)由WBC源性可溶性分子介導(dǎo)產(chǎn)生，那么實(shí)行血制品儲(chǔ)存前WBC濾過(guò)技術(shù)應(yīng)該可以消除其相關(guān)的有害臨床效應(yīng)，因?yàn)樵诳扇苄苑肿俞尫诺窖破分熬鸵褜BC濾除。為此本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)比較了去白懸浮紅細(xì)胞和非去白懸浮紅細(xì)胞與異體T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)T細(xì)胞增殖及CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群比例的影響，結(jié)果顯示：懸浮紅細(xì)胞可抑制異體T淋巴細(xì)胞的增殖，并降低CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比例，而非去白懸浮紅細(xì)胞組的作用更明顯。CD4+/CD8+比值為一重要的免疫指標(biāo)，正常情況下相對(duì)恒定，此比值顯著降低常視為疾病嚴(yán)重和預(yù)后不良。本研究結(jié)果提示去除懸浮紅細(xì)胞內(nèi)殘留的WBC可能會(huì)減輕但無(wú)法消除對(duì)異體T淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用；同時(shí)也提示，紅細(xì)胞懸液中除了WBC還有其他因素引起TRIM。國(guó)外早期一些臨床隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示，輸注未去WBC的紅細(xì)胞懸液會(huì)使術(shù)后感染率升高，而在歐美國(guó)家在臨床上廣泛實(shí)行去WBC的紅細(xì)胞懸液輸注政策后，研究者們將大量去WBC和未去WBC的病例做了回顧性的調(diào)查，分析結(jié)果顯示除心臟手術(shù)外，去WBC的血液制品并未降低術(shù)后感染率和術(shù)后病死率[6-8]，與本研究結(jié)果不符，分析原因可能是懸浮紅細(xì)胞內(nèi)殘留的WBC較少，輸入體內(nèi)后被稀釋，對(duì)異體T淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用不占主導(dǎo)地位，因此去白血液制品對(duì)術(shù)后感染率和術(shù)后病死率影響不明顯，在體內(nèi)環(huán)境中對(duì)異體的免疫抑制起主導(dǎo)作用的可能是血液制品中其他因素。既往研究發(fā)現(xiàn)，在儲(chǔ)存期間紅細(xì)胞本身的生化功能及形態(tài)也會(huì)發(fā)生變化，細(xì)胞形態(tài)由圓盤狀向球狀改變，紅細(xì)胞懸液中的ATP、2，3-DPG、磷脂均會(huì)減少，細(xì)胞浮密度、滲透溶血的易感性等會(huì)增加[9]，這些變化都有可能是引起TRIM的原因。這也是本課題組下一步研究的重點(diǎn)。

異體血輸注是通過(guò)何種途徑引起免疫抑制目前尚不明確，CD4+CD25+Treg細(xì)胞具有抑制T細(xì)胞增殖活化的作用早已得到公認(rèn)，于是本研究進(jìn)一步檢測(cè)了CD4+T細(xì)胞中的調(diào)節(jié)性細(xì)胞亞群CD4+CD25+細(xì)胞是否成比例地增加。結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比，兩懸浮紅細(xì)胞組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例明顯增加，而與去白懸浮紅細(xì)胞相比，非去白懸浮紅細(xì)胞的這種作用更明顯一些。提示懸浮紅細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例起到免疫抑制作用，在體外環(huán)境下這種作用主要依賴于懸浮紅細(xì)胞內(nèi)殘留的WBC。

綜上所述，去白懸浮紅細(xì)胞和非去白懸浮紅細(xì)胞均可抑制異體T細(xì)胞增殖，而在體外環(huán)境下非去白懸浮紅細(xì)胞的抑制作用更加明顯，并且首次證實(shí)這種抑制作用與上調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞表達(dá)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)提示除WBC外，懸浮紅細(xì)胞中還存在其他因素介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫抑制，在臨床用血中，去白懸浮紅細(xì)胞輸注可能并不能避免TRIM的發(fā)生，但具體是何種成分起作用還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of red blood suspension on proliferation of allogene T lymphocytes and it’s mechanisms

ZHAO Xuetao, YANG Congrong, REN Xiaoliang, LI Ming, XIE Xiaoyuan, JU Hongmei

(The Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011,Hebei,China)

Objective It is to explore the effect of red blood suspension on proliferation of allogene T lymphocytes in vitro and to explore its possible mechanisms.Methods CD3+T cells from human peripheral blood were isolated and purified by Ficoll density gradient centrifugation combined with adherence MACS selection.Purifed human T cells were stimulated with anti-CD3/anti-CD28and then exposed to allogene leukocyte-containing red blood suspension or leukocyte-depleted red blood suspension for 72h.T cell proliferation was determined by 3H-thymidine.The ratios of CD4+/CD8+and CD4+CD25+/CD4+subgroup from different co-culture systems were detected by flow cytometry.Results Compared with that of negative group (culture media), the proliferations of allogene T lymphocytes were greatly suppressed，the ratio of CD4+/CD8+subgroup decreased, but the ratio of CD4+CD25+/CD4+subgroup increased in leukocyte-containing group and leukocyte-depleted group (P<0.01), while the influences were more obvious in leukocyte-containing group (P<0.05).Conclusion Red blood suspension could suppress significantly allogene T cell proliferation by up regulation of CD4+CD25+regulatory T (Treg) cells.This regulation, to a large extent, depending on the the remaining white blood cells in red blood suspension.

red blood suspension; allogene T lymphocytes; CD4+/CD8+subgroup; CD4+CD25+Treg cells

趙學(xué)濤，男，主管技師，博士，從事輸血與腫瘤免疫研究工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.19.006

R0457.13

A

1008-8849(2015)19-2071-03

2015-01-20